Summary
El objetivo de este protocolo es mostrar cómo realizar un ensayo mejorado para la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. Utilizamos el ensayo aquí para demostrar que la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) existe en las larvas de Drosophila.
Abstract
Los ensayos publicados para la nocicepción mecánica en Drosophila han dado lugar a evaluaciones variables del comportamiento. Aquí, fabricamos, para su uso con larvas de Drosophila, filamentos metálicos personalizados de aleación de níquel-titanio (nitinol). Estas sondas mecánicas son similares a los filamentos von Frey utilizados en vertebrados para medir la nocicepción mecánica. Aquí, demostramos cómo hacer y calibrar estas sondas mecánicas y cómo generar una dosis-respuesta conductual completa desde estímulos subthreshold (rango inocuo o no nocivo) hasta estímulos suprathreshold (rango nocivo bajo a alto). Para demostrar la utilidad de las sondas, investigamos la hipersensibilidad inducida por daños tisulares en larvas de Drosophila. Todavía no se han establecido alodiciones mecánicas mecánicas (hipersensibilidad a un estímulo mecánico normalmente inocuo) e hiperalgesia (respuesta exagerada a un estímulo mecánico nocivo) en larvas de Drosophila. Usando sondas mecánicas que normalmente son inocuas o sondas que normalmente provocan un comportamiento aversivo, encontramos que las larvas de Drosophila desarrollan hipersensibilidad mecánica (tanto alodimonia como hiperalgesia) después de daño tisular. Por lo tanto, las sondas mecánicas y el ensayo que ilustramos aquí probablemente serán herramientas importantes para diseccionar los mecanismos moleculares/genéticos fundamentales de la hipersensibilidad mecánica.
Introduction
Las larvas de Drosophila presentan un comportamiento ondulante aversivo característico cuando se exponen a diferentes estímulos nocivos: térmico1,mecánico2y químico3. Este comportamiento es claramente distinto de la locomoción normal. Aquí describimos un ensayo mecánico mejorado que se puede utilizar para evaluar la nocicepción mecánica y la sensibilización mecánica.
En un estudio reciente, fabricamos filamentos similares a von Frey usando alambres de nitinol4. Las sondas que ejercen diferentes fuerzas y presiones se hicieron variando las longitudes y diámetros de los cables nitinoles que forman cada sonda. Las sondas mecánicas fueron calibradas y los valores de fuerza medidos (en milnewton, mN) se convirtieron a presión (kilopascal, kPa), basado en el área de la punta de cada sonda4. La fabricación personalizada de sondas mecánicas nos permitió generar presiones de subtema (≤200 kPa) a suprathreshold (225 kPa a 5318 kPa), lo que podría, en principio, ser beneficioso para estudiar la hipersensibilidad mecánica. Usando estos filamentos mecánicos mejorados similares a von Frey, mostramos que la presión4,a diferencia de la fuerza previamente examinada2,5,6 se correlaciona más consistentemente con la capacidad de respuesta conductual aversiva en larvas de Drosophila. El ensayo mecánico mejorado descrito aquí también ayudó a identificar un factor de crecimiento endotelial vascular conservado (VEGF) receptor tirosina quinasa señalización de una vía que regula la nocicepción mecánica en moscas y ratas4.
La alodinia mecánica y la hiperalgesia, dos modalidades de hipersensibilidad, son relativamente infraprestigadas en larvas de Drosophila, en comparación con las modalidades térmicas (calor y frío) y sensorial química3,7,8,9,10. Esto es probablemente debido a la falta de sondas mecánicas específicas que van desde estímulos inocuos hasta el alto rango nocivo2,5,6. Un estímulo normalmente inocuo que provoca el comportamiento típico de laminación aversiva después de que las larvas de Drosophila experimentan daño tisular3,7 se conoce como alodinia. Una respuesta rodante exagerada a un estímulo típicamente nocivo se conoce como hiperalgesia7. Los estímulos nocivos se definen como aquellos que provocan daño tisular y pueden activar nociceptores11. Los estímulos nocivos entregados a las larvas de Drosophila dañan la epidermis de barrera, las neuronas sensoriales nociceptivas periféricas3,4,7o ambas.
