Summary
Målet med detta protokoll är att visa hur man utför en förbättrad analys för mekanisk nociception i Drosophila larver. Vi använder analysen här för att visa att mekanisk överkänslighet (allodyni och hyperalgesi) finns i Drosophila larver.
Abstract
Publicerade analyser för mekanisk nociception i Drosophila har lett till varierande bedömningar av beteende. Här tillverkade vi, för användning med Drosophila larver, anpassade metall nickel-titanlegering (nitinol) filament. Dessa mekaniska sonder liknar de von Frey filament som används i ryggradsdjur för att mäta mekanisk nociception. Här visar vi hur man gör och kalibrerar dessa mekaniska sonder och hur man genererar ett fullständigt beteendemässiga dossvar från subthreshold (harmlöst eller icke-skadligt intervall) till suprathreshold (låg till hög skadlig räckvidd) stimuli. För att visa nyttan av sonderna undersökte vi vävnadsskadad överkänslighet i Drosophila larver. Mekanisk allodyni (överkänslighet mot en normalt harmlös mekanisk stimulans) och hyperalgesi (överdriven lyhördhet för en skadlig mekanisk stimulans) har ännu inte fastställts i Drosophila larver. Med hjälp av mekaniska sonder som normalt är harmlösa eller sonder som vanligtvis framkallar ett aversivt beteende fann vi att Drosophila larver utvecklar mekanisk överkänslighet (både allodyni och hyperalgesi) efter vävnadsskada. Således kommer de mekaniska sonder och analyser som vi illustrerar här sannolikt att vara viktiga verktyg för att dissekera de grundläggande molekylära/genetiska mekanismerna för mekanisk överkänslighet.
Introduction
Drosophila larver uppvisar ett karakteristiskt aversivt rullande beteende när de utsätts för olika skadliga stimuli:termisk 1,mekanisk 2, och kemisk3. Detta beteende skiljer sig tydligt från normal rörelse. Här beskriver vi en förbättrad mekanisk analys som kan användas för att bedöma mekanisk nociception och mekanisk sensibilisering.
I en ny studie tillverkade vi von Frey-liknande filament med nitinoltrådar4. Sonder som utövar olika krafter och tryck gjordes genom att variera längder och diametrar av nitinoltrådarna som bildar varje sond. Mekaniska sonder kalibrerades och de uppmätta kraftvärdena (i millinewton, mN) omvandlades till tryck (kilopascal, kPa), baserat på spetsområdet för varje sond4. Anpassad tillverkning av mekaniska sonder tillät oss att generera subthreshold (≤200 kPa) till suprathreshold (225 kPa till 5318 kPa) tryck, vilket i princip kan vara fördelaktigt för att studera mekanisk överkänslighet. Med hjälp av dessa förbättrade mekaniska von Frey-liknande filament visade vi att tryck4, i motsats till den tidigare undersöktakraften 2,5,6 korrelerar mer konsekvent med aversiv beteenderesponsivitet hos Drosophila larver. Den förbättrade mekaniska analysen som beskrivs här hjälpte också till att identifiera en bevarad vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)-relaterad receptor tyrosinkinas som signalerar en väg som reglerar mekanisk nociception hos flugor och råttor4.
Mekanisk allodyni och hyperalgesi, två former av överkänslighet, är relativt understudie i Drosophila larver, jämfört med termiska (värme och kyla) och kemiska sensoriska modaliteter3,7,8,9,10. Detta beror förmodligen på bristen på specifika mekaniska sonder som sträcker sig från harmlösa stimuli till det höga skadliga intervallet2,5,6. En normalt harmlös stimulans som framkallar det typiska aversiva rullande beteendet efter Att Drosophila larver upplever vävnadsskada 3,7 kallas allodynia. Ett överdrivet rullande svar på en typiskt skadlig stimulans kallas hyperalgesi7. Skadliga stimuli definieras som de som framkallar vävnadsskador och kan aktivera nociceptorer11. Skadliga stimuli levereras till Drosophila larver skada antingen barriär epidermis, perifera nociceptiva sensoriska nervceller3,4,7, eller båda.
