Summary
Ulike cerebellar regioner har blitt implisert for å spille en rolle i distinkte atferdsmessige utganger, men de underliggende molekylære mekanismene forblir ukjente. Dette arbeidet beskriver en metode for å reprodusere og raskt dissekere cerebellar cortex av halvkule, fremre og bakre regioner i vermis, og de dype cerebellar kjernene for å sonde for molekylære forskjeller ved å isolere RNA og teste for forskjeller i genuttrykk.
Abstract
Cerebellum spiller en viktig rolle i flere viktige funksjoner, inkludert kontroll av bevegelse, balanse, kognisjon, belønning og påvirkning. Avbildningsstudier indikerer at distinkte cerebellar regioner bidrar til disse forskjellige funksjonene. Molekylære studier som undersøker regionale cerebellar forskjeller henger som de er for det meste gjort på hele cerebellar ekstrakter og dermed maskere eventuelle forskjeller på tvers av spesifikke cerebellar regioner. Her beskriver vi en teknikk for å reprodusere og raskt dissekere fire forskjellige cerebellar regioner: den dype cerebellar nuclei (DCN), fremre og bakre vermal cerebellar cortex, og cerebellar cortex av halvkule. Dissekering av disse distinkte regionene gjør det mulig å utforske molekylære mekanismer som kan underveie deres unike bidrag til balanse, bevegelse, påvirkning og kognisjon. Denne teknikken kan også brukes til å utforske forskjeller i patologisk følsomhet i disse spesifikke regionene på tvers av ulike musesykdomsmodeller.
Introduction
Cerebellum inneholder over halvparten av nevronene i hjernen og har historisk blitt referert til som et motorisk kontroll- og balansesenter i hjernen1. Mer nylig har studier vist at cerebellum spiller en nøkkelrolle i ulike andre funksjoner, inkludert kognisjon, belønningsbehandling og påvirker2,3,4,5.
Cerebellum har godt beskrevet anatomi: cortex-regionen består av granulat, Purkinje og molekylære lag. Granulatceller danner granulatcellelaget og sender inngang via parallelle fibre til Purkinje-celledrittene i det molekylære laget som også mottar innspill fra klatrefibre som stammer fra den dårligere oliven. Purkinje celler sender hemmende projeksjoner til celler i den dype cerebellar kjernen (DCN), som tjener som hovedutgangen fra cerebellum. Utgangen av denne cerebellar kretsen er ytterligere modulert av aktiviteten til de hemmende internuronene i cerebellar cortex, inkludert Golgi, stellate og kurvceller4. Denne cerebellar funksjonelle enheten er fordelt over alle lobuliene i cerebellar cortex. Til tross for denne relativt ensartede kretsen over cerebellum, indikerer bevis fra human nevroimaging litteratur og pasientstudier funksjonell heterogenitet av cerebellum6,7.
Cerebellar cortex kan deles inn i to hovedregioner: midtlinjedefinert vermis og laterale halvkule. Vermis kan videre deles inn i fremre og bakre lobules. Disse distinkte områdene i cerebellum har blitt involvert i å bidra til forskjellige atferd. Oppgavefremkalte eller oppgavefrie aktivitetsmønstre impliserte at fremre regioner i vermis bidrar mer til motorisk funksjon mens bakre vermis bidrar mer til kognisjon6,7. Vermis er også knyttet til påvirkning og følelser, mens cerebellar halvkule bidrar til utøvende, visuell-romlig, språk og andre mnemoniske funksjoner8. I tillegg ga anatomiske studier bevis på at funksjonelt distinkte cerebellar regioner er forbundet med forskjellige kortikale regioner9. Lesion-symptom kartlegging viste at pasienter med slag som påvirker de fremre lobuliene (som strekker seg inn i lobule VI) hadde dårligere ytelse på fine motoriske oppgaver, mens pasienter med skade på bakre lobe regioner og halvkule viste kognitive underskudd i fravær av cerebellar motorisk syndrom10. Til slutt indikerer regional cerebellar patologi ved sykdom at funksjonelt distinkte cerebellar regioner også er forskjellig utsatt for sykdom11,12.