En este artículo, demostramos cómo fabricar y calibrar a medida sondas mecánicas similares a von Frey que son apropiadas para larvas de Drosophila. Además, mostramos cómo utilizar estas sondas para avisar de respuestas nociceptivas mecánicas en larvas de Drosophila. Por último, demostramos además la utilidad de estas sondas utilizándolas para demostrar la presencia de hipersensibilidad mecánica, tanto alodinia como hiperalgesia, tras el daño tisular en larvas de Drosophila (ver Resultados representativos).
Protocol
1. Construcción mecánica de sondas
- Corte cada filamento nitinol (Figura 1B), perpendicular a su eje largo, a la longitud especificada (Figura 1M–N) utilizando un cortador de alambre pequeño (Figura 1C). Los filamentos vienen en tres diámetros preestajustados diferentes (Figura 1B).
NOTA: Las longitudes especificadas aquí son una guía para lograr las presiones aproximadas indicadas, utilizando un protocolo similar para la construcción del montaje. En última instancia, independientemente de la longitud del corte del filamento, y la profundidad del agujero en el soporte, los filamentos deben medirse/calibrarse en un equilibrio para obtener el valor exacto de fuerza/presión. - Examine la punta del filamento bajo un estereomicroscopio para asegurarse de que no queden bordes afilados o irregulares, ya que estos podrían causar daños tisulares en la piel de las larvas e interferir con la calibración.
- Alisar manualmente los bordes afilados de la sonda mecánica utilizando una piedra afilada hasta que no persistan irregularidades agudas(Figura 1D).
- Haga un agujero hacia el extremo de un palo de paleta de madera(Figura 1E)utilizando una aguja hipodérmica (ver Tabla de Materiales). Inserte la aguja al menos a la mitad de la altura del palo de paleta (Figura 1E). Esto crea una cámara para la inserción del filamento nitinol.
- Aplique pegamento de madera en un solo filamento de nitinol(Figura 1F)e inserte el filamento recubierto de pegamento en la ranura de la aguja en un palo de paleta de madera (Figura 1G). Dejar secar por ~ 5 h.
- Calibra cada sonda mecánica presionándola contra una báscula hasta que la sonda mecánica se doble(Figura 1H-L). Este es el punto de fuerza máxima que se puede registrar en gramos. Dependiendo de los diámetros de filamento (preestajustes) y longitudes (determinadas por el usuario) se puede generar un rango completo de fuerzas y presiones.
- Convierta la masa registrada en el paso 1.6 para forzar en milnewton (mN) usando la fórmula f = ma (La fuerza es igual a la masa multiplicada por la aceleración gravitacional). f: fuerza; m: masa; a: aceleración gravitacional (9,8 m/s2) (Figura 1M).
- Por último, convierta la fuerza calculada en presión (fuerza/área) en kilopascal (kPa) dividiendo la fuerza medida por la superficie de la punta del filamento (Figura 1M). Para calcular el área, convierta el diámetro de los diferentes filamentos de nitinol de pulgadas (0,04", 0,06" y 0,08") a centímetros. A continuación, πr2 (donde, r = el radio de filamento nitinol) determina el área (véase la Figura 1M). La preparación de múltiples sondas utilizando filamentos de diferentes diámetros y longitudes generará un conjunto completo que abarcará el rango de respuesta para las larvas de Drosophila (conjunto de muestras que se muestra en la Figura 1N).
NOTA: Compruebe cada sonda mecánica al menos cada 3-4 semanas. Cuando la presión se desvía en más de ± 3% de la medida original, se debe fabricar una nueva sonda mecánica.
2. Preparación de larvas
- Aumentar la cepa de control (w1118) progenie larvaria o larvas que contienen los transgenes ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (para visualizar el daño a las neuronas sensoriales) en los alimentos estándar en una incubadora de 25 °C. Por lo general, las poblaciones se mantienen rutinariamente a 18 °C, pero tanto los padres como las crías larvarias se crían a 25 °C en alimentos estándar de harina de maíz para experimentos.
NOTA: Las moscas adultas (cinco machos y diez hembras, relación 1:2) se mantienen en los viales de mosca, para permitir la puesta de huevos, durante aproximadamente 24 h. El tiempo después de la puesta de huevos (AEL) comienza a partir de cuando se retiran los adultos. - Recoge las terceras larvas instar, después de aproximadamente 96 h de puesta de huevos, chorreando suavemente agua del grifo en el alimento blando que contiene las larvas. Las larvas errantes que han dejado la comida, o que han perdurado espículas anteriores o posteriores, son demasiado grandes/viejas para este ensayo. Las larvas de segunda estrella (~ menos de 4 mm de longitud) son demasiado pequeñas.