I den här artikeln visar vi hur man skräddarsyr och kalibrerar von Frey-liknande mekaniska sonder som är lämpliga för Drosophila larver. Vidare visar vi hur man använder dessa sonder för att analysera mekaniska nociceptiva svar i Drosophila larver. Slutligen visar vi vidare nyttan av dessa sonder genom att använda dem för att visa förekomsten av mekanisk överkänslighet, både allodyni och hyperalgesi, efter vävnadsskador i Drosophila larver (se representativa resultat).
Protocol
1. Mekanisk sondkonstruktion
- Kapa varje nitinolglödtråd (figur 1B), vinkelrätt mot dess långa axel, mot den angivna längden (figur 1M–N) med hjälp av en liten trådskärare (Figur 1C). Glödtrådarna finns i tre olika förinställt diametrar (figur 1B).
OBS: De längder som anges här är en guide för att uppnå de ungefärliga tryck som anges, med hjälp av ett liknande protokoll för monteringens konstruktion. I slutändan, oavsett glödtrådsskärningens längd och hålets djup i fästet, måste glödtrådarna mätas/kalibreras på en balans för att erhålla det exakta kraft-/tryckvärdet. - Undersök glödtrådens spets under ett stereomikroskop för att säkerställa att inga vassa eller oregelbundna kanter finns kvar eftersom dessa kan orsaka vävnadsskador på larvernas hud och störa kalibreringen.
- Jämna ut den mekaniska sondens vassa kanter manuellt med hjälp av en slipsten tills inga allvarliga ojämnheter kvarstår (figur 1D).
- Gör ett hål mot änden av en isglasspinne i trä (figur 1E) med en hypodermisk nål (se Materialförteckning ). För in nålen minst halvvägs genom isglasspinnens höjd (bild 1E). Detta skapar en kammare för införande av nitinolglödtråden.
- Applicera trälim på en enda nitinolglödtråd (Figur 1F) och sätt in den limbelagda glödtråden i nålfacket i en träglasspinne(figur 1G). Låt torka i ~5 h.
- Kalibrera varje mekanisk sond genom att trycka den mot en skala tills den mekaniska sonden böjs( Bild 1H–L). Detta är den punkt med maximal kraft som kan registreras i gram. Beroende på glödtrådsdiametrar (förinställt) och längder (användarbestämda) kan ett komplett utbud av krafter och tryck genereras.
- Konvertera den massa som registrerats i steg 1.6 för att tvinga i millinewton (mN) med hjälp av formeln f = ma (Kraft är lika med massa multiplicerad med gravitationsacceleration). f: Kraft. m: massa; a: gravitationsacceleration (9,8 m/s2) (figur 1M).
- Konvertera slutligen den beräknade kraften till tryck (kraft/område) i kilopaskal (kPa) genom att dividera den uppmätta kraften med glödtrådsspetsens yta (figur 1M). För att beräkna området, konvertera diametern på de olika nitinolfilamenten från tum (0,04", 0,06" och 0,08") till centimeter. Därefter bestämmer πr2 (där r = nitinolglödtrådsradien) området (se figur 1M). Om du förbereder flera sonder med filament med olika diametrar och längder genereras en fullständig uppsättning som spänner över responsivområdet för Drosophila larver (provuppsättningen visas i figur 1N).
OBS: Kontrollera varje mekanisk sond minst var 3–4: e vecka. När trycket avviker med mer än ± 3 % från det ursprungliga måttet måste en ny mekanisk sond tillverkas.
2. Beredning av larver
- Höj kontrollbelastningen (w1118) larvavkomma eller larver som innehåller transgenerna ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (för visualisering av skador på sensoriska nervceller) på standardmat i en 25 °C inkubator. Vanligtvis bibehålls lagren rutinmässigt vid 18 °C, men både föräldrar och larvavkommor föds upp vid 25 °C på vanlig majsmjölsmat för experiment.
OBS: Vuxna flugor (fem män och tio honor, 1:2 förhållande) hålls i flugflaskan, för att tillåta äggläggning, i ca 24 timmar. Tiden efter äggläggning (AEL) börjar från när de vuxna avlägsnas. - Samla de tredje instar larverna, efter cirka 96 h äggläggning, genom att försiktigt spruta kranvatten i den mjuka flugmaten som innehåller larverna. Vandrande larver som har lämnat maten, eller som har everted främre eller bakre spiracles, är för stora / gamla för denna analys. Andra instar larver (~ mindre än 4 mm långa) är för små.
