Summary
이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.
Abstract
Drosophila에서 기계적 고치에 대한 출판 된 소명은 행동의 변수 평가로 이어졌습니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 애벌레, 맞춤형 금속 니켈 티타늄 합금 (nitinol) 필라멘트로 사용하기 위해 제작했습니다. 이러한 기계식 프로브는 기계식 고드름을 측정하기 위해 척추동물에 사용되는 폰 프레이 필라멘트와 유사합니다. 여기에서, 우리는 이 기계적인 프로브를 만들고 보정하는 방법 및 subthreshold (무해하거나 비 유해한 범위)에서 suprathreshold (낮은 내지 높은 유해 범위) 자극에 전체 행동 복용량 반응을 생성하는 방법을 보여줍니다. 프로브의 유용성을 입증하기 위해 드로소필라 애벌레에서 조직 손상 유발 과민증을 조사했습니다. 기계적 동종증 (일반적으로 무해한 기계적 자극에 과민성) 및 과민증 (유해 한 기계적 자극에 과장 된 응답성) 아직 Drosophila 애벌레에 설립 되지 않았습니다. 일반적으로 무해한 또는 일반적으로 역경 행동을 유도하는 프로브인 기계프로브를 사용하여, 우리는 Drosophila 애벌레가 조직 손상 후에 기계적인 과민증(알로디아 및 hyperalgesia 둘 다)을 개발한다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리가 여기에서 설명하는 기계적인 프로브 및 분석은 기계과민증의 근본적인 분자/유전 기계장치를 해부하는 중요한 공구일 것입니다.
Introduction
드로소필라 유충은 다른 유해 자극에 노출될 때 특징적인 역경압 거동을 나타낸다: 열1,기계2,및화학3. 이 동작은 정상적인 운동과 분명히 다릅니다. 여기서 우리는 기계적 고드름과 기계적 감도를 평가하는 데 사용할 수있는 향상된 기계적 분석서를 설명합니다.
최근 연구에서, 우리는 nitinol 와이어 4를 사용하여 폰 프레이 같은 필라멘트를조작했다. 서로 다른 힘과 압력을 가하는 프로브는 각 프로브를 형성하는 니티놀 와이어의 길이와 직경을 변화시킴으로써 만들어졌습니다. 기계 프로브는 보정되었고 측정된 힘 값(밀리뉴턴, mN)은 각 프로브4의팁 영역에 기초하여 압력(kilopascal, kPa)으로 변환되었다. 기계 프로브의 사용자 정의 제작은 원칙적으로 기계적 과민증을 연구하는 데 도움이 될 수있는 섭문턱 (225 kPa ~ 5318 kPa) 압력에 하위 임계 값 (≤200 kPa)을 생성 할 수 있었습니다. 이러한 향상된 기계식 폰 프레이와 같은 필라멘트를 사용하여, 우리는 압력4,이전에 검사 된 힘2,5,6 Drosophila 애벌레에서 회선 행동 반응과 더 일관되게 상관 관계가 있음을 보여 주었다. 여기에서 기술된 향상된 기계 분석법은 또한 파리와쥐에있는 기계적 고드름을 조절하는 통로를 신호하는 보존된 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)관련 수용체 티로신 키나아제 4를 확인하는 데 도움이 되었다.
기계적 알로디니아 및 과민증, 과민증의 두 가지 양식은 열 (열 및 감기) 및 화학 감각 양식3,7,8,9,10에비해 드로소필라 애벌레에서 상대적으로 저술된다. 이것은 아마도 무해한 자극에서 높은 유해범위2,5,6에걸쳐 특정 기계적 프로브의 부족 때문일 것이다. Drosophila 애벌레 경험 조직 손상3,7 후 전형적인 역경 압연 거동을 유도 하는 일반적으로 무해한자극은알로디니아로 지칭된다. 전형적으로 유해한 자극에 대한 과장된 압연 반응은 고간증7로알려져 있다. 유해 자극은 조직 손상을 유도하고 nociceptors(11)를활성화할 수 있는 것으로 정의됩니다. 드로소필라 애벌레에 전달된 유해자극은 장벽 표피, 말초 암각 감각 뉴런3,4,7또는둘 다 손상이다.
이 기사에서는 Drosophila 애벌레에 적합한 폰 프레이와 같은 기계 프로브를 맞춤 제작하고 교정하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 Drosophila 애벌레에서 기계적 nociceptive 반응을 분석하기 위해 이러한 프로브를 사용하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 또한 기계적 과민증의 존재를 입증하기 위해 그들을 사용하여 이러한 프로브의 유용성을 보여줍니다, 알로디니아와 과뇌증, Drosophila 애벌레에서 조직 손상에 따라 (대표 결과참조).