- Vierta el contenido de los alimentos de mosca suave en una placa Petri de tamaño estándar limpio (100 mm x 15 mm).
- Usando fórceps, ordene las larvas de tercio medio (ver Figura 2A)de larvas más pequeñas (segunda instar y tercera instar temprana) o más grandes (tardías o errantes terceras instar). Se recomienda una manipulación suave con fórceps para evitar cualquier daño tisular a las larvas.
NOTA: La transferencia utilizando fórceps se basa principalmente en la tensión del agua y no en la aplicación de presión a las larvas con las cuchillas de los fórceps. Una alternativa al uso de fórceps para maniobrar larvas son los pinceles suaves. Con cualquiera de las herramientas, el usuario debe practicar la transferencia de los animales, con el fin de no causar daños tisulares no deseados que podrían complicar las mediciones de comportamiento. - Transfiera las larvas de la tercera estrella, utilizando fórceps, a una pequeña placa de Petri (30 mm x 15 mm) que contenga un pequeño tapón de alimento para moscas humedecido con agua a temperatura ambiente. Mantenga las larvas en la pequeña placa de Petri hasta que se realicen los experimentos, pero no más de 20 minutos.
NOTA: Generalmente, transferir 20-30 larvas al tapón de alimentos dará un número adecuado para 20 minutos de ensayos conductuales.
3. Ensayo mecánico de nocicepción
- Coloque una larva instar de mediados del tercio (usando fórceps) en una delgada almohadilla de vinilo negro u oscuro bajo un estereomicroscopio de campo brillante. El color oscuro proporciona un contraste que mejora la visualización de la larva. Es preferible tener una pieza libremente móvil de vinilo oscuro porque permite al usuario alinear la larva sin tocarla ni lastimarla.
- Coloque las luces de fibra óptica entre las lentes objetivo del microscopio y la almohadilla de vinilo negro u oscuro; esto permitirá una iluminación adecuada de alto contraste para ver la larva.
- Deseche las larvas que no presenten locomoción normal después de la transferencia a la almohadilla. Estos pueden interferir con la respuesta conductual nociceptiva normal. Para obtener una locomoción normal, consulte Vídeo 1.
- Limpie, usando una toalla de papel, cualquier exceso de agua que rodee la larva que pueda hacer que la larva flote en la almohadilla de vinilo.
- Oriente la larva moviendo la almohadilla de vinilo oscuro. La cabeza/boca de la larva debe apuntar a la izquierda si usted es diestro y viceversa si usted es zurdo (Figura 2A-B).
- Aplique la sonda mecánica elegida, normalmente durante 1-2 s, en el lado dorsal posterior de la larva en aproximadamente el segmento abdominal A8 (ver Figura 2B),hasta que la sonda se doble y elicto la cantidad de presión medida previamente(Figura 2C). Es importante que la sonda presione contra la superficie dorsal de la larva y comprima las larvas en la almohadilla subyacente en el punto de contacto de la sonda.
NOTA: En el punto de contacto entre la punta del filamento nitinol y la cutícula dorsal-epidermis, las sondas inferiores a 2.300 kPa, se doblan principalmente sin penetrar la cutícula y los tejidos subyacentes. Estas sondas rara vez afectan a la mortalidad larvaria4. A presiones más altas (>5.000 kPa) las sondas se doblan y, ocasionalmente, penetran en la cutícula y los tejidos subyacentes. La punción de las larvas afecta la supervivencia larvaria4 y, si se observa, estas larvas se desechan típicamente del análisis conductual. - Registre la respuesta conductual de cada larva. Se indica una respuesta nociceptiva positiva(Video 2)si la larva muestra un rollo completo de 360° a lo largo del eje de su cuerpo dentro de 3 s. Otras respuestas (intentar girar, gatear rápidamente y mover) se consideran negativas para los propósitos de este ensayo.