- Häll ut innehållet i den mjuka flugmaten i en ren petriskål av standardstorlek (100 mm x 15 mm).
- Använd tång, sortera mitten av tredje instar, medelstora, larver (se figur 2A) från mindre (andra instar och tidig tredje instar) eller större (sena eller vandrande tredje instar) larver. Mild manipulering med tång för att undvika vävnadsskador på larverna rekommenderas.
OBS: Överföringen med tång baseras främst på vattenspänning och inte genom att trycka på larverna med tångens blad. Ett alternativ till användning av tång för att manövrera larver är mjuka penslar. Med något av verktygen bör användaren öva på att överföra djuren, för att inte orsaka oavsiktliga vävnadsskador som kan komplicera beteendemätningar. - Överför mitten av tredje instar larver, med tång, till en liten Petri-skål (30 mm x 15 mm) som innehåller en liten plugg flugmat fuktad med vatten vid rumstemperatur. Håll larverna i den lilla Petri-skålen tills experimenten utförs, men inte längre än 20 minuter.
OBS: I allmänhet kommer överföring av 20-30 larver till matpluggen att ge ett tillräckligt antal för 20 minuters beteendeanalyser.
3. Mekanisk nociception-analys
- Placera en mid-third instar larva (med tång) på en tunn platta med svart eller mörk vinyl under ett ljust fältstereomikroskop. Den mörka färgen ger kontrast som förbättrar visualiseringen av larven. Det är att föredra att ha en fritt rörlig bit mörk vinyl eftersom det gör det möjligt för användaren att justera larven utan att röra eller skada den.
- Sätt de optiska fiberlamporna mellan mikroskopmållinserna och den svarta eller mörka vinylplattan; detta möjliggör tillräcklig hög kontrastbelysning för att se larven.
- Kassera larver som inte uppvisar normal rörelse efter överföring till dynan. Dessa kan störa det normala nociceptiva beteendemässiga svaret. För normal rörelse, se Video 1.
- Torka bort, med en pappershandduk, eventuellt överflödigt vatten som omger larven som kan få larven att flyta på vinylplattan.
- Orientera larven genom att flytta den mörka vinylplattan. Larvens huvud/mun ska peka åt vänster om du är högerhänt och vice versa om du är vänsterhänt (figur 2A-B).
- Applicera den valda mekaniska sonden, vanligtvis i 1–2 s, på larvens bakre dorsala sida vid ungefär buksegment A8 (se figur 2B),tills sonden böjer och framkallar den tidigare uppmätta tryckmängden (figur 2C). Det är viktigt att sonden trycker mot larvens dorsala yta och komprimerar larverna till den underliggande dynan vid sondkontaktpunkten.
OBS: Vid kontaktpunkten mellan spetsen av nitinolglödtråden och dorsal nagelband-epidermis, sonder lägre än 2,300 kPa, främst böja utan att penetrera nagelband och underliggande vävnader. Sådana sonder påverkar sällan larvdödligheten4. Vid högre tryck (>5 000 kPa) böjer sonderna både och tränger ibland in i nagelbandet och underliggande vävnader. Punktering av larverna försämrar larvens överlevnad4 och om de observeras kasseras dessa larver vanligtvis från beteendeanalys. - Registrera beteendesvaret för varje larva. Ett positivt nociceptivt svar (Video 2) indikeras om larven visar en komplett rulle på 360° längs kroppens axel inom 3 s. Andra svar (försök att vända, snabb crawlning och vickning) anses vara negativa för denna analys.
OBS: Larver stimulerade med en subthreshold mekanisk stimulans (200 kPa) framkallade inte den typiska nociceptiva eller rullande svaret (Video 3). Vissa larver uppvisade snabba framåt- eller lätta beröringssvar som förändringar i rörelseriktningen. - Kassera larven och förbered nästa för analys, upprepa steg 3.1 till 3.7.
- Upprepa steg 3,1–3,7 tills önskat antal larver har uppnåtts (tre till sex uppsättningar n = 10 larver användes här för varje sond).