Protocol
1. 기계 프로브 건설
- 각 니티놀 필라멘트(도1B)를긴 축에 수직으로 자르고, 작은 와이어커터(도 1C)를사용하여 지정된길이(도 1M-N)로절단한다. 필라멘트는 세 가지 다른 미리 설정된직경(그림 1B)으로제공됩니다.
참고: 여기에 지정된 길이는 마운트 를 건설하기 위해 유사한 프로토콜을 사용하여 표시된 대략적인 압력을 달성하기 위한 가이드입니다. 궁극적으로 필라멘트 절단 길이와 마운트의 구멍 깊이에 관계없이 정확한 힘/압력 값을 얻기 위해 균형을 측정/보정해야 합니다. - 스테레오 현미경의 밑에 필라멘트의 끝을 검사하여 유충의 피부에 조직 손상을 일으키고 교정을 방해할 수 있기 때문에 날카롭거나 불규칙한 가장자리가 남아 있지 않도록하십시오.
- 날카로운 요철이 지속되지 않는 때까지 선명한 돌을 사용하여 기계 프로브의 날카로운 가장자리를 수동으로 부드럽게합니다(도1D).
- 피하 바늘을 사용하여 나무 아이스캔디스틱(도 1E)의끝을 향해 구멍을 만드십시오(재료표 참조). 적어도 중반에서 아이스캔디스틱(도 1E)의높이를 통해 바늘을 삽입한다. 이렇게 하면 니티놀 필라멘트를 삽입하기 위한 챔버가 만들어집니다.
- 나무 접착제를 단일 니티놀 필라멘트(도1F)에바르고 접착제 코팅 필라멘트를 바늘 슬롯에 삽입합니다(도1G). ~5시간 동안 건조시키십시오.
- 기계 프로브가 구부러질 때까지 스케일에 대해 눌러 각 기계 프로브를 교정합니다(그림1H-L). 이것은 그램에 기록 될 수 있는 최대 힘의 포인트. 필라멘트 직경(사전 설정) 및 길이(사용자 결정)에 따라 전체 범위의 힘과 압력을 생성할 수 있습니다.
- 1.6단계에서 기록된 질량을 밀리뉴턴(mN)으로 변환하여 수식 f = ma(힘은 중력 가속을 곱한 질량과 동일). f: 힘; m: 질량; a: 중력 가속(9.8m/s2)(그림 1M).
- 마지막으로, 계산된 힘을 킬로파스칼(kPa)에서 압력(force/area)으로 변환하여 측정된 힘을 필라멘트팁(도 1M)의표면적으로 나눕니다. 면적을 계산하려면 다른 니티놀 필라멘트의 직경을 인치(0.04", 0.06", 0.08")에서 센티미터로 변환합니다. 그런 다음 πr2(여기서 r = 니티놀 필라멘트 반경)이 영역을 결정합니다(그림 1M참조). 서로 다른 직경과 길이의 필라멘트를 사용하여 여러 프로브를 준비하면 드로소필라 애벌레에 대한 반응 범위에 걸친 전체 세트가 생성됩니다(도 1N에도시된 샘플 세트).
참고: 적어도 3~4주마다 각 기계 프로브를 확인합니다. 압력이 원래 측정값에서 ± 3% 이상 이탈하면 새로운 기계 프로브를 조작해야 합니다.
2. 애벌레의 준비
- 25°C인큐베이터에서 표준 식품에 대한 유전자 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP(감각 뉴런에 손상을 시각화하기 위해)를 함유한 애벌레 자손 또는 애벌레를 올레이합니다. 일반적으로 주식은 일상적으로 18 °C에서 유지되지만 부모와 애벌레 자손은 실험을위한 표준 옥수수 밀 식품에서 25 °C에서 사육됩니다.
참고: 성인 파리 (5 명의 수컷과 10 명의 암컷, 1:2 비율)는 약 24 시간 동안 계란 누워를 허용하기 위해 비행 유리병에 보관됩니다. 계란 누워 후 시간 (AEL) 성인이 제거 될 때에서 시작. - 세 번째 인스타 애벌레를 수집, 계란 누워의 약 96 h 후, 부드럽게 애벌레를 포함하는 부드러운 플라이 식품에 수돗물을 분출하여. 음식을 떠났거나 전방 또는 후방 첨탑을 상회한 방황하는 애벌레는 이 분석서에 너무 크거나 오래되었습니다. 두 번째 인스타 애벌레(길이가 4mm 미만)가 너무 작습니다.