Selv om de er mye mindre utforsket, viser foreløpige bevis tydelige genuttrykkssignaturer på tvers av cerebellar kortikale regioner. Purkinje celleuttrykk av Zebrin II viser regionspesifikk mønster i vermis slik at det er flere Zebrin II positive celler i bakre lobules og færre i de fremre lobules13. Dette korrelerer også med regionalt distinkt fysiologisk funksjon som Zebrin II negative Purkinje celler viser høyere frekvens av tonic avfyring enn Purkinje celler som er Zebrin II positiv14.
I tillegg til cerebellar cortex inkluderer cerebellum den dype cerebellar nuclei (DCN) som tjener som den primære utgangen for cerebellum. Kjernen består av medial (MN), interposed (IN) og lateral nuclei (LN). Funksjonell avbildning og pasientstudier har vist at DCN også deltar i ulike atferd15, men svært få studier undersøker genuttrykksendring i DCN.
Fremskritt innen molekylære teknikker har gjort det mulig å vurdere regionalt genuttrykk i hjernen og har avdekket heterogenitet på tvers av og innenfor forskjellige hjerneregioner i både fysiologiske og sykdomstilstander16. Slike studier innebærer at cerebellum er forskjellig fra andre hjerneregioner. For eksempel er forholdet mellom nevroner og glialceller invertert i cerebellum sammenlignet med andre hjerneregioner1. Selv under normale fysiologiske forhold er uttrykket av proinflammatoriske gener oppregulert i cerebellum sammenlignet med de andre hjerneregionene17. Molekylære teknikker har også vært svært nyttige for å identifisere veiene som bidrar til patogenesen av cerebellar sykdommer. For eksempel identifiserte RNA-sekvensering av hele cerebellar-ekstraktene identifiserte gener endret i en Purkinje-cellespesifikk transgen musemodell av spinocerebellar ataksi type 1 (SCA1) sammenlignet med deres ville typekontroller. Slike bevis har avslørt viktige molekylære veier som ligger til grunn for patogenese i cerebellar Purkinje-celler og har bidratt til å identifisere potensielle terapeutiske mål18. Nyere studier tyder imidlertid på at det er forskjeller i sårbarheten for sykdommer i de cerebellar regionene11,12,19. Dette kan tyde på at det er viktige endringer som skjer i distinkte cerebellar regioner, som kan være maskert eller uoppdaget med hele cerebellar ekstrakter. Dermed er det behov for å utvikle teknikker som gjør det mulig for forskere å undersøke molekylære profiler i forskjellige cerebellar regioner.
Teknikken som foreslås her beskriver en reproduserbar metode for å dissekere fire forskjellige regioner i musen cerebellum for å isolere RNA fra disse regionene og utforske regionale forskjeller i genuttrykk. Skjematisk for museklokken i figur 1A fremhever vermis i blått og halvkule i gult. Spesielt denne teknikken gjør det mulig å isolere fire regioner: dyp cerebellar nuclei (DCN) (rødprikkede bokser i figur 1A), cerebellar cortex av fremre vermis (CCaV) (mørk blå i Figur 1A), cerebellar cortex av bakre vermis (CCpV) (lyseblå i figur 1A), og cerebellar cortex på halvkule (CCH) (gul i figur 1A). Ved å vurdere genuttrykk av disse regionene separat, vil det være mulig å undersøke molekylære mekanismer som ligger til grunn for diskrete funksjoner i disse forskjellige regionene, samt potensielle forskjeller i deres sårbarhet i sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppsett
- Samle nødvendig utstyr, inkludert halshugging saks, stump tang, disseksjon saks, vaskulær saks, mikrospatula, sagittal mus hjernematrise, barberblader, 200 μL pipet tips, glass petri parabolen, glass lysbilde, og is bøtte. Legg ut alt utstyr på en absorberende pute.
- Legg petriskål, glassplate og hjernematrise på is.