OBS: Vid användning av mekaniska sonder med lägre tryck (174–462 kPa) tar analysen längre tid per larva. Detta beror på att spetsen på längre filament svänger mer, vilket gör det svårare att peta larven i mitten av A8-segmentet. Övning är nödvändig med dessa sonder.
4. Konfokal mikroskopi för att bedöma neuronal morfologi
- Placera en larva (av genotyp ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP för att märka sensoriska nervceller) som tidigare stimulerats med en nitinolglödtråd i en eteriseringskammare inuti en Coplin-burk som innehåller en 10 mL bägare som bär en bomullstuss blöt med ~ 1 ml dietyleter. Låt larven sitta i kammaren i ~5 min.
OBS: Ett detaljerat protokoll för eterisering finns i en tidigare studie publicerad av vår grupp12. - Skölj larven försiktigt från eteriseringskammaren till en liten petriskål.
- Ha en enkel mikroskopbild, två små täcken (22 x 22 mm) och ett långt locklip (22 x 54 mm) (se Materialförteckning).
- Tillsätt små droppar eter:oljelösning (1:5 förhållande mellan etyleter och halokarbonoljelösning, se Materialförteckningen) i båda ändarna av diabilden och placera sedan de små täckglasen ovanpå de små dropparna. Detta arrangemang skapar ett litet utrymmesgap där larven får plats.
OBS: Tryck de små täckena mot mikroskopets glid tills det är svårt att glida. - Tillsätt några droppar eter:oljelösning på mitten av mikroskopet glida och placera sedan larven, med hjälp av tång, i mitten av mikroskopglaset (mellan de små täckena). Se till att larvens anteroposterioraxel är parallell med glidbanans kortsida och att den nedre sidan är vänd uppåt.
- Täck larverna med det långa täcket placerat ovanpå larven och de två mindre täckena.
OBS: Tryck generöst på det långa täcket tills larven är nästan platt. - Bildsegment A8 i larven med hjälp av ett konfokalt mikroskop (se Materialförteckning)med laservåglängd 488 (GFP).
OBS: Avbilda larven omedelbart eftersom anestetiseringen via eter kommer att blekna snabbt (~ 5-10 min) och larven kommer att vakna och röra sig, vilket kommer att komplicera ytterligare avbildning. - Fånga Z-stackbilder med en upplösning på 1024 x 1024 pixlar med en 20x numerisk bländare (NA) 0,7 torr objektiv vid 1x zoom, stegstorlek på 1,5 μm.
5. Kvantifiering av vävnadsskador
- Samla in och konvertera stackbilderna i Z-serien, från avsnitt 4.8, till en enda Z-projektion (en förenkling av flera bilder tagna på olika fokalplan till en enda sammansatt bild). Detta kan utföras med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara (t.ex. Olympus Fluoview) eller motsvarande öppen källkodsplattform, t.ex. Fiji / Image J. Spara den enda Z-projektionen i TIFF-format.
- Öppna bildanalysprogrammet Fiji/ImageJ.
- Klicka på Arkivi menyraden och välj Öppna i fönstret som visas.
- Välj den lagrade enskilda bildprojektionen, sparad i TIFF-format, som ska analyseras.
- Klicka på Redigerai menyraden och välj alternativet Invertera i fönstret som visas.
- Klicka på Bilden, på menyraden, välj sedanJustera, i fönstret som visas, och välj slutligen alternativet Ljusstyrka/kontrast.
- Välj alternativet Frihandsform i verktygsfältet för att mäta området för gapet (om det finns något).
- Klicka på Analysera, på menyraden och välj alternativet Mått. Detta visar området för gapet eller såret.
Representative Results
Vi utvecklade anpassade mekaniska sonder, med hjälp av nitinoltrådar (Figur 1A, N), för att framkalla mekaniskt framkallade beteenden och genererade en fullständig beteendemässig dosresponskurva med hjälp av både harmlösa och skadliga mekaniska sonder av varierande intensitet ( Figur2D) som visar att dessa sonder kan användas för att studera utgångsvärdet (i avsaknad av skada) mekanisk nociception.