- 부드러운 플라이 푸드의 내용물을 깨끗한 표준 크기의 페트리 접시(100mm x 15mm)에 붓습니다.
- 집게를 사용하여, 중간 세 번째 인스타, 중간 크기, 애벌레 (그림 2A참조) 작은 (두 번째 인스타 및 초기 세 번째 인스타) 또는 더 큰 (늦은 또는 방황 세 번째 인스타) 애벌레. 애벌레에 대한 조직 손상을 피하기 위해 집게로 부드럽게 조작하는 것이 좋습니다.
참고: 집게를 사용하는 전송은 주로 물 장력에 기반을 두고 있으며 포셉의 블레이드로 애벌레에 압력을 가하지 않습니다. 유충 기동을 위한 집게의 사용에 대한 대안은 부드러운 페인트 브러시입니다. 두 도구 모두, 사용자는 행동 측정을 복잡하게 할 수있는 의도하지 않은 조직 손상을 일으키지 않도록 동물을 옮기는 연습을해야합니다. - 집게를 사용하여 3분의 1 중반 의 성유를 실온에서 물로 촉촉한 플라이 푸드의 작은 플러그가 들어있는 작은 페트리 접시(30mm x 15mm)로 옮직합니다. 실험이 수행 될 때까지 작은 페트리 접시에 애벌레를 유지하지만, 20 분 이상하지 않습니다.
참고: 일반적으로 20-30 개의 애벌레를 식품 플러그로 옮기면 행동 적 인 에세이20 분동안 적절한 숫자를 줄 수 있습니다.
3. 기계적 고치 분석
- 밝은 필드 스테레오 현미경 아래에 검은 색 또는 어두운 비닐의 얇은 패드에 중간 세 번째 인스타 애벌레 (집게사용)를 놓습니다. 어두운 색상은 애벌레의 시각화를 향상시키는 대비를 제공합니다. 사용자가 애벌레를 만지거나 다치게하지 않고 정렬할 수 있기 때문에 자유롭게 움직일 수 있는 다크 비닐 조각을 갖는 것이 바람직하다.
- 현미경 객관적인 렌즈와 검은 색 또는 어두운 비닐 패드 사이에 광섬유 조명을 넣어; 이것은 애벌레를 보는 것에 대한 적당한 높은 대비 조명을 허용할 것입니다.
- 패드로 옮겨간 후 정상적인 운동을 나타내지 않는 애벌레를 폐기하십시오. 이들은 일반적인 발각 행동 반응을 방해할 수 있습니다. 일반 운동의 경우 비디오 1을참조하십시오.
- 종이 타월, 유충을 둘러싼 여분의 물을 사용하여 닦아 비닐 패드에 떠있는 유충을 일으킬 수 있습니다.
- 어두운 비닐 패드를 이동하여 애벌레를 오리엔테이션. 유충의 머리/입은 왼손잡이인 경우 왼쪽을 가리고 왼손잡이인 경우 그 반대의 경우도 마찬가지입니다(그림2A-B).
- 선택한 기계 프로브를 일반적으로 1-2s에 적용하여 약 복부 세그먼트 A8(그림 2B참조)에서 애벌레의 후방 등쪽측에 프로브가 구부러지고 이전에 측정된 압력량(도2C)을유도합니다. 프로브가 애벌레의 등대 표면에 대 한 누르고 프로브 접촉 지점에서 기본 패드로 애벌레를 압축 하는 것이 중요 하다.
참고: 니티놀 필라멘트의 끝과 등쪽 표피 사이의 접촉 지점에서, 2,300 kPa보다 낮은 프로브는 주로 큐티클과 기본 조직을 관통하지 않고 구부립니다. 이러한 프로브는 거의 애벌레사망에영향을 미치지 않는다 4 . 더 높은 압력 (>5,000 kPa)에서 프로브는 구부러지고 때로는 큐티클과 기본 조직에 침투합니다. 애벌레의 구멍을 뚫으면 애벌레 생존4를 손상시키고, 관찰되면, 이러한 애벌레는 일반적으로 행동 분석에서 버려지게 된다. - 각 애벌레에 대한 행동 반응을 기록합니다. 포지티브 향응(Video2)은애벌레가 3s 이내에 신체의 축을 따라 360°의 완전한 롤을 표시하는 경우 표시됩니다. 다른 응답(회전 시도, 빠른 크롤링 및 흔들림)은 이 분석의 목적에 대해 부정적인 것으로 간주됩니다.