- Bruk et barberblad i vinkelrett vinkel, trim ca 5 mm av spissen på en 200 μL pipetspiss. Dette gjør størrelsen på åpningen på slutten av spissen ca 1 mm bred. Dette bør være tilstrekkelig til å slå ut DCN. Men dette kan også justeres etter behov avhengig av disseksjonen. Ha mange tips klare for enkel utskifting og justering.
- Etikett 1,5 ml mikrofunksjonsrør med dyreidentifikasjon og cerebellar-region (fire rør per dyr).
- Fyll kryosafe beholder med flytende nitrogen for å blinke frysevev etter ekstraksjon.
2. Hjerneutvinning og disseksjon
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene fra Animal Care Committees ved University of Minnesota.
- Avlivet musen ved hjelp av 5% CO2 eksponering. Når pusten har opphørt, utfør cervical dislokasjon. Decapitate musen med halshugging saks og kaste slaktkroppen i riktig beholder.
- Lag et snitt med et barberblad langs medial sagittal linje av hodet som starter ved nesen og fortsetter helt tilbake. Skill huden, avskjed til hver side av midtlinjen. Bruk barberbladet til å kutte bort muskelen på hver side, kutte ned forbi ørekanalene.
- Bruk dissekering saks, trim noen ryggmargsregioner, opp til hvor hjernestammen møter cerebellum, forsiktig med å ikke skade cerebellum.
- Sett inn et av de vaskulære saksebladene i rommet mellom hjernestammen og vertebrale kolonnen og kutt mot ørekanalen, løft opp saksen for å kutte beinet rent, men begrense skade på vevet.
- Fortsett å kutte langs kanten av skallen opp mot de olfaktoriske pærene, fortsett å løfte opp mens du kutter for å begrense skade på hjernevevet.
- Bruk de stumpe tangene, skrell forsiktig av baksiden av skallen som avdekker den bakre regionen av hjernen og cerebellum.
- Bruk de stumpe tangene langs kanten av skallen som nettopp ble kuttet, skrell resten av skallen opp og over hjernen. Dette trinnet skal fjerne flertallet av hodeskallehetten, og avsløre hjernen.
- Trim resten av skallen med vaskulær saks og stumpe tang, og rydd det meste av skallen fra toppen av hjernen.
- Bruk mikrospatulaen, løft hjernen litt og scoop under og skyv opp for å fjerne olfaktoriske pærer fra den gjenværende skallen og koble fra optiske kanalfibre. Hjernen skal komme lett fri på dette punktet.
- Plasser hjernen i petriskålen som sitter på is og fjern eventuell gjenværende hodeskalle eller annet rusk.
- Bruk mikrospatulaen til å plassere hjernen forsiktig i hjernematrisen med dorsal side opp. Ta deg tid til å sørge for at det er satt nivå i matrisen, spesielt at midtlinjen faller midt i matrisen. Denne matrisen er designet for voksne musehjernevev, vev fra yngre eller syke dyr kan hvile lavere i matrisen, men det bør fortsatt være mulig å oppnå reproduserbare resultater på tvers av prøver.
- Plasser ett barberblad langs den sagittale midtlinjen, og pass på at bladet skyver helt til bunnen av matrisen (Figur 1B).
- Plasser et annet barberblad 1 mm på siden av det første bladet (Figur 1B). Plasser to kniver til 1 mm fra hverandre. Sluttresultatet skal være tre kniver plassert på den ene siden av hjernen, alle 1 mm fra hverandre. Gjør det samme med den andre siden. Totalt vil 7 kniver bli plassert 1 mm fra hverandre (Figur 1C).
- Ta forsiktig tak i de fremre og bakre endene av barberbladene og løft rett opp av matrisen. Vevet på utsiden av barberbladene kan kastes.
- Separer sakte ett barberblad om gangen fra de andre, vær forsiktig så du ikke skader vevsdelene.
- Skyv vevsdelen forsiktig ut av barberbladet og på glasssklie med mikrospatulaen. Totalt vil det være seks skytten hjerneseksjoner (Figur 1D).