NOTA: Las larvas estimuladas con un estímulo mecánico de subtrama (200 kPa) no provocaron la típica respuesta nociceptiva o rodante (Video 3). Algunas larvas mostraron respuestas táctiles rápidas o ligeras, como cambios en la dirección del movimiento. - Deseche la larva y prepare la siguiente para el ensayo, repitiendo los pasos 3.1 a 3.7.
- Repita los pasos 3.1–3.7 hasta que se alcance el número deseado de larvas (aquí se utilizaron de tres a seis conjuntos de n = 10 larvas para cada sonda).
NOTA: Cuando se utilizan sondas mecánicas de menor presión (174-462 kPa), el ensayo tomará más tiempo por larva. Esto se debe a que la punta de filamentos más largos oscila más, lo que hace más difícil meter la larva en el centro del segmento A8. La práctica es necesaria con estas sondas.
4. Microscopía confocal para evaluar la morfología neuronal
- Coloque una larva (de genotipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP para etiquetar neuronas sensoriales) previamente estimulada con un filamento nitinol en una cámara de éterización dentro de un frasco de Coplin que contiene un vaso de precipitados de 10 ml que lleva una bola de algodón empapada con ~1 ml de éter dietil. Deja que la larva se siente en la cámara durante ~5 min.
NOTA: En un estudio anterior publicado por nuestro grupo12se proporciona un protocolo detallado para la eterización. - Enjuague la larva suavemente de la cámara de éterización en una pequeña placa de Petri.
- Tenga listo una diapositiva de microscopio, dos pequeños cubrebotas (22 x 22 mm) y un clip de cubierta largo (22 x 54 mm) (ver Tabla de materiales).
- Añadir pequeñas gotas de solución de éter:aceite (1:5 relación de éter etílico a solución de aceite de halocarbono, ver Tabla de Materiales)a ambos extremos de la diapositiva, luego coloque los pequeños cubrecabezas en la parte superior de las pequeñas gotas. Esta disposición crea una pequeña brecha espacial donde la larva puede caber.
NOTA: Presione los pequeños puntos de cubierta contra la diapositiva del microscopio hasta que sea difícil de deslizar. - Añadir algunas gotas de ether:solución de aceite en el medio de la diapositiva del microscopio y luego colocar la larva, usando fórceps, en el centro de la diapositiva del microscopio (entre las pequeñas manchas de cubierta). Asegúrese de que el eje anteroposterior de la larva es paralelo al lado corto de la diapositiva y que el lado dorsal está mirando hacia arriba.
- Cubra las larvas con la mancha de cubierta larga colocada en la parte superior de la larva y las dos cubiertas más pequeñas.
NOTA: Presione generosamente el punto de cubierta largo hasta que la larva esté casi plana. - Imagen del segmento A8 de la larva utilizando un microscopio confocal (ver Tabla de materiales)utilizando longitud de onda láser 488 (GFP).
NOTA: Imagen de la larva inmediatamente porque la anestesia a través del éter se desvanecerá rápidamente (~5-10 min) y la larva se despertará y se moverá, lo que complicará más imágenes. - Capture imágenes de pila Z a una resolución de 1024 x 1024 píxeles utilizando una lente objetivo seca de apertura numérica (NA) de 20x a 1x zoom, tamaño de paso de 1,5 μm.
5. Cuantificación del daño tisular
- Recopile y convierta las imágenes de pila de la serie Z, de la sección 4.8, en una sola proyección Z (un aplanamiento de varias imágenes tomadas en diferentes planos focales en una sola imagen compuesta). Esto se puede realizar utilizando software disponible comercialmente (por ejemplo, Olympus Fluoview) o cualquier plataforma de código abierto equivalente, por ejemplo, Fiji/Image J. Guarde la proyección Z única en el formato TIFF.
- Abra el programa de análisis de imágenes Fiji/ImageJ.
- Haga clic en Archivo, en la barra de menús, y seleccione Abrir desde la ventana que se muestra.
- Seleccione la proyección de una sola imagen almacenada, guardada en el formato TIFF, que desea analizar.
- Haga clic en Editar, en la barra de menús y seleccione la opción Invertir en la ventana que se muestra.
- Haga clic en la imagen, en la barra de menús, luego seleccione Ajustar, desde la ventana que se muestra, y finalmente seleccione el Brillo / Contraste opción.
- Seleccione la opción Forma a mano alzada de la barra de herramientas para medir el área del hueco (si existe).