참고: 서브임계값 기계적 자극(200kPa)으로 자극된 애벌레는 전형적인 단각 반응 또는 롤링 반응을 유도하지않았다(비디오 3). 일부 애벌레는 이동 방향의 변화와 같은 빠른 전방 또는 가벼운 터치 응답을 나타냈다. - 애벌레를 버리고 다음 단계를 3.1에서 3.7까지 반복하여 분석할 준비를 하십시오.
- 반복 단계 3.1-3.7 유충의 원하는 수에 도달 할 때까지 (n = 10 애벌레의 3 ~ 6 세트는 각 프로브에 대해 여기에 사용되었다).
참고: 저압 기계 프로브(174-462 kPa)를 사용하는 경우 분석은 애벌레당 더 많은 시간이 소요됩니다. 이것은 더 긴 필라멘트의 끝이 더 진동하기 때문에 A8 세그먼트의 중앙에 애벌레를 찌르기가 더 어려워집니다. 이러한 프로브에는 연습이 필요합니다.
4. 신경 형태학을 평가하는 공초점 현미경 검사법
- 이전에 nitinol 필라멘트로 자극된 애벌레(유전자형 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP)를 코플린 항아리 내부에 에칭 챔버에 10mL 비커로 담근 면공을 들고 다이일에테르1mL로 담근 다이틸에테르를 넣습니다. 애벌레가 챔버에 5분 동안 앉게 하십시오.
참고: 에칭화를 위한 상세한 프로토콜은 우리 그룹12에의해 간행된 이전 연구 결과에서 제공됩니다 . - 애벌레를 에테르화 챔버에서 작은 페트리 접시에 부드럽게 헹구십시오.
- 하나의 현미경 슬라이드, 두 개의 작은 커버립 (22 x 22 mm), 하나의 긴 커버 슬립 (22 x 54mm)을 준비하십시오 (재료표참조).
- 작은 에테르 방울추가: 오일 용액 (에틸 에테르의 1:5 비율 할로카본 오일 솔루션, 재료의 표참조) 슬라이드의 양쪽 끝에 작은 커버립을 배치 작은 방울 의 위에 놓습니다. 이 배열은 애벌레가 맞을 수있는 작은 공간 간격을 만듭니다.
참고: 미끄러질 어려울 때까지 현미경 슬라이드에 대해 작은 커버립을 누릅니다. - 현미경 슬라이드의 중간에 에테르 : 오일 용액의 일부 방울을 추가한 다음 포셉을 사용하여 현미경 슬라이드의 중앙에 애벌레를 놓습니다 (작은 커버립 사이). 유충의 전방 축이 슬라이드의 짧은 면과 평행하고 등쪽 측이 위를 향하고 있는지 확인하십시오.
- 애벌레 위에 긴 커버 슬립과 두 개의 작은 커버립으로 애벌레를 덮습니다.
참고: 애벌레가 거의 평평해질 때까지 긴 커버슬립을 넉넉하게 누릅니다. - 공초점 현미경을 이용한 애벌레의 이미지 세그먼트 A8(재료표참조) 레이저 파장(488)을 이용하여(GFP).
참고: 에테르를 통한 마취가 빠르게 퇴색하고 (~5-10분) 유충이 깨어나서 이동하여 추가 이미징을 복잡하게 만들 것이기 때문에 애벌레를 즉시 이미지화합니다. - 1x 줌에서 20배 숫자 조리개(NA) 0.7 건식 객관적렌즈를 사용하여 1024 x 1024 픽셀의 해상도로 Z 스택 이미지를 캡처하고 1.5 μm의 스텝 크기입니다.
5. 조직 손상의 양
- 4.8절에서 Z 시리즈 스택 이미지를 단일 Z 프로젝션(서로 다른 초점 평면에서 촬영한 여러 이미지를 단일 복합 이미지로 병합)으로 수집하고 변환합니다. 이는 시판되는 소프트웨어(예: 올림푸스 플루오뷰) 또는 동등한 오픈 소스 플랫폼(예: 피지/이미지 J. TIFF 형식으로 단일 Z 프로젝션 저장)을 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 이미지 분석 프로그램 피지 /ImageJ를 엽니 다.
- 메뉴 표시줄에서 파일을클릭하고 표시된 창에서 열기를 선택합니다.
- 분석할 TIFF 형식으로 저장된 저장된 단일 이미지 프로젝션을 선택합니다.
- 메뉴 표시줄에서 편집을클릭하고 표시된 창에서 반전 옵션을 선택합니다.
- 메뉴 표시줄에서 이미지를클릭한 다음 표시된창에서 조정을선택하고 마지막으로 밝기/대비 옵션을 선택합니다.
- 도구 모음에서 Freehand Shape 옵션을 선택하여 간격 영역(있는 경우)을 측정합니다.