- De 4 mest laterale delene vil ha DCN synlig (Lilla boks, Figur 1D). For å isolere DCN, hold den trimmede 200 μL pipetspissen vinkelrett over DCN og skyv ned gjennom vevet fast, gynge i alle retninger for å fullstendig dissekere DCN fra omkringliggende vev. Løft rett opp igjen for å fjerne DCN-en rent, og bekreft visuelt tilstedeværelsen av vevet i spissen.
- Plasser en finger på toppen av spissen og skyv ned, slik at vevet buler ut. Plasser spissen i riktig merket mikrofunksjonsrør og sørg for at vevsstansen er plassert i bunnen av røret. Gjenta 2.17 for de resterende tre seksjonene, og plasser DCN-slagene i samme rør. Plasser røret i flytende nitrogen for å blinke fryse. Representasjon av størrelsen på hvert slag i figur 1E.
- Seksjoner som hadde DCN ekstrahert kvalifiserer som cerebellar halvkule. Skyv resten av hjernevevet rundt cerebellum i disse seksjonene. Bruk stumpe tang og forsiktig plukke opp disse halvkule cerebellar cortex seksjoner og plassere i respektive microfuge tube. Blitsfrysing.
- For de to siste vermale seksjonene (lyseblå boks, Figur1D), skyv bort omkringliggende hjernevev og la bare cerebellum. Bruk et barberblad, lag et kutt som skiller de fremre lobulene fra bakre lobler. Kutt bør være like etter dannelsen av lobule 6 og bør ikke inkludere lobule 10 (Figur 1F).
- Bruk stumpe tang, plasser forsiktig de fremre cerebellar cortex-seksjonene og bakre cerebellar cortex-seksjonene i sine respektive mikrofunksjonsrør og blitsfrysing ved å la rørene stå i flytende nitrogen i 5 minutter. Herfra går du videre til RNA-ekstraksjon, eller kan lagre rørene ved -80 °C.
3. RNA-ekstraksjon
MERK: Denne protokollen er modifisert fra Cold Spring Harbor Protocol for RNA Extraction med TRIzol20. TRIzol solubiliserer biologisk materiale, noe som gjør det mulig å trekke ut RNA.
- Plasser mikrofugerørene i is for å hindre at vevet tiner for raskt, påfør 150 μL kaldt TRIzol i mikrofugerøret. Homogeniser med en sterilisert pestle. Når vevet er homogenisert, rør løsningen opp og ned for å sikre at det ikke er noe gjenværende vev intakt. Videre bryte opp noen små vev stykker ved å trekke den opp i en insulin sprøyte et par ganger.
- Tilsett ytterligere 350 μL TRIzol og pipet opp og ned for å blande grundig. La sitte på rommet temp i 5 minutter.
- Tilsett 150 μL kloroform på røret og rist kraftig og la hvile i 2-3 minutter. Kloroformen skiller den homogeniserte vevsløsningen i faser (RNA, DNA og protein).
- Sentrifuge ved 12 000 x g, ved 15 °C, i 10 minutter. Kontroller at alle rørene er i samme retning.
- Fjern rørene forsiktig og sett temperaturen på sentrifugen til 4 °C. Fjern bare den klare vandige fasen i et nytt rør (dette er RNA), forsiktig så du ikke forstyrrer den ugjennomsiktige interfasen (DNA). Den laveste fasen vil være rød og inneholder protein. Gjenværende løsning i rørene kan lagres eller kastes.
- Tilsett 100% isopropylalkohol med et 1:2-forhold (hvis fjernet 200 ul vandig fase, tilsett 100 μL isopropylalkohol). Bland grundig ved å pipettere opp og ned. La hvile ved romtemperatur i 10 minutter. Isopropylalkoholen utfeller RNA ut av oppløsning.
- Sentrifuge ved 12 000 x g, ved 4 °C, i 10 minutter. Pass på å plassere alle rørene i samme retning for å gjøre det lettere å visualisere pelletsen. Den resulterende pelletsen vil være den ekstraherte RNA.