- Haga clic en Analizar, en la barra de menús y seleccione la opción Medir. Esto mostrará el área del hueco o la herida.
Representative Results
Desarrollamos sondas mecánicas personalizadas, utilizando filamentos nitinoles(Figura 1A,N),para provocar comportamientos evocados mecánicamente y generamos una curva de respuesta a dosis conductual completa utilizando sondas mecánicas inocuas y nocivas de intensidad variable(Figura 2D)que demuestran que estas sondas se pueden utilizar para estudiar la nocicepción mecánica basal (en ausencia de lesión).
Nuestros resultados de ensayo conductual determinaron que las sondas que ejercen presiones inferiores a 200 kPa (~1,57 mN) (Figura 1M),cuando se aplican a larvas de Drosophila, no provocan una respuesta de balanceo aversiva(Figura 2D y Video 3). Como era de esperar, estas sondas mecánicas subthreshold o no nocivas (175 kPa o 200 kPa) no provocaron daño visible del tejido neuronal(Figura 2E). Debido a que no inducen daño, tales sondas podrían ser útiles para evaluar la alodinia mecánica (hipersensibilidad a un estímulo mecánico normalmente no no nocivo). Por el contrario, las sondas suprarretiendas o nocivas (de 462 kPa a 5.116 kPa), provocaron una respuesta conductual aumentada(Figura 2D)de manera dependiente de la dosis, con las presiones más altas que provocan respuestas conductuales más fuertes. Como se preveía, la presión mecánica supratenso también indujo daño tisular dependiente de la dosis a las propias neuronas sensoriales periféricas(Figura 2E). El área medida de daño tisular (en μm2 ± desviación estándar) tomada de cuatro larvas para cada grupo fue: 2,051.03 ± 703.81 (462 kPa), 5,102.29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) y 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Por lo tanto, las presiones superiores o iguales a 462 kPa (~63 mN), que evocan una respuesta laminada aversiva (en el 25% o más de las larvas) y causan daño visible del tejido neuronal(Figura 2E),podrían ser apropiadas para estudiar hiperalgesia mecánica (hipersensibilidad a estímulos mecánicos normalmente nocivos). Las sondas mecánicas nociceptivas (≥462 kPa) siempre inducen daño tisular (n = 10, evaluado cualitativamente) pero no siempre provocan una respuesta laminada aversiva.
Para evaluar la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia), utilizamos un modelo larvario de Drosophila bien establecido de sensibilización nociceptiva que utiliza irradiación de luz ultravioleta (UV) para inducir daño tisular7,12. Este ensayo ha ayudado a diseccionar los mecanismos genéticos y celulares de la hipersensibilidad nociceptiva térmica8,9,10,13,14,15. Para determinar si el tratamiento UV causa alodinia mecánica, las larvas de control de tercio instar medio(w1118)fueron irradiadas simuladas o irradiadas uv (15-20 mJ/cm2) (Figura 3A). A continuación, las larvas se probaron de forma conductual a las 2 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h después del tratamiento con una sonda mecánica normalmente subtenida (200 kPa, 1,57 mN). Aproximadamente el 20% de las larvas respondieron tan pronto como 2 h después del tratamiento uv, mientras que el 50% respondió a 4 h, en comparación con el 6,6% y el 8,3% de los animales irradiados uv simulados, respectivamente (Figura 3B). Esto indica que el daño tisular inducido por rayos UV causa alodinia mecánica a 4 h después de la irradiación. En los momentos posteriores (8 h, 16 h y 24 h) la respuesta conductual de las larvas tratadas con UV estaba en el rango de 16%-20% de los respondedores (media promedio de n = 3-6 juegos de 10 larvas cada una), ligeramente aumentada (pero no estadísticamente significativa) en comparación con el grupo de control simulado-irradiado (en el rango de 3%-6% de los respondedores, media promedio de n = 3–6 juegos de 10 larvas cada uno) (Figura 3B).