- 메뉴 표시줄에서 분석한다음 측정 옵션을 선택합니다. 이것은 간격 또는 상처의 영역을 표시합니다.
Representative Results
우리는 nitinol 필라멘트(그림 1A,N)를사용하여 맞춤형 기계 프로브를 개발하여 기계적으로 불러 일으킨 행동을 유도하고 다양한 강도(그림 2D)의무해하고 유해한 기계적 프로브를 사용하여 전체 행동 용량 반응 곡선을 생성하여 이러한 프로브가 기준선 (부상이없는 경우) 기계적 nociception을 연구하는 데 사용할 수 있음을 입증했습니다.
당사의 행동 분석 결과, 드로소필라 애벌레에 적용했을 때 200kPa(~1.57mN) 이하의 압력을 가하는 프로브가 역경압 반응(도2D 및 비디오 3)을유발하지 않는 것으로 판단되었다. 예상대로, 이러한 서브임계값 또는 비유해성 기계 프로브(175kPa 또는 200kPa)는 눈에 보이는 신경 조직 손상을 유도하지않았다(도 2E). 손상을 유도하지 않기 때문에 이러한 프로브는 기계적 동종증 (일반적으로 비 유해기계 자극에 대한 과민성)을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다. 반대로, suprathreshold 또는 유해 프로브(462kPa에서 5,116 kPa까지)는 용량 의존성 방식으로 증강 된 행동 반응(그림 2D)을유도하여 더 강한 행동 반응을 유도합니다. 예상대로, 초라 임계값 기계적 압력은 또한 말초 감각 뉴런 자체에 용량 의존조직 손상을유도(도 2E). 각 그룹에 대한 4개의 애벌레에서 취한 조직 손상(μm2± 표준 편차)의 측정 영역은 2,051.03 ± 703.81(462kPa), 5,102.29 ± 1,004.67(2,283kPa), ± 3,714.14(12,238.83±3,714.14)였다. 따라서, 462kPa(~63mN)보다 크거나 동일한 압력은 역경압 반응(애벌레의 25% 이상)을 불러일으키고 눈에 보이는 신경 조직손상(도 2E)을유발하며, 기계적 과민증(일반적으로 유해한 기계적 자극에 과민성)을 연구하는 것이 적절할 수 있다. Nociceptive 기계 프로브 (≥462 kPa)는 항상 조직 손상을 유도 (n = 10, 질적으로 평가) 하지만 항상 역경 압연 반응을 자극하지 않습니다.
기계적 과민성(알로디니아 및 과발증)을 평가하기 위해, 우리는 조직 손상을 유도하기 위해 자외선(UV) 조사를 사용하는 암시감각의 잘 확립된 드로소필라 애벌레 모델을 사용했다7,12. 이 분석은 열 염목 과민성 과민성8,9,10,13,14,15의유전 및 세포메커니즘을해부하는 데 도움이되었습니다. UV 치료가 기계적 알로디니아의 원인 여부를 확인하기 위해, 중간 제3-인스타제어(w1118)애벌레는 모의 조사 또는 UV 조사(15-20 mJ/cm2)(도 3A)였다. 이어서, 애벌레는 통상 하위임계체(200kPa, 1.57mN)로 2시간, 4h, 8h, 16h 및 24h 후처리에서 행동적으로 시험하였다. 유충의 약 20%는 자외선 치료 후 2시간 일찍 반응했으며, 50%는 4h로 응답했으며, 각각 6.6%와 8.3%의 모의 UV 조사동물(그림 3B)에비해 응답하였다. 이것은 UV 유도된 조직 손상이 4 시간 사후 조사에서 기계적 동종증을 일으킨다는 것을 나타냅니다. 후기 포인트(8h, 16h, 및 24h) UV 처리애 애벌레의 행동 반응은 16%-20%의 응답자(평균 평균 평균 평균 평균 n= 3-6세트 10애벌레), 모의 조사 대조군(3%-6%의 범위에서) 반응자의 평균 의미인 3=3-6B의평균의미(3%-6%의 반응자)에 비해 약간 증가하였다(통계적으로 유의하지 않음).