- Fjern forsiktig rørene, fjern supernatanten med en pipet som er forsiktig så du ikke forstyrrer pelletsen. Pellet er noe gellignende og vil være vanskelig å se, men bør kunne estimere hvor den er basert på orienteringen av rørene i sentrifugen.
- Etter å ha fjernet hele supernatanten, tilsett 500 μL 75% etanol, virvel kort og sentrifuge ved 7500 x g, ved 4 °C, i 5 minutter. Etanol vasker pelletsen ytterligere.
- Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelletsen. La hettene stå åpne for å tørke prøven. Dette tar vanligvis 5-10 minutter, men kan variere avhengig av hvor mye etanol som var igjen på pelletsen. Ikke tørk for mye.
- Når den er tørr, resuspenderer du pelletsen i DNase fritt vann. Tilsett 20 μL i prøver for DCN, og 30 μL for alle andre.
- Når prøvene er resuspendert, kan de lagres ved -80 °C eller fortsette med videre testing.
4. Sanntid kvantitativ polymerase kjedereaksjon (RTqPCR)
- Før dette trinnet vil det være nødvendig å DNase behandle RNA for å fjerne noe genomisk DNA, og generere cDNA ved hjelp av iScript fra BioRad. Pass på å normalisere konsentrasjonen av RNA før du lager cDNA. I tillegg er det viktig å optimalisere primere for qPCR. Følg metodene som er beskrevet her, for å fullføre dette trinn21. Kort beskrivelse av qPCR nedenfor.
- Primere er alle kjøpt fra IDT. Fremover og bakover sekvenser er begge i samme prøverør, og lagres ved 20x konsentrasjon.
Rps18 (kontrollgen):
Fremover – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3'
Omvendt – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3'
Parvalbumin (Kalsiumbindende protein, hemmende celler):
Fremover – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3'
Omvendt – '5-AGCGTCTTTGTTCTTTAGCAG-3'
Kcng4 (underenhet for kaliumkanal):
Fremover – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3'
Omvendt – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAGTCAG-3'
Aldolase C (Zebrin II, differensialt uttrykt over cerebellar cortex):
Fremover – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3'
Omvendt – 5'-TCAGTAGGCATGGTTGGC-3' - qPCR-betingelser var som følger. Før inkubasjonsperiode, 5 minutter, ved 95 °C. Forsterkningsperiode, 50 sykluser: 10 minutter ved 95 °C, 10 minutter ved 62 °C og 10 minutter ved 72 °C. Smeltekurveperiode, 5 sekunder ved 95 °C, ett minutt ved 65 °C, og sett rampehastigheten til 0,07 °C/sekund til måltemperatur på 97 °C. Deretter kjøleperiode i 10 minutter til 40°C. Alle qPCR-reaksjoner ble utført i triplikat og genuttrykk ble analysert ved hjelp av 2- ΔΔCt med Rps18 som en lastekontroll for å normalisere genuttrykk. Bulk cerebellar ekstrakt ble brukt som referanse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For disse eksperimentene ble fire elleve uker gamle kvinnelige villtype C57 / Black6 mus brukt. En mus ble brukt til å gjennomføre en full cerebellar disseksjon som kalles 'bulk cerebellum' og tillatt for sammenligning av RNA-nivåer i dissekerte regioner til en full disseksjon. De tre andre musene ble brukt til å gjennomføre cerebellar disseksjonen beskrevet i denne protokollen. Bruk av tre mus gjør det mulig å sikre at trendene som oppdages i nivåene av RNA, kan reproduseres på tvers av mus.
Figur 1A representerer musen cerebellum - vermis i blått og halvkule i gult. Sagittale skjemaer av vermis (fremre regioner i mørkeblå, bakre regioner i lyseblå) og halvkule (i gul). DCN er uthevet i røde stiplede bokser. En vellykket disseksjon vil starte med den første barberbladplasseringen ned midtlinjen i hjernen (Figur 1B); Dette styrer den vellykkede plasseringen av følgende seks kniver (Figur 1C). Dette etterlater seks skytten seksjoner (Figur 1D), fire laterale / halvkule seksjoner (skissert i lilla) og to midtlinje / vermal seksjoner (skissert i lyseblå). De 4 sidedelene inneholder DCN; Figur 1E viser en vellykket DCN-slagred disseksjon. Midline vermal seksjoner vil mest sannsynlig ha halvparten av de mest medial DCN til stede i den 1 mm tykke delen, men det vil ikke være til stede hele veien gjennom og er ikke mulig å reprodusere dissekere ut. De midtlinje vermale delene er delt inn i fremre og bakre lobler avbildet i figur 1F. En vellykket disseksjon setter opp resten av eksperimentene for suksess.