Para investigar la hiperalgesia mecánica, se utilizó una presión suprarrestenscente (462 kPa, 3,63 mN), que normalmente induce una respuesta laminante aversiva en ~20% de larvas(Figura 2D)y causa daño neuronal del tejido(Figura 2E). Aplicamos la sonda de 462 kPa en el lado dorsal de las larvas con o sin daño tisular inducido por uv(Figura 3A). Encontramos que las larvas sondearon a 4 h, 8 h y 16 h después del tratamiento UV mostraron un aumento significativo en la respuesta laminada aversiva, siendo 4 h el pico de la hipersensibilidad conductual (~60% sensible); animales irradiados uv simulados mostraron un ~27% de respuesta aversiva (Figura 3C). Al igual que la alodinia mecánica, la respuesta conductual a 8 h, 16 h y 24 h de animales tratados con UV (en el rango de 36%-42%) era estadísticamente indistinguible de las larvas no tratadas (en el rango de 20%-26%). Las larvas en la tercera etapa de la estrella mostraron una ligera disminución de la respuesta conductual basal en comparación con la tercera etapa de la estrella media. Hipotemos que esto podría ser por el aumento del tamaño de las larvas(Figura 2A)o el aumento del espesor de la cutícula que cubre el cuerpo. Este hecho podría explicar por qué en una etapa posterior de desarrollo el tratamiento UV no induce una mayor sensibilización mecánica, como se observó 4 h después del tratamiento UV.
En conjunto, nuestros resultados indican que las larvas de Drosophila desarrollan alodinia mecánica e hiperalgesia mecánica después del daño tisular inducido por los rayos UV. La hora punta de la alodinia mecánica y la hiperalgesia es la misma, 4 h después del tratamiento uv; sin embargo, la hiperalgesia mecánica tiene una cola temporal más pronunciada, ya que vuelve a la línea de base más lentamente en comparación con la alodinia mecánica.
Figura 1: Desarrollo de una herramienta similar a Von Frey para evaluar la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. (A) Imagen de una sonda mecánica utilizada para estudiar la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. (B) Los filamentos de nitinol y sus diámetros relativos se muestran a escala relativa. (C) Imagen del cortador de alambre diagonal utilizado para cortar los filamentos de nitinol. (D) Suavizando los bordes afilados del filamento nitinol cortado con una piedra afilada. (E) Aguja hipodérmica utilizada para hacer un agujero en el mango del palo de paleta de madera de la sonda. La punta de la aguja necesita alcanzar al menos la mitad de la altura del bastón para una inserción segura del filamento. (F–G) Fijación del filamento de nitinol encolado en un mango de palo de paleta de madera con agujero de inserción. (H–L) Calibración de sondas mecánicas presionándolas contra una báscula. (M) Valores de fuerza (en mN) y presión (en kPa) generados por diferentes sondas mecánicas. La longitud de cada filamento de nitinol utilizado para construir las sondas (P1–P10; P: sonda) se detalla en centímetros (cm). (N) Una imagen de un conjunto completo de sondas mecánicas, que van desde 174 kPa a 5.116 kPa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo mecánico de nocicepción: Los filamentos similares a von Frey generan una curva de dosis-respuesta de comportamiento rodante aversivo y causan daño tisular a las neuronas sensoriales. (A) Imágenes de las diferentes etapas (segunda y tercera instar) de larvas de Drosophila. Barra de escala: 2 mm. (B) Caricatura de la vista dorsal de la tercera instar Larvas de Drosophila. El punto rojo indica el segmento abdominal donde se aplica la sonda mecánica. T: segmento torácico; R: segmento abdominal. Otros puntos de referencia anatómicos están etiquetados. (C) Caricatura del ensayo: Una sonda mecánica se aplica al lado dorsal de la larva hasta que se dobla contra la superficie de abajo y luego se mantiene durante 2 s. Si la presión es lo suficientemente alta, esto provoca una respuesta de balanceo aversiva al ser liberada. (D) Respuesta de dosis conductual; cada punto azul representa el porcentaje de larvas que respondieron, con laminación aversiva, a la estimulación mecánica dentro de un conjunto