기계적 과대 지질을 조사하기 위해, 일반적으로 유충의 ~20 %에서 회광 압전 반응을 유도하고 신경 조직 손상(도2E)을유발하는 초라 임계 값 압력 (462 kPa, 3.63 mN)이 사용되었습니다. 우리는 UV 유도 조직 손상(도 3A)의유충의 등쪽에 462 kPa 프로브를 적용했습니다. 우리는 UV 처리다음 4 시간, 8 시간 및 16 h에서 프로브애벌레가 행동 과민성의 피크인 4 h와 함께 역경 압연 반응에 있는 중요한 증가를 보였다는 것을 것을을 발견했습니다 (~60% 반응); 모의 UV 조사 동물은 역경 반응의 ~27 %를 보였다(도 3C). 기계적 알로디니아와 유사하게, UV 처리 된 동물의 8 h, 16 h 및 24 h의 행동 반응 (36 %-42 % 범위). 비처리 애벌레(20%-26%)와 통계적으로 구별할 수 없었다. 후반 세 번째 인스타 스테이지의 애벌레는 중간 세 번째 인스타 스테이지와 비교했을 때 기준선 행동 반응이 약간 감소했습니다. 우리는 이것이 애벌레(도 2A)의증가 된 크기 또는 몸을 덮는 표피의 두께가 증가 할 수 있다고 가설합니다. 이 사실은 개발의 후반 단계에서 UV 처리가 더 중대한 기계적 감절을 유도하지 않는 이유를 설명 할 수 4 h 포스트 UV 처리.
종합하면, 우리의 결과는 Drosophila 애벌레가 UV 유도된 조직 손상 다음 기계적인 알로디니아 및 기계적인 과자 둘 다 개발한다는 것을 표시합니다. 기계적 알로디니아 및 과성게증의 피크 시간은 자외선 처리 후 4 시간 동일합니다. 그러나, 기계적 과색증은 기계적 알로디니아에 비해 기준선으로 더 느리게 반환되기 때문에 더 뚜렷한 측두엽을 갖는다.
그림 1: 드로소필라 애벌레에서 기계적 고드름을 평가하는 폰 프레이와 같은 도구의 개발. (A) 드로소필라 애벌레에서 기계적 고치증을 연구하는 데 사용되는 기계 프로브의 사진. (B)니티놀 필라멘트와 상대직경은 상대적 규모로 나타났다. (C)니티놀 필라멘트를 자르는 데 사용되는 대각선 커터의 그림. (D)날카로운 돌로 컷 니티놀 필라멘트의 날카로운 가장자리를 부드럽게. (E)프로브의 나무 아이스캔디 스틱 손잡이에 구멍을 만드는 데 사용되는 피하 바늘. 바늘의 끝은 안전한 필라멘트 삽입을 위해 손잡이 스틱의 절반 높이에 도달해야합니다. (F-G) 삽입 구멍나무 아이스캔디 스틱 핸들에 붙임으로써 니티놀 필라멘트의 부착. (H-L) 스케일에 대해 눌러 기계 프로브를 교정합니다. (M)다른 기계 프로브에 의해 생성된 힘값(mN) 및 압력(kPa). 프로브를 구성하는 데 사용되는 각 니티놀 필라멘트의 길이(P1-P10; P : 프로브)는 센티미터 (cm)에 상세합니다. (N)174kPa에서 5,116 kPa에 이르기까지 기계 프로브의 전체 세트의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기계적 고치 분석: 폰 프레이 와 같은 필라멘트는 역경 압연 동작의 용량 반응 곡선을 생성하고 감각 뉴런에 조직 손상을 일으킵니다. (A) 드로소필라 애벌레의 다양한 단계(두 번째 및 세 번째 인스타)의 사진. 스케일 바: 2mm.(B)세 번째 인스타 드로소필라 애벌레의 등쪽 보기의 만화. 빨간색 점은 기계 프로브가 적용되는 복부 세그먼트를 나타냅니다. T: 흉부 세그먼트; A: 복부 세그먼트. 다른 해부학적 랜드마크는 레이블이 지정되어 있습니다. (C)분석의 만화: 아래 표면에 구부러질 때까지 유충의 등쪽에 기계 프로브가 적용되어 2s로 유지됩니다. 압력이 충분히 높으면 방출 시 역경 롤링 응답이 유도됩니다. (D)행동 용량 반응; 각 파란색 점은 10마리의 동물 세트 내의 기계적 자극에 역경압압으로 반응한 애벌레의 백분율을 나타냅니다. 다른 기계 프로브에 의해 유도 된 역경 압연 동작의 퍼센트의 바이올린 플롯. kPa: 킬로파스칼. 