Summary
本文为评估小鼠脂质代谢提供了三种简单易行的检测。
Abstract
评估脂质代谢是评估代谢功能的基石,它被认为是活体代谢研究的关键。脂质是许多不同的分子的一类,其合成和代谢涉及许多通路。需要一个起点来评估营养和肥胖研究的脂质血脂。本文描述了三种简单易行的方法,这些方法几乎不需要专业知识或实践来掌握,并且大多数实验室都可以将其改编为筛查小鼠的脂质代谢异常。这些方法是(1)测量几个禁食血清脂质分子使用商业套件(2)通过口服脂质耐受性测试,以评估饮食脂质处理能力,(3)评估对药物化合物CL 316,243的反应,在小鼠。这些方法将共同提供小鼠脂质处理能力的高水平概述。
Introduction
碳水化合物和脂质是能量代谢的两大基质。异常脂质代谢导致许多人类疾病,包括II型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝疾病和癌症。膳食脂质,主要是甘油三酯,通过肠道吸收到淋巴系统,并进入心脏1附近的血小龙静脉循环。脂质由血液中的脂蛋白颗粒携带,脂肪酸脂肪通过脂蛋白脂酶在肌肉和脂肪组织2等外周器官的作用而释放。剩余的富含胆固醇的残留颗粒由肝脏3清除。老鼠在实验室中被广泛用作研究脂质代谢的研究模型。拥有全面的遗传工具集和相对较短的繁殖周期,它们是研究脂质如何被吸收、合成和代谢的有力模型。
由于脂质代谢的复杂性,复杂的脂质学研究或同位素示踪研究通常用于量化脂质物种或脂质相关代谢通量和命运的集合4,5。这给没有专门设备或专业知识的研究人员带来了巨大的挑战。在本文中,我们提出了三个测试,在使用具有技术挑战性的技术之前,这些测试可以作为初始测试。它们是小鼠的非终端程序,因此非常有助于识别脂质处理能力的潜在差异和缩小受影响的过程。
首先,测量禁食血清脂质分子可以帮助确定小鼠的整体脂质特征。老鼠应该禁食,因为许多脂质物种在饭后会上升,而且增加的程度受到饮食成分的强烈影响。许多脂质分子,包括总胆固醇、甘油三酯和非酯化脂肪酸(NEFA),都可以使用商业套件和可读取吸血的板读器进行测量。
其次,口服脂质耐受性测试将脂质处理能力评估为吸收和代谢的净效应。口服的脂内导致循环甘油三酯水平激增(1至2小时),之后血清甘油三酯水平恢复到基底水平(4至6小时)。此检测提供了有关鼠标处理外源性脂质的程度的信息。心脏、肝脏和棕色脂肪组织是甘油三酯的活跃消费者,而白色脂肪组织将其储存为能量储备。这些功能的变化将导致测试结果的差异。
最后,促进脂溶解以调动储存的脂质被认为是减肥的可能策略。脂肪组织中的β3-肾神经受体信号通路在脂肪细胞脂解中起着重要作用,人类遗传学已经识别出与肥胖相关的3-肾上腺受体中功能丧失的多态性Trp64Arg。CL 316,243,一种特异且有效的β-肾上腺素受体激动剂,刺激脂肪组织脂解和甘油释放。评估鼠标对CL 316,243的反应可以提供关于化合物的开发、改进和理解的宝贵信息。
总的来说,这些测试可以用作小鼠脂质代谢状态变化的初始屏幕。它们是为仪器和试剂的可访问性而选择的。通过这些检测结果,研究人员可以形成动物代谢适应的整体图景,并决定更复杂和更有针对性的方法。
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Protocol
根据贝勒医学院(BCM)机构动物护理和使用委员会批准的动物护理和实验协议,动物被安置在标准化条件下。动物被喂食标准或特殊的饮食,水广告脂质,并保持12小时的日夜循环。
1. 测量禁食血清脂
- 下午5点以后将老鼠转移到一个新的笼子里,并快速免费取水,过夜(实验前大约16个小时的禁食)。通宵禁食确保完全排空小鼠的胃肠道。
注意:老鼠在禁食时吃粪便,所以食物提取不能确保它们被充分禁食。 - 第二天早上,抓住老鼠的尾巴,把它放在水面上。轻轻地拉回鼠标尾部,将鼠标放在抑制器中。将鼻子约束重新训练鼠标的运动,同时仍然允许鼠标呼吸。拧紧鼻子约束的旋钮。监控胸部运动,确保动物正常呼吸,并尽量减少鼠标在抑制器中停留的时间。