Sanntids kvalitativ polymerasekjedereaksjon (RTqPCR) viser muligheten for å vurdere genuttrykksnivåene i hver enkelt region, samt tjene til å validere disseksjoner. Vi brukte primere som oppdaget gener som viser gradientuttrykk fra fremre til bakre cerebellar cortex og berikelse i DCN og sammenlignet deres uttrykk med bulk cerebellar lysates.
Vi vurderte uttrykksnivåene til tre gener: aldolase C, parvalbumin og Kcng4. Aldolase C, også kjent som zebrin II, er et enzym som uttrykkes i et konsistent båndmønster gjennom cerebellum. Det uttrykkes mer høyt i bakre vermis enn den fremre vermis. Det er også bånd på halvkule13,14. Parvalbumin som er et kalsiumbindende protein som uttrykkes i hemmende celler. Basert på Allen Brain Atlas virker parvalbumin relativt jevnt uttrykt gjennom cerebellar cortex og i DCN (http://mouse.brain-map.org/gene/show/19056). Kcng4, en underenhet for kaliumspenning inngjerdet kanal, ser ut til å være beriket i DCN og i fremre sammenlignet med bakre lober (https://mouse.brain-map.org/gene/show/42576). Kvantitativ uttrykksanalyse viste at, som forventet, aldolase C er mer høyt uttrykt i bakre cerebellar vermis (CCpV), men lavere i DCN og den fremre regionen av vermis (CCaV) sammenlignet med bulk cerebellar disseksjon (Figur 2A). Parvalbumin finnes på samme måte i DCN, fremre vermis, bakre vermis og halvkule cerebellar cortices som i bulk cerebellar ekstrakter (Figur 2B). Kcng4 er betydelig beriket i DCN og den fremre vermis (CCaV), og den er ikke betydelig beriket i bakre vermis (CCpV) eller halvkule (CCH) sammenlignet med bulkutvinningen (Figur 2C). Dette resultatet følger det som var forventet basert på mønsteret sett i Allen Brain Atlas. Dermed validerer genuttrykksanalysen disseksjonsprotokollen og bekrefter at RNA av god kvalitet kan oppnås og testes.
For å sammenligne uttrykket av aldolase C direkte over cerebellar cortex, ble uttrykksnivåene sammenlignet med hvor det skal være lavest, den fremre vermis (CCaV) (Figur 3). Uttrykksnivået til aldolase C var betydelig høyere i bakre vermis (CCpV), og trending høyere i cerebellar halvkule (CCH), men ikke helt betydelig så. Denne trenden i de cerebellar halvkule er sannsynlig fordi det er bånd av aldolase C på halvkule, og disseksjonen fanger aldolase negative og positive bånd.
Figur 1: Representative bilder av cerebellar disseksjon
A. Skjematisk av mus cerebellum med vermis i blått og halvkule i gult. Sagittal cerebellar skjemaer av både vermis og halvkule. Vermis er i blått, med mørkeblå som markerer den fremre vermis, og lyseblå merking bakre vermis. Halvkule i gult. DCN er merket i hver med rødprikkede bokser. B. Full hjerne i sagittal mus hjerne matrise, med barberblad ned midtlinjen. C. Plassering av tre barberblader 1 mm fra hverandre på hver side av midtlinjen. D. De resulterende seks skytten hjerneseksjoner. Fire inneholder side-/halvkule cerebellar seksjoner (de fire øverste bildene skissert i lilla). To inneholder medial/vermal cerebellar seksjoner (nederste to bilder, skissert i lyseblå). E. Representativ side-/halvkule cerebellar-seksjon med DCN-stanse dissekert til høyre for avsnittet (avsnitt skissert i rosa i figur 1D). F. Cerebellar-delen i figur 1D med firkantet prikket turkis rundt seg, dissekert i fremre og bakre vermale lobler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Relativ genuttrykk i isolerte spesifikke områder av cerebellum.