Våra beteendemässiga analysresultat bestämde att sonder som utövar tryck under 200 kPa (~ 1,57 mN) (Figur 1M), när de appliceras på Drosophila larver, inte provocerar ett aversivt rullande svar ( Figur2D och Video 3). Som förväntat framkallade dessa subthreshold eller icke-skadliga mekaniska sonder (175 kPa eller 200 kPa) inte synliga neuronala vävnadsskador (Figur 2E). Eftersom de inte inducerar skador kan sådana sonder vara användbara för att bedöma mekanisk allodyni (överkänslighet mot en normalt icke-skadlig mekanisk stimuli). Omvänt framkallade suprathreshold eller skadliga sonder (från 462 kPa till 5 116 kPa), ett förstärkt beteendesvar (figur 2D) på ett dosberoende sätt - med det högre trycket som framkallar starkare beteendemässiga svar. Som förväntat framkallade suprathreshold mekaniskt tryck också dosberoende vävnadsskador på de perifera sensoriska nervcellerna själva (Figur 2E). Det uppmätta området för vävnadsskador (i μm2 ± standardavvikelse) som togs från fyra larver för varje grupp var: 2 051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5 102,029 ± 1 004,67 (2 283 kPa) och 12 238,83 ± 3 724,11 (5 116 kPa). Således kan tryck som är större än eller lika med 462 kPa (~ 63 mN), som framkallar ett aversivt rullande svar (i 25% eller mer av larverna) och orsakar synliga neuronala vävnadsskador (figur 2E), vara lämpliga för att studera mekanisk övertalning (överkänslighet mot normalt skadliga mekaniska stimuli). Nociceptiva mekaniska sonder (≥462 kPa) inducerar alltid vävnadsskador (n = 10, utvärderas kvalitativt) men provocerar inte alltid ett aversivt rullande svar.
För att utvärdera mekanisk överkänslighet (allodyni och hyperalgesi) använde vi en väletablerad Drosophila larvmodell av nociceptiv sensibilisering som använder ultraviolett ljus (UV) bestrålning för att induceravävnadsskador 7,12. Denna analys har hjälpt till att dissekera de genetiska och cellulära mekanismerna för termisk nociceptiv överkänslighet8,9,10,13,14,15. För att avgöra om UV-behandling orsakar mekanisk allodyni var larverna i mitten av tredje-instarkontrollen (w1118) mock-bestrålade eller UV-bestrålade (15–20 mJ/cm2) (figur 3A). Sedan testades larverna beteendemässigt vid 2 h, 4 h, 8 h, 16 h och 24 h efterbehandling med en normalt subthreshold mekanisk sond (200 kPa, 1,57 mN). Cirka 20% av larverna svarade så tidigt som 2 timmar efter UV-behandling medan 50% svarade vid 4 h, jämfört med 6,6% respektive 8,3% mock UV-bestrålade djur (Figur 3B). Detta indikerar att UV-inducerad vävnad skada orsakar mekanisk allodynia vid 4 h post-bestrålning. Vid senare tidpunkter (8 h, 16 h och 24 h) var beteendesvaret hos de UV-behandlade larverna i intervallet 16-20% responders (genomsnittligt medelvärde på n = 3-6 uppsättningar av 10 larver vardera), något ökat (men inte statistiskt signifikant) jämfört med den mock-bestrålade kontrollgruppen (i intervallet 3%-6% av de svarande, genomsnittligt medelvärde på n = 3–6 uppsättningar 10 larver vardera) (figur 3B).