- 在自由移动的鼠标的尾部静脉中做一个表面切口(尼克),从切口中抽出25μL的血液,制成玻璃毛细血管(填充大约1/3的毛细血管),而不抑制鼠标。迅速将血液吹入微中心管中。
- 使用型粉停止出血,在笼子里补充饲料,并确保小鼠没有出现压力的迹象。
- 完成所有小鼠的血液抽取。
- 让血液凝固,使其在室温下不受干扰1小时。在冷藏台式微中心中,在 4 °C 下以 2,000 x g 旋转凝固的血液样本 10 分钟,并转移超高血清(血清)进行分析。
注:血清可在 +20 °C 下存储数周,直到分析。对于长期存储,将血清保持在 +70°C。 - 使用制造商提供的协议分析每个脂质代谢物。
2. 口服脂内耐受性测试
- 下午5点以后,称量小鼠,计算第二天交给它们的脂内体积。然后,将老鼠转移到一个新的笼子里,并禁食它们过夜(16小时)。
- 第二天早上,将老鼠的尾巴放在一个笼子里,以帮助识别它们在随后的出血步骤中。
- 在尾部静脉上划一个刻痕,从切口中抽出 15 μL 的血液到玻璃毛细血管中(填充大约 1/5 的毛细血管),并快速将血液吹入 T = 0 血清的微中心管中。
注意:除非小鼠出现过度出血,否则无需在检测过程中止血。 - Gavage 小鼠使用 18G 盖瓦奇针的 20% 内脂,每克体重为 15 μl,使用禁食前体重。将每只鼠标堆叠 1 分钟。
注:称量动物,确定适当的咽针大小。一般来说,18号的咽针适合25克>小鼠,20-22号的咽针更适合较小的动物。擦伤老鼠,抓住肩膀上的皮肤,把动物的头抱到位。将咽针放入口腔,然后沿着上味轻轻推进,直到食道到达。管子应该通过没有阻力。一旦达到适当的深度,内脂可以慢慢管理。在插入针头时,在管理脂内后,轻轻取出相同角度的针头。将动物送回笼子,并监测有呼吸困难或其他不适的迹象。
注:缺乏口腔咽部或尾部出血技术经验的研究人员可以将每只小鼠堆叠2分钟甚至更长时间。 - 在 T = 1、2、3、4、5 和 6 小时抽血:通过尾部出血每只小鼠抽取 15 μL 的血液(1/5 毛细管),并迅速将血液吹入微中心管中。
- 在室温下以 2,000 x g 旋转血液样本,在微中心中旋转 10 分钟。将超高纳特(包括浮动脂肪层)转移到 PCR 管中存储。超高纳特可以在 +20 °C 下存储数周,直到分析。
注:超高等离子体应该是等离子体。如果某些样品在离心时已经凝固,则不会影响甘油三酯测量。 - 最后一次采血后,停止使用型粉出血,在笼子里补充饲料,并确保小鼠没有表现出极度紧张的迹象。
- 装载 2 μL 甘油三酯标准,并将超分子收集到 96 井板中。
- 加入 200 μL 甘油三酯试剂,让板在 37 °C 下孵育 5 分钟,用于颜色开发。
- 测量实验室板读卡器中 500 nm 的吸血量,参考波长为 660 nm,并计算样本的浓度。
3. β3 肾上腺受体激动器 CL 316,243 刺激利波利西斯检测
- 准备 CL 316,243 作为无菌盐水中 5 毫克/mL (50 倍) 的库存溶液,并储存在 ±20°C,直到使用。
- 在早晨,称量小鼠,计算实验所需的稀释CL 316,243溶液量。小鼠将得到10μL每克体重稀释CL 316,243,为1毫克/千克体重的最后剂量。
- 将老鼠转移到一个新的笼子里,免费取水,并禁食4小时。
- 使用盐水从 50 倍库存中制作足够的 1x CL 316,243 溶液。1x CL 316,243 溶液的最终浓度为 0.1 毫克/mL。使用盐水进行对照组。
- 标记存放在同一笼子里的老鼠的尾巴,以便在出血步骤中轻松识别。
- 在尾部静脉中划出一个刻痕,从切口中抽取 15 μL 的血液到玻璃毛细血管中(填充大约 1/5 的毛细血管),并快速将血液吹入微中心管中,用于 T = 0 样本。
注意:除非小鼠出现过度出血,否则无需在检测过程中止血。 - 以 10 μL/g 体重的体量,在腹地注射稀释的 CL 316,243 溶液(或如果包含在实验中)。将每只鼠标堆叠 1 分钟。每60分钟的实验最多使用5只小鼠,或为双人小组使用10只小鼠。