상자 플롯은 중앙값(녹색), 수염(빨간색)을 나타내며 10번째 및 90번째 백분위수를 나타냅니다. (E)조직 손상: 제3항 애벌레(유전자형 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP가 발각 감각 뉴런을 표지하는) 표시된 압력으로 등쪽 세그먼트 A8에서 조사하였다. 형광으로 표기 된 쌍daC 클래스 IV 감각 뉴런 (등쪽 미드 라인을 가로 질러) 다음 검사하였다 (섹션 참조 4 과 5). 백색 영역 (적색 별표)은 간격 또는 조직 손상을 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm. 패널 B에서 애벌레는 등등 뷰에 표시되고 C에서는 측면 뷰입니다. 유충의 등쪽 표피 측에 압착된 기계프로브는 프로브끝과 주변 지역의 접촉 지점에서 같은 주머니를 생성합니다. 복부 쪽을 향해 구부러진 단단한 검은 색 선은 포켓의 상단이며, 파선 된 회색 측면 선은 측면과 포켓의 바닥을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 자외선 손상 후 기계적 과민성. (A)감각화를 테스트하는 실험 설계의 회로도. 중간 세 번째 인스타는 모의 치료 (비 UV) 또는 UV 조사했다. 기계적 노치프션 분석은 모의 치료 또는 조사 후 다른 시점(2h, 4h, 8h, 16h 및 24h)에서 수행되었다. (B) 기계적 동종증: 일반적으로 서브 임계값 또는 비 유해 기계 자극 (200 kPa, 1.57 mN)을 모의 처리 또는 UV 조사 후 표시된 시간 지점에서 탐사 후 역경 압연을 나타내는 애벌레의 백분율. (C)기계적 과대지질: 일반적으로 상류임계값 또는 유해 기계적 자극(462kPa, 3.63 mN)을 모의 처리 또는 UV 조사 후 표시된 시점에서 프로빙 후 역경 압연을 나타내는 애벌레의 백분율. 오류 막대는 평균 +/- SEM. 두 꼬리 쌍이 짝을 이루는 t-테스트가 통계 분석에 사용되었음을 나타냅니다: *p < 0.05, **p < 0.01; ns: 중요하지 않습니다. 패널 B와 C의 각 빨간색 점은 시간점/조건당 10개의 애벌레, n =3-6세트의 평균 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 드로소필라 애벌레의 정상적인 운동. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 드로소필라 애벌레의 유해한 기계적 자극. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: 드로소필라 애벌레의 기계적 자극을 하위 임계값으로 합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
니티놀 필라멘트에서 제작된 맞춤형 기계 프로브를 사용하여 확립된 기계 분석1,2,16을 수정했습니다. 이 금속 합금은 우리가 Drosophila 애벌레의 크기에 적합한 작은 직경 필라멘트를 사용할 수 있습니다. 낚시 라인 기반의 모노필라멘트는 현재까지 플라이 기계식 고치름의 필드를 지배했다2,5,6,16. 우리의 니티놀 필라멘트는 약 ~ 3-5 개월 동안 모양과 측정 된 압력을 유지합니다 (우리의 경험에서). 니티놀 필라멘트의 길이와 직경을 변화시킴으로써 사용자는 서브 임계값에서 거의 완전한 롤링 응답에 이르는 광범위한 압력을 생성할 수 있습니다. 특히, 서브 임계 값 프로브를 만드는 것은 작은 직경 nitinol 필라멘트로 간단합니다. 이러한 프로브를 사용하여, 우리는 압력이 힘보다는, 더 일관된 nocifensive 행동 응답4를유도한다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리는 이 필라멘트가 기계적 과민성-알로디니아 및 과발게증을 연구하는 데 유용한 도구라는 것을 잘 확립된 UV 유도 향각 감질 모델7,10,13을사용하여 여기에서 시연합니다.