För att undersöka mekanisk hyperalgesi användes ett suprathresholdtryck (462 kPa, 3,63 mN), som normalt inducerar ett aversivt rullande svar i ~ 20% av larverna (Figur 2D) och orsakar neuronal vävnadsskada (figur 2E). Vi applicerade 462 kPa-sonden på larvernas dorsala sida med eller utan UV-inducerad vävnadsskada(figur 3A). Vi fann att larver som undersöktes vid 4 h, 8 h och 16 h efter UV-behandling visade en betydande ökning av det aversiva rullande svaret, med 4 h som toppen av beteendeöverkänsligheten (~ 60% lyhörd); mock UV-bestrålade djur visade en ~ 27% av aversive svar (Figur 3C). I likhet med mekanisk allodyni, beteendemässiga svaret vid 8 h, 16 h och 24 h UV-behandlade djur (i intervallet 36%-42%) var statistiskt oskiljbara från de icke-behandlade larverna (i intervallet 20–26 %). Larver i slutet av tredje instar-stadiet visade en liten minskning av baslinjens beteendemässiga svar jämfört med mitten av tredje instarstadiet. Vi antar att detta kan vara antingen genom larvernas ökade storlek (Figur 2A) eller den ökade tjockleken på nagelbandet som täcker kroppen. Detta faktum kan förklara varför UV-behandlingen i ett senare utvecklingsstadium inte inducerar större mekanisk sensibilisering, som observerats 4 h efter UV-behandling.
Sammantaget visar våra resultat att Drosophila larver utvecklar både mekanisk allodyni och mekanisk hyperalgesi efter UV-inducerad vävnadsskada. Topptiden för mekanisk allodyni och hyperalgesi är densamma, 4 timmar efter UV-behandling; Mekanisk hyperalgesi har dock en mer uttalad temporal svans som det återvänder till baslinjen långsammare jämfört med mekaniska allodynia.
Figur 1: Utveckling av ett Von Frey-liknande verktyg för att utvärdera mekanisk nociception i Drosophila larver. (A) Bild av en mekanisk sond som används för att studera mekanisk nociception i Drosophila larver. B)Nitinolfilament och deras relativa diametrar visas i relativ skala. (C) Bild av den diagonala trådskäraren som används för att skära nitinolfilamenten. (D) Jämna ut de vassa kanterna på den skurna nitinolglödtråden med en slipsten. (E) Hypodermisk nål som används för att göra ett hål i sondens träglassstickhandtag. Nålens spets måste nå minst hälften av handtagets höjd för säker filamentinsättning. (F–G) Fastsättning av nitinolglödtråden genom att limma in i ett träglassstickhandtag med insättningshål. (H–L) Kalibrering av mekaniska sonder genom att trycka dem mot en skala. (M)Värden på kraft (i mN) och tryck (i kPa) som genereras av olika mekaniska sonder. Längden på varje nitinolglödtråd som används för att konstruera sonderna (P1–P10; P: sond) är detaljerad i centimeter (cm). (N) En bild av en komplett uppsättning mekaniska sonder, från 174 kPa till 5 116 kPa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Mekanisk nociceptionanalys: Von Frey-liknande filament genererar en dosresponskurva av aversivt rullande beteende och orsakar vävnadsskador på sensoriska nervceller. (A) Bilder av de olika stadierna (andra och tredje instar) av Drosophila larver. Skala bommar för: 2 mm. (B) Tecknad film av dorsalen beskådar av den tredje instarEn Drosophila larver. Den röda pricken anger buksegmentet där den mekaniska sonden appliceras. T: bröstsegment; A: buksegment. Andra anatomiska landmärken är märkta. C)Tecknad film av analysen: En mekanisk sond appliceras på larvens dorsala sida tills den böjer sig mot ytan nedan och hålls sedan i 2 s. Om trycket är tillräckligt högt framkallar detta ett aversivt rullande svar vid frisättning. (D) Beteendemässiga dos svar; varje blå prick representerar den procent av larverna som svarade, med aversiv rullning, på den mekaniska stimuleringen inom en uppsättning av 10 djur. Violin plot av procent av aversive rullande beteende framkallas av olika mekaniska sonder. kPa: kilopascals. Boxdiagram representerar median (grön), morrhår (röd) representerar den 10: e och 90: e percentilen. (E) Vävnadsskada: Tredje instar larver (av genotyp ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP för att märka nociceptiva sensoriska nervceller) undersöktes vid dorsala segment A8 med de angivna trycken. Fluorescerande märkta parade ddaC klass IV sensoriska nervceller (över dorsala mittlinjen) undersöktes sedan (se