- 在 T = 5、15、30、60 分钟抽血:通过尾部出血每只小鼠抽取 15 微升血液(1/5 毛细血管)。
- 最后一次采血后,停止使用型粉出血,在笼子里补充饲料,并确保小鼠没有表现出极度紧张的迹象。
- 在冷藏微中心中,在 4 °C 下以 2,000 x g 旋转血液样本 5 分钟。将超纳特转移到 PCR 管进行存储。超高纳特可以在 +20°C 下存储数周,直到分析。
- 负载 1 μL 的 2 倍串序稀释甘油标准 (0.156, 0.312, 0.625, 1.25 和 2.5 毫克/毫升三聚氨酯当量浓度), 并收集超分子到 96 井板.加入100微升免费甘油试剂,让板在37°C孵育5分钟,使颜色形成。
- 使用实验室板读卡器测量 540 nm 的吸血量,并计算样品的浓度。
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Representative Results
我们用三段摘录显示,每次检测都提供了有关小鼠脂质代谢的宝贵信息。对于C57BL/6J雄性小鼠来说,从8周大开始接受8周高脂肪饮食(HFD)喂养的挑战,总胆固醇水平显著升高,而血清甘油三酯和NEFA则没有(表1),这表明血液中的甘油三酯和NEFA不是主要受膳食脂肪挑战的调节。在第二组小鼠中,C57BL/6J和C57BL6/N子系统从8周大开始喂养HFD8周。他们的血清甘油三酯水平在口腔脂内挑战后进行比较。结果表明,6N和6J亚系统之间有显著差异,6J在脂内施用后血清甘油三酯水平的峰值显著较高,表明三甘油三酯清除增强或速度慢得多(图1)。最后,对于8周大的雄性C57BL/6J小鼠,以正常周(NC)喂养,单个CL 316,243治疗(1毫克/千克体重)导致血清甘油显著增加。然而,每天对体重为1毫克/千克CL 316,243的小鼠进行一周的腹内预处理,导致对CL 316,243的钝化反应,表明这些小鼠对CL 3116,263的耐药性发展(图2)。
血清参数 | 数控 | HFD | P 值 |
胆固醇 (mg/dL) | 132.7±10.3 | 202.3±8.4 | 0.0002 |
甘油三酯(毫克/dL) | 91.7±9.1 | 79.3±4.5 | 0.26 |
非酯化脂肪酸(mmol/L) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
表1:在正常周食(NC)或高脂肪饮食(HFD)喂养的老鼠中禁食脂质物种8周。 数据表示为 SEM. N = 6 ± NC 组的平均值,N = HFD 组的 12 值。 P值是使用双尾学生 t测试确定的。
图1:在口腔脂内挑战后,证明C57BL/6亚系统血清甘油三酯差异的结果示例。数据表示为每个组的平均值± SEM. N = 5。 P值在每个时间点使用双尾学生的 t测试确定。* p < . 05, ** p <. 01 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:在C57BL/6J小鼠经过一周的每日CL 316,243治疗后,发现对CL 316,243治疗产生耐药性的示例。数据表示为每个组的平均值± SEM. N = 5。P值在每个时间点使用双尾学生的t测试确定。** p <. 01 。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这三个分析描述了实验室中强有力的功能,并考虑了几个关键问题。夜间禁食是确定禁食血清脂质水平和口腔脂内耐受性测试所必需的。对于口腔脂内耐受性测试,在室温下旋转血液以尽量减少脂肪层的形成至关重要,尤其是在 1 小时和 2 小时的时间点:重要的是不要丢弃这个脂肪层,如果它形成。确保将超高肽与脂质层一起转移,并轻轻地将它们混合在一起,以进行甘油三酯测定。
禁食血清脂水平的解释