Relativt uttrykk for aldolase C (2A), parvalbumin (2B) og Kcng4 (2C) normalisert til Rps 18 (protein assosiert med ribosomal RNA uttrykt i alle celler), og bruk bulk cerebellar ekstrakt som referanse. Som forventet var aldolase C-uttrykket høyere i bakre vermis og lavere i DCN og fremre vermis (2A). Som forventet, basert på Allen Brain Atlas, uttrykkes parvalbuminuttrykk jevnt over hver utvunnet region, mens Kcng4-uttrykket er betydelig beriket i DCN og CCaV. Enveis ANOVA, med en Tukeys post hoc-test. *p<.0.005, ** p<.0.0001 i forhold til bulk cerebellar ekstrakt. Histogrammer representerer gjennomsnittsverdier for N=3 med verdier for hver enkelt mus vist som prikker. Feilfelt representerer standardfeil av gjennomsnittet. DCN (Deep cerebellar nuclei), CCaV (cerebellar cortex av fremre vermis), CCpV (cerebellar cortex av bakre vermis), og CCH (cerebellar cortex av halvkule). N=3 mus for cerebellar disseksjonsregioner. N=1 masseutdrag. Eksperiment gjort i triplikat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: RTqPCR Relativ genuttrykk av aldolase C over cerebellar cortex
Relativt uttrykk for aldolase C i bestemte regioner i cerebellar cortex - fremre vermis (CCaV), bakre vermis (CCpV) og halvkule (CCH). Genuttrykksnivå av aldolase C ble normalisert til Rps18 og sammenlignet med uttrykksnivået i den fremre vermis. Som forventet ble aldolase C-uttrykket beriket i bakre vermis. Enveis ANOVA, med en Tukeys post hoc-test. *p<.0.005 i forhold til CCaV. Feilfelt representerer standardfeil av gjennomsnittet. CCaV (cerebellar cortex av fremre vermis), CCpV (cerebellar cortex av bakre vermis) og CCH (cerebellar cortex på halvkule). N = 3 mus, eksperiment gjort i triplikat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som er beskrevet her gjør det mulig å vurdere det underliggende genuttrykket og molekylære mekanismene innenfor fire distinkte cerebellar regioner - den dype cerebellar kjernen (DCN), den fremre cerebellar cortex av vermis (CCaV), bakre cerebellar cortex av vermis (CCpV), og cerebellar cortex av halvkule (CCH). Evnen til å vurdere disse regionene separat vil utvide vår kunnskap om heterogeniteten til spesifikke cerebellar regioner og muligens belyse deres bidrag til ulike atferd.
Ved å seksjonere hele hjernevevet sagittalt er det mulig å enkelt visualisere og identifisere disse fire regionene i cerebellum, noe som gir en rask disseksjon. Så vidt forfatteren vet er dette den første beskrivelsen av full cerebellar regional disseksjon for molekylær analyse. I en artikkel som nylig ble publisert, brukte forskere bulk disseksjon av de fremre lobulene i cerebellum og den nodulære lobule av cerebellum for molekylær analyse22. Men med den beskrevne metoden ville de ikke kunne dissekere DCN. Forsøk på å isolere DCN-slag ved hjelp av en vibratom for å kutte 300um tykke skiver, oppstår vanligvis i tre kritiske problemer. For det første, på grunn av små forskjeller i montering av cerebella og vinkelen der vevet er kuttet, er det ikke lett å reprodusere de samme områdene på tvers av dyr. For det andre tar montering og kutting tid, noe som øker sjansene for RNA-nedbrytning og redusert kvalitet på RNA-prøven for nedstrømsapplikasjoner. Til slutt produserer slag fra 300um tykke skiver lavt utbytte av RNA.