avsnitten 4 och 5). Vita områden (röda asterisker) representerar luckor eller vävnadsskador. Skalstång: 100 μm. I panel B visas larven i dorsalvyn, medan det i C är sidovyn. Mekaniska sonder pressade mot larvens dorsala nagelband-epidermissida ger en depressionsliknande ficka vid kontaktpunkten för sondens spets och de omgivande områdena. Den helsvarta linjen som böjer sig mot ventralsidan är toppen av fickan, medan den streckade grå sidolinjen representerar sidosidan och botten av fickan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Mekanisk överkänslighet efter UV-skador. A)Schematisk av den experimentella designen för att testa sensibilisering. Mitten tredje instar var mock treated (non-UV) eller UV bestrålade. Den mekaniska nociception-analysen utfördes sedan vid olika tidpunkter (2 h, 4 h, 8 h, 16 h och 24 h) efter hånfull behandling eller bestrålning. B) Mekanisk allodyni: Andelen larver som uppvisar aversiv rullning efter sondering med normalt subthreshold eller icke-skadlig mekanisk stimulans (200 kPa, 1,57 mN) vid de angivna tidpunkterna efter hånbehandling eller UV-bestrålning. C)Mekanisk hyperalgesi: Andelen larver som uppvisar aversiv rullning efter sondering med normalt suprathreshold eller skadlig mekanisk stimulans (462 kPa, 3,63 mN) vid de angivna tidpunkterna efter hånbehandling eller UV-bestrålning. Felstaplar anger medelvärdet +/- SEM. Tvåstjärtat ej släpat t-test användes för statistisk analys: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: inte betydande. Varje röd punkt, i panelerna B och C, representerar den genomsnittliga andelen 10 larver, n = 3–6 uppsättningar per tidpunkt/tillstånd. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Normal rörelse av Drosophila larver. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Skadlig mekanisk stimulering av Drosophila larver. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Subthreshold mekanisk stimulering av Drosophila larver. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Vi modifierade en etablerad mekanisk analys1,2,16 med hjälp av anpassade mekaniska sonder tillverkade av nitinoltrådar. Denna metalllegering gör det möjligt för oss att använda filament med mindre diameter som är lämpliga för storleken på Drosophila larverna. Fiske linje-baserade monofilaments har dominerat fältet för flyga mekanisk nociception hittills2,5,6,16. Våra nitinolfilament bibehåller sin form och uppmätt tryck i cirka ~ 3-5 månader (enligt vår erfarenhet). Genom att variera längden och diametern på nitinolfilamenten kan användaren generera ett brett spektrum av tryck som sträcker sig från subthreshold till ett nästan komplett rullande svar. I synnerhet är det enklare att göra subthreshold-sonder med nitinolfilament med mindre diameter. Med hjälp av dessa sonder fann vi att tryck, snarare än kraft, framkallar mer konsekventa nocifensiva beteendemässiga svar4. Vi demonstrerar här, med hjälp av en väletablerad UV-inducerad nociceptiv sensibiliseringsmodell7,10,13, att dessa filament också är ett användbart verktyg för att studera mekanisk överkänslighet - allodyni och hyperalgesi.
Tidigare studier med mekaniska sonder tillverkade av fiskelina har lett till en viss variation ibeteenderesponsivitet 2,6,16,17. Flera faktorer kan förklara detta. För det första, eftersom tryck är den viktiga variabeln, är polering av glödtrådsspetsen så att den är rundad och inte har några skarpa kanter avgörande. För det andra är rapportering av tryckvärden snarare än bara kraft viktigt för experimentens reproducerbarhet, eftersom olika mekaniska sonder som genererar liknande krafter kan framkalla olika tryck4. För det tredje är det viktigt att endast tillämpa en mekanisk stimulering per larv med hjälp av skadliga sonder, eftersom sådana sonder ger en dosberoende vävnadsskada vid epidermala4 och sensoriska neuronala nivåer (Figur 2E). En andra eller efterföljande skadliga mekaniska stimulans, efter vävnad skador har inducerats, kan tänkas försämra funktionen hos de drabbade perifera sensoriska nervceller och framkalla en förändrad beteendemässiga svar. I en annan studie visade larver stimulerade två gånger med skadliga mekaniska sonder mestadels ett förbättrat beteendesvar5, vilket tyder på utveckling