禁食已被证明可以降低小鼠的总胆固醇水平7,而长期消耗高脂肪含量的饮食增加总胆固醇水平8。胆固醇主要有两种类型:高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。HDL-C被认为是人类的"好"脂质。它携带胆固醇,并运送到肝脏被冲出系统。LDL-C占人类血清中胆固醇的大部分,它们可以在动脉中积聚,导致主要动脉疾病。然而,小鼠缺乏一种重要的酶,胆囊酯转移蛋白(CETP)9,它介于HDL和apoB-脂蛋白10之间交换甘油三酯酯。这给小鼠一个完全不同的脂蛋白颗粒轮廓,与HDL是主要物种。因此,总血清胆固醇水平的变化主要反映了高密度脂蛋白-C水平的变化。
在小鼠和人类中,高血清甘油三酯水平可增加低级炎症,并可能损害心脏功能11,12。但是,HFD 不会增加血清甘油三酯水平。遗传因素可能在代谢条件下的血清甘油三酯水平中起主导作用。血液中的NEFA可以被许多器官大量吸收和利用,被胰岛素和喂养抑制,并增加肾上腺素14。HFD 喂养不会改变血清 NEFA 水平,表明激素提示主导了血清 NEFA 水平的调节。
解释口服脂内清关测试
口服的脂内膜被肠道上皮细胞吸收,并携带在血液中的脂蛋白颗粒中,在那里它被周围器官解放和使用。脂蛋白脂酶活性的变化、外周组织甘油三酯的吸收和氧化将影响血清甘油三酯水平的动态。例如,棕色和米色的脂肪细胞会狂热地氧化脂肪酸,以进行热生产。冷暴露显著增加棕色和米色脂肪细胞活性,加速甘油三酯15的血浆清除。口服脂内耐受性清除测试对于评估冷暴露对甘油三酯代谢的影响至关重要,如第15论文所示。
针对脂肪组织脂化的化合物评估
脂解的激活通过交感神经系统、内分泌因子和各种代谢物传递。许多化合物已被制药公司开发,以促进脂肪组织脂解16,17。评估它们在临床前动物模型(如小鼠)中的疗效对于促进发育过程至关重要。在这里,我们使用β3-肾上腺受体激动剂CL 316,243作为示例,说明我们如何评估小鼠对化合物的反应,以及小鼠是否在不同的代谢状态下对化合物表现出不同程度的敏感度。从示范结果中可以看出,反复使用CL 316,243导致小鼠对治疗失去敏感性。我们使用CL 316,243来说明我们如何评估小鼠对急性治疗的反应;更重要的是,这个概念和设计可以很容易地应用于其他分子针对脂肪组织脂质代谢。
局限性
一些选定的脂质物种提供了关于小鼠脂质代谢的有限信息。由于尾部出血提供的血清量很小,该协议只测量总胆固醇,不区分高密度脂蛋白-C和低密度脂蛋白-C,因为这些检测需要大量的血液。由于小鼠缺乏CETP的方式是独一无二的,总胆固醇是一个很好的近似值,而小鼠体内更多的高密度脂蛋白-C并不表示健康的脂质特征,因此通过区分不同脂蛋白颗粒中的胆固醇而获得的其他信息是有限的。
血清脂水平,包括甘油三酯水平,通常是许多器官以非常动态的方式进行吸收和游览的净效应。解释结果通常只需要一个变量的实验设置。如示范结果所示,C57BL/6J 和 C57BL/6N 小鼠的 C57BL/6N 子系统之间无法得出任何有关脂质吸收或游览的具体结论。然而,在引用的冷暴露研究15中,先前的知识,有时假设可以用来排除来自其他变量的贡献,作者能够确定到特定的组织,并发现棕色脂肪组织有助于增强甘油三酯清除。
最后,新陈代谢是一个动态的过程。脂质代谢通路中一个代谢物的变化只能提供整体状态的快照。为了了解流,需要使用同位素追踪技术进行更复杂的通量研究。
总之,简单性是本协议的力量和弱点。这里提出的三个分析不是为研究特定的脂质代谢途径而设计的,而是为评估一般营养和肥胖研究中的脂质代谢提供初步筛选或起点。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到国家卫生研究院(NIH)的支持,授予R00-DK114498,美国农业部(美国农业部)向Y.Z提供3092-51000-062。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
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