Data vist her antyder at det er mulig å bruke denne teknikken til å vurdere relativt genuttrykk på tvers av cerebellar regioner. Aldolase C er svært upregulert i CCpV. Kcng4 er svært upregulert i DCN og CCaV, og parvalbumin uttrykkes relativt likt på tvers av alle regioner i cerebellum. Selv om dette bare er tre gener, viser disse resultatene at denne disseksjonsmetoden kan brukes til å identifisere de underliggende molekylære signaturene i disse forskjellige regionene.
Det er noen få kritiske ting å være oppmerksom på gjennom hele denne protokollen. Posisjonering av hjernen i matrisen er et viktig skritt. I noen tilfeller kan hjernen ikke ha blitt satt perfekt nivå i matrisen eller nøyaktig på midtlinjen. Dette ville bli klart når man ser på hver av de sagittale seksjonene. For eksempel, hvis kuttet nøyaktig på midtlinjen, vil de mest medial cerebellar seksjonene se nesten identiske ut og har ingen DCN synlig. Fordi disse landemerkene er identifiserbare for øyet, er det mulig å feilsøke hvor mange seksjoner som kvalifiserer som vermale eller halvkule seksjoner, og de kan kombineres sammen i samme mikrofuge rør. Et annet kritisk trinn er utvinningen av DCN. I noen tilfeller er det ikke nok trykk å trykke en finger til toppen av den 200 μl pipetspissen for å trekke ut vevsstansen. Hvis dette er tilfelle, vil det være nødvendig å øse ut slaget med en nål nese tang og plassere slaget i riktig rør. Det neste kritiske trinnet i denne protokollen er RNA-utvinningen. Mens volumene som er oppført er optimalisert for maksimal RNA-ekstraksjon, kan det også være nødvendig å justere mengdene løsning i RNA-ekstraksjonsprotokollen for å passe til laboratoriets individuelle behov. Fordi det er lite vev å jobbe med, er det større sjanse for fenolforurensning i det endelige RNA-produktet. Dette kan styres ved å justere mengden TRIzol som brukes til å homogenisere vevet og sikre at det homogeniserte vevet blandes grundig.
Begrensninger i denne protokollen er at mens DCN er delt inn i tre separate kjerner (laterale, interposed og medial) er det vanskelig å visualisere og reprodusere hver av disse ut av 1 mm seksjoner, enn si å ha nok vev til å trekke ut RNA. Sammen med denne begrensningen vises halvparten av de mest medial DCN i vermis; Men med denne disseksjonen er det vanskelig å visualisere og reprodusere dissekere ut. Siden protokollen er for øyeblikket, blir den andre halvdelen av medial DCN og gjenværende DCN dissekert ut. Det er også ti individuelle vermale lobler og åtte lobler på halvkule, men å dissekere hver av disse individuelt og på en reproduserbar måte ville være vanskelig og føre til svært lave RNA konsentrasjonsutbytter. Selv om denne metoden gjør det mulig å dykke mer spesifikt inn i områder av cerebellum, kombinerer den fortsatt distinkte anatomiske regioner i grupper som kan maskere unike endringer på nivået av individuelle lobules eller sub-lobule enheter.
Til slutt gjør denne metoden det mulig å samtidig utforske regionale molekylære forskjeller fire spesifikke regioner i cerebellum. Ved å vurdere cerebellum på denne regionspesifikke måten, er det mulig å erte fra hverandre underliggende molekylære mekanismer og genuttrykk som karakteriserer disse regionene. Dette vil videre vår forståelse av rollen som de distinkte cerebellar regionene spiller i ulike atferd og tillate fremtidig arbeid å fokusere spesielt på en cerebellar region og utforske sin rolle i sykdom eller målbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Austin Ferro og Juao-Guilherme Rosa i Cvetanovic-laboratoriet for deres hjelp til feilsøking av disseksjoner og i RNA-ekstraksjon og RTqPCR. Denne forskningen er finansiert av M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS-| Nasjonale helseinstitutter (NIH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , Online Preprint (2020).