낚시 라인에서 가공된 기계프로브를 이용한 이전 연구는 행동반응성 2,6,16,17에서일정한 변동성을 초래했다. 몇 가지 요인이 이를 설명할 수 있습니다. 첫째, 압력이 중요한 변수이기 때문에 필라멘트 팁의 강화가 반올림되고 날카로운 모서리가 없는 것이 중요합니다. 둘째, 유사한 힘을 생성하는 다른 기계적 프로브가 서로 다른 압력4를유도할 수 있기 때문에 힘만이 아니라 압력 값을 보고하는 것이 실험의 재현성에 중요하다. 셋째, 유해 프로브를 사용하여 유충당 하나의 기계적 자극만 적용하는 것이 중요하며, 이러한 프로브는 표피4 및 감각 신경 수준에서 용량 의존적 조직 손상을 생성하기 때문이다(도2E). 두 번째 또는 후속 유해 기계적 자극, 조직 손상이 유도 된 후, 생각할 수 영향을받는 말초 감각 뉴런의 기능을 손상하고 변경 된 행동 반응을 유도 할 수 있습니다. 또 다른 연구에서는 유해 기계 프로브로 두 번 자극된 애벌레는 주로 향상된 행동 반응5를표시하여 급성 기계적 감쇠(hyperalgesia)의 개발을 제안하며, 이는 첫 번째 유해 기계적 자극에 의해 유발된 조직 손상으로 인해 발생할 수 있습니다. 반대로, 다른 저자6 혼합 보고 (증가 또는 감소) 행동 반응, 변경 된 행동 응답 신경 조직의 손상/기능 장애 때문일 수 있습니다 나타내는. 각 애벌레를 한 번만 자극하면 민감화 또는 조직 손상으로 인한 행동 반응의 가능한 분산을 제거합니다. 넷째, 우리는 기계적으로 자극 세그먼트 A8, 이는 이전 연구보다 더 후방 (선호 영역 A3-A4)2,5,16. ~3,900kPa와 5,300kPa 사이의 프로브는 세그먼트 A2 또는 A8에 적용되어 행동 차이4를나타내지 않았다. 또한 A8은 A2-A4에 비해 유충이 이 지역에서 더 얇아지고 압축하기 때문에 낮은 압력(<300 kPa)을 생성하는 기계 프로브로 자극하기가 더 쉽습니다. 다른 연구는 유충의 후방 끝의 유해 한 기계적 자극 (강성 곤충 핀에 의해 전달, 집게로 개최) 주로 전방 운동을 불러 일으켰다, 오히려 배설또는 압연 응답(18). 이러한 상이한 행동 반응은 중고 물질의 특성(구부릴 수 있는 니티놀 필라멘트 대 비압축곤충 핀)의 특성이나 유충에 전달된 다른 압력(곤충 핀의 압력 값이 보고되지 않음)의 차이 때문일 수 있다.
드로소필라 애벌레에 대한 기계적 고치 분석의 발달은 다른 기계적 감각 이온 채널과 신경 회로가 기계적 고치를 중재한다는 것을 발견 할 수 있게했다5,6,16,17. 그러나, 기계적 과민성(allodynia 및 hyperalgesia)의 연구는 다른 감각 양식의 민감화에 비해 지연되어7, 8,10,13,14,콜드9및화학3. 이러한 지연은 부분적으로 상류 임계값 압력에 이르는 전체 응답 범위를 생성할 수 있는 적합한 기계 프로브의 부재 때문일 수 있다. 특히 기계적 알로디니아를 평가하기 위한 중요한 것은, 부상하지 않은 애벌레에서 역경 압연 반응을 유도하지 않는 하위 임계값 프로브입니다. 우리의 개선 된 기계 프로브의 중요성은 무해한 자극 (하위 임계 값 ~ 174 kPa-200 kPa) 또는 낮은 에서 높은 유해 범위 (suprathreshold ~225 kPa ~ ~ ~ 5,116 kPa)에 걸쳐 조작 될 수 있다는 것입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 애벌레가 UV 조사 후에 기계적인 알로디니아 및 기계적인 hyperalgesia둘 다 발전하는 nitinol 폰 프레이 같은 필라멘트를 사용하여 보여줍니다. 기계적 감도는 열 감화에 비해 몇 가지 차이를 보여줍니다. 기계적 감작의 발병및 피크는 모두 열(열) 감점(초간증의 경우~8h, 알로디니아의 경우 ~24h)에 비해더일찍(~4h)이다. 또한, 기계적 알로디니아 및 과진증은 수반된다(둘 다 ~4h에서 최고). 더욱이, 열 감도(알로디니아 및 과발증)가 나중에 완전히 해결되는 동안7,기계적 과민성은 기준선 위에 약간 남아 있는 긴 꼬리를 나타냈다. Drosophila의 감기 감속제는 감기에 자극된 행동9의 스위치와 새로운 감기 유발 행동의 출현을 포함합니다 - 기계자극으로 관찰되지 않는 현상. 발병, 지속 시간 및 관찰된 동작에 있는 이 다름은 각 감각 양식이 다른 신호 통로에 의해 통제될 수 있다는 것을 건의합니다. Drosophila에서 사용할 수 있는 강력한 유전 공구와 여기에서 기술된 감작 분석체를 결합하는 것은 관찰된 기계과민성 (알로디니아 및 과질증)의 정확한 유전 해부를 허용해야 합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 프로토 타입 폰 프레이 필라멘트를 개발 토마스 왕, 기계 프로브 분석 개선을위한 패트릭 J. 황, 제어를위한 블루밍턴 드로소필라 주식 센터(w1118)및 ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP 비행 주식, 그리고 골코 실험실 구성원은 비판적으로 원고를 읽고. 이 작업은 R21NS087360 및 R35GM126929에서 MJG에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22x22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22x40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
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