de 10 animales. Trama de violín del porcentaje de comportamiento rodante aversivo inducido por diferentes sondas mecánicas. kPa: kilopascales. Las parcelas de caja representan mediana (verde), bigotes (rojo) representan los percentiles 10 y 90. (E) Daño tisular: Las terceras larvas instar (de genotipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP para etiquetar neuronas sensoriales nociceptivas) fueron sondeados en el segmento dorsal A8 con las presiones indicadas. A continuación, se examinaron las neuronas sensoriales ddaC de clase IV etiquetadas fluorescentemente (a través de la línea media dorsal) (ver secciones 4 y 5). Las áreas blancas (asteriscos rojos) representan huecos o daño tisular. Barra de escala: 100 μm. En el panel B, la larva se muestra en la vista dorsal, mientras que en C es la vista lateral. Las sondas mecánicas presionadas contra el lado dorsal cutícula-epidermis de la larva producen una depresión similar al bolsillo en el punto de contacto de la punta de la sonda y las áreas circundantes. La sólida línea negra curvada hacia el lado ventral es la parte superior del bolsillo, mientras que la línea lateral gris discontinua representa el lado lateral y la parte inferior del bolsillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Hipersensibilidad mecánica después de daño UV. (A) Esquema del diseño experimental para probar la sensibilización. A mediados del tercio de la estrella se trataron simulados (no UV) o irradiados uv. A continuación, el ensayo mecánico de nocicepción se realizó en diferentes puntos de tiempo (2 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h) tras simulacro de tratamiento o irradiación. (B) Alodinia mecánica: El porcentaje de larvas que exhiben laminación aversiva después de sondear con un estímulo mecánico normalmente subthreshold o no nocivo (200 kPa, 1,57 mN) en los puntos de tiempo indicados después del simulacro de tratamiento o irradiación UV. (C) Hiperalgesia mecánica: El porcentaje de larvas que exhiben laminación aversiva después de sondear con un estímulo mecánico normalmente suprarrespetuoso o nocivo (462 kPa, 3,63 mN) en los puntos de tiempo indicados después del simulacro o la irradiación UV. Las barras de error indican que la prueba tsin asfaltado de dos colas se utilizó para el análisis estadístico: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: no significativo. Cada punto rojo, en los paneles B y C, representa la proporción media de 10 larvas, n = 3-6 conjuntos por punto de tiempo/condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Locomoción normal de larvas de Drosophila. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Estimulación mecánica nociva de larvas de Drosophila. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Video 3: Subtramestre la estimulación mecánica de las larvas de Drosophila. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
Discussion
Modificamos un ensayo mecánico establecido1,2,16 utilizando sondas mecánicas personalizadas fabricadas a partir de filamentos de nitinol. Esta aleación metálica nos permite utilizar filamentos de menor diámetro que son apropiados para el tamaño de las larvas de Drosophila. Los monofilamentos basados en líneas de pesca han dominado el campo de la nocicepción mecánica de mosca hasta la fecha2,5,6,16. Nuestros filamentos de nitinol mantienen su forma y presión medida durante aproximadamente ~ 3-5 meses (en nuestra experiencia). Al variar la longitud y el diámetro de los filamentos de nitinol, el usuario puede generar una amplia gama de presiones que abarcan desde la subtención hasta una respuesta de rodadura casi completa. En particular, hacer sondas de subtramo es más simple con los filamentos de nitinol de menor diámetro. Usando estas sondas, encontramos que la presión, en lugar de la fuerza, provoca respuestas conductuales nocifensivas más consistentes4. Aquí demostramos, utilizando una sensibilización nociceptiva inducida por UV bien establecida modelo7,10,13,que estos filamentos también son una herramienta útil para estudiar la hipersensibilidad mecánica: la alodinia y la hiperalgesia.