av en akut mekanisk sensibilisering (hyperalgesi), vilket kan bero på vävnadsskadan som provoceras av den första skadliga mekaniska stimulansen. Omvänt rapporterade andra författare6 ett blandat (ökat eller minskat) beteendesvar, vilket indikerar att det förändrade beteendesvaret kan bero på skador/dysfunktion i neuronalvävnaden. Stimulera varje larva endast en gång eliminerar möjliga varians i beteendemässiga svar som härrör antingen från sensibilisering eller vävnadsskador. För det fjärde stimulerade vi mekaniskt segment A8, som är mer bakre än tidigare studier (föredragna områden A3-A4)2,5,16. Sonder mellan ~3 900 kPa och 5 300 kPa som tillämpades på antingen segment A2 eller A8 visade inga beteendemässiga skillnader4. Dessutom är A8, jämfört med A2–A4, lättare att stimulera med mekaniska sonder som genererar lägre tryck (<300 kPa) eftersom larven är tunnare i denna region och därmed lättare komprimeras. Andra studier visade att skadlig mekanisk stimulering av larvens bakre ände (levererad av en styv insektsstift, som hålls med tång) mestadels framkallade framåtrörelse, snarare än ett aversivt eller rullandesvar 18. Detta olika beteendemässiga svar kan bero på skillnader i egenskaperna hos de använda materialen (böjbar nitinolglödtråd vs okomprimerbar insektsstift) eller på olika tryck som levereras till larverna (insektsstiftens tryckvärde rapporterades inte).
Utvecklingen av en mekanisk nociception-analys för Drosophila larver har gjort det möjligt för fältet att upptäcka att olika mekaniska sensoriska jonkanaler och neurala kretsar förmedlar mekanisk nociception5,6,16,17. Studien av den mekaniska överkänsligheten (allodyni och hyperalgesi) har dock släpat efter, jämfört med sensibilisering av andra sensoriska metoder - värme7,8,10,13,14, kall9och kemisk3. Denna fördröjning kan delvis bero på frånvaron av lämpliga mekaniska sonder som kan generera ett fullständigt responsområde som sträcker sig underredet till suprathresholdtryck. Av särskild betydelse, särskilt för att bedöma mekanisk allodyni, är subthreshold sonder som inte framkallar en aversiv rullande svar från oskadda larver. Betydelsen av våra förbättrade mekaniska sonder är att de kan tillverkas för att spänna över harmlösa stimuli (subthreshold ~174 kPa-200 kPa) eller det låga till höga skadliga intervallet (suprathreshold ~225 kPa till ~5,116 kPa). Här demonstrerar vi med hjälp av nitinol von Frey-liknande filament att Drosophila larver utvecklar både mekanisk allodyni och mekanisk hyperalgesi efter UV-bestrålning. Den mekaniska sensibiliseringen visar vissa skillnader jämfört med termisk sensibilisering. Både uppkomsten och toppen av mekanisk sensibilisering är tidigare (~ 4 h) jämfört med termisk (värme) sensibilisering (~ 8 h för hyperalgesi och ~ 24 h för allodynia)7. Dessutom är den mekaniska allodyni och hyperalgesi samtidiga (båda toppar på ~ 4 h). Dessutom, medan värmesensibilisering (allodyni och hyperalgesi) löser helt vid senaretidpunkter 7, uppvisade mekanisk överkänslighet en lång svans som förblev något över baslinjen. Kall sensibilisering i Drosophila innebär en förändring i kall-framkallade beteenden9 och uppkomsten av nya kall-framkallade beteenden - ett fenomen som inte observeras med mekanisk stimulering. Dessa skillnader i inset, varaktighet och observerade beteenden tyder på att varje sensorisk modalitet kan styras av olika signaleringsvägar. Att kombinera sensibiliseringsanalysen som beskrivs här med de kraftfulla genetiska verktyg som finns i Drosophila bör möjliggöra en exakt genetisk dissekering av den mekaniska överkänslighet (allodyni och hyperalgesi) observerad.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Thomas Wang för att ha utvecklat prototypen von Frey filaments, Patrick J. Huang för att förbättra den mekaniska sondanalysen, Bloomington Drosophila Stock Center för kontrollen (w1118) och ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP fluglager och Galko labmedlemmar för att kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av R21NS087360 och R35GM126929 till MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22x22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22x40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