Estudios previos utilizando sondas mecánicas fabricadas a partir de la línea de pesca han dado lugar a una cierta variabilidad en la capacidad de respuesta conductual2,6,16,17. Varios factores pueden explicar esto. En primer lugar, porque la presión es la variable importante, el pulido de la punta del filamento para que esté redondeada y no tenga bordes afilados es fundamental. En segundo lugar, informar de valores de presión en lugar de sólo fuerza es importante para la reproducibilidad de los experimentos, porque diferentes sondas mecánicas que generan fuerzas similares pueden provocar presiones dispares4. En tercer lugar, es fundamental aplicar sólo una estimulación mecánica por larva utilizando sondas nocivas, ya que tales sondas producen un daño tisular dependiente de la dosis a nivel epidérmico4 y neuronal sensorial (Figura 2E). Un segundo estímulo mecánico nocivo o posterior, después de que se haya inducido daño tisular, podría afectar concebiblemente la función de las neuronas sensoriales periféricas afectadas y provocar una respuesta conductual alterada. En otro estudio, las larvas estimuladas dos veces con sondas mecánicas nocivas mostraron principalmente una respuesta conductual mejorada5,lo que sugiere el desarrollo de una sensibilización mecánica aguda (hiperalgesia), que podría resultar del daño tisular provocado por el primer estímulo mecánico nocivo. Por el contrario, otros autores6 informaron de una respuesta conductual mixta (aumentada o disminuida), lo que indica que la respuesta conductual alterada podría deberse al daño/disfunción del tejido neuronal. Estimular cada larva sólo una vez elimina la posible varianza en las respuestas conductuales resultantes de la sensibilización o el daño tisular. En cuarto lugar, estimulamos mecánicamente el segmento A8, que es más posterior que estudios anteriores (áreas preferidas A3–A4)2,5,16. Las sondas entre ~3,900 kPa y 5,300 kPa aplicadas a cualquiera de los segmentos A2 o A8 no mostraron ninguna diferencia de comportamiento4. Además, el A8, en comparación con el A2-A4, es más fácil de estimular con sondas mecánicas que generan presiones más bajas (<300 kPa) porque la larva es más delgada en esta región y por lo tanto se comprime más fácilmente. Otros estudios mostraron que la estimulación mecánica nociva del extremo posterior de la larva (entregada por un pasador rígido de insectos, sostenido con fórceps) evocaba principalmente locomoción hacia adelante, en lugar de una respuesta aversiva o rodante18. Esta respuesta conductual diferente podría deberse a diferencias en las propiedades de los materiales usados (filamento nitinol doblable vs pasador de insecto incompresible) o a diferentes presiones entregadas a las larvas (no se informó del valor de presión del pasador de insectos).
El desarrollo de un ensayo mecánico de nocicepción para larvas de Drosophila ha permitido al campo descubrir que diferentes canales mecánicos sensoriales de iones y circuitos neuronales median la nocicepción mecánica5,6,16,17. Sin embargo, el estudio de la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) se ha retrasado, en comparación con la sensibilización de las otras modalidades sensoriales — calor7,8,10,13,14,frío9y químico3. Este retraso puede deberse en parte a la ausencia de sondas mecánicas adecuadas que pueden generar un rango de respuesta completo que abarca el subtenimiento a presiones supratensiones. De particular importancia, especialmente para evaluar la alodynia mecánica, son sondas subthreshold que no provocan una respuesta laminadora aversiva de larvas no injuradas. La importancia de nuestras sondas mecánicas mejoradas es que se pueden fabricar para abarcar estímulos inofensivos (subtensiones ~174 kPa–200 kPa) o el rango bajo a alto nocivo (suprathreshold ~225 kPa a ~5,116 kPa). Aquí, demostramos usando los filamentos tipo nitinol von Frey que las larvas de Drosophila desarrollan alodinia mecánica e hiperalgesia mecánica después de la irradiación UV. La sensibilización mecánica muestra algunas diferencias en comparación con la sensibilización térmica. Tanto el inicio como el pico de sensibilización mecánica son anteriores (~4 h) en comparación con la sensibilización térmica (calor) (~8 h para hiperalgesia y ~24 h para la alodinia)7. Además, la alodinia mecánica y la hiperalgesia son concomitantes (ambos pico a ~4 h). Además, mientras que la sensibilización térmica (alodinia e hiperalgesia) se resuelve por completo en los puntos de tiempoposterior 7,la hipersensibilidad mecánica exhibió una larga cola que se mantuvo ligeramente por encima de la línea de base. La sensibilización fría en Drosophila implica un cambio en los comportamientos evocados en frío9 y la aparición de nuevos comportamientos evocados por el frío, un fenómeno que no se observa con estimulación mecánica. Estas diferencias en los comportamientos de inicio, duración y observado sugieren que cada modalidad sensorial puede ser controlada por diferentes vías de señalización. La combinación del ensayo de sensibilización descrito aquí con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila debería permitir una disección genética precisa de la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) observada.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Thomas Wang por desarrollar el prototipo de filamentos von Frey, Patrick J. Huang por mejorar el ensayo de sonda mecánica, el Bloomington Drosophila Stock Center for the control(w1118)y ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP fly stocks, y los miembros del laboratorio Galko por leer críticamente el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por R21NS087360 y R35GM126929 a MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22x22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22x40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
