Summary
Este artigo fornece três ensaios fáceis e acessíveis para avaliar o metabolismo lipídico em camundongos.
Abstract
Avaliar o metabolismo lipídico é uma pedra angular da avaliação da função metabólica, e é considerado essencial para estudos de metabolismo in vivo. Lipídios são uma classe de muitas moléculas diferentes com muitas vias envolvidas em sua síntese e metabolismo. É necessário um ponto de partida para avaliar a hemostasia lipídica para pesquisa nutricional e obesidade. Este artigo descreve três métodos fáceis e acessíveis que requerem pouca experiência ou prática para dominar, e que podem ser adaptados pela maioria dos laboratórios para testar anormalidades lipídicas-metabolismo em camundongos. Estes métodos são (1) medir várias moléculas lipídicas de soro de jejum usando kits comerciais (2) ensaios para a capacidade de manuseio de lipídios dietéticos através de um teste de tolerância intralipídica oral, e (3) avaliando a resposta a um composto farmacêutico, CL 316.243, em camundongos. Juntos, esses métodos fornecerão uma visão geral de alto nível da capacidade de manuseio lipída e lipída em camundongos.
Introduction
Carboidratos e lipídios são dois substratos principais para o metabolismo energético. O metabolismo lipídico aberrante resulta em muitas doenças humanas, incluindo diabetes tipo II, doenças cardiovasculares, doenças hepáticas gordurosas e cânceres. Lipídios dietéticos, principalmente triglicérides, são absorvidos pelo intestino no sistema linfático e entram na circulação venosa em chylomicrons perto do coração1. Os lipídios são transportados por partículas de lipoproteína na corrente sanguínea, onde as moieties do ácido graxo são liberadas pela ação da lipoproteína lipase em órgãos periféricos como tecido muscular e adiposo2. As partículas remanescentes remanescentes são limpas pelo fígado3. Camundongos têm sido amplamente utilizados em laboratórios como modelo de pesquisa para estudar o metabolismo lipídico. Com conjuntos genéticos abrangentes disponíveis e um ciclo de reprodução relativamente curto, eles são um modelo poderoso para estudar como os lipídios são absorvidos, sintetizados e metabolizados.
Devido à complexidade do metabolismo lipídico, estudos lipidômicos sofisticados ou estudos de rastreador isotópico são geralmente usados para quantificar coleções de espécies lipídicas ou fluxos metabólicos relacionados a lipídios e destinos4,5. Isso cria um enorme desafio para pesquisadores sem equipamento especializado ou expertise. Neste artigo, apresentamos três ensaios que podem servir como testes iniciais antes de técnicas tecnicamente desafiadoras serem utilizadas. São procedimentos não terminais para os camundongos e, portanto, muito úteis para identificar possíveis diferenças na capacidade de manuseio de lipídios e reduzir os processos afetados.
Primeiro, medir moléculas de lipídios de soro de jejum pode ajudar a verificar o perfil lipídudo geral de um rato. Os camundongos devem ser jejuados, pois muitas espécies lipídicas aumentam após as refeições, e a extensão do aumento é fortemente afetada pela composição da dieta. Muitas moléculas lipídicas, incluindo colesterol total, triglicerídeo e ácido graxo não esterificado (NEFA), podem ser medidas usando um kit comercial e um leitor de placas que podem ler absorvância.
Em segundo lugar, um teste de tolerância intralipídica oral avalia a capacidade de manuseio lipídico como um efeito líquido da absorção e metabolismo. Um intralipídio administrado oralmente causa um pico nos níveis de triglicerídeos circulantes (1-2 horas), após o qual os níveis de triglicerídeos de soro retornam aos níveis basais (4-6 horas). Este ensaio oferece informações sobre o quão bem um rato pode lidar com os lipídios exógenos. Coração, fígado e tecido adiposo marrom são consumidores ativos de triglicérides, enquanto o tecido adiposo branco o armazena como uma reserva de energia. Mudanças nessas funções levarão a diferenças nos resultados dos testes.
Por fim, promover a lipólise para mobilizar lipídios armazenados é considerado uma possível estratégia para a perda de peso. A via de sinalização do receptor β3-adrenérgico no tecido adiposo desempenha um papel importante na lipólise adipócito, e a genética humana identificou uma perda de função polimorfismo Trp64Arg em receptor β3-adrenérgico correlacionado com a obesidade6. Cl 316.243, um agonista específico e potente receptor β3-adrenérgico, estimula a lipólise tecidual adiposa e a liberação de glicerol. A avaliação da resposta de um rato à CL 316.243 pode fornecer informações valiosas sobre o desenvolvimento, melhoria e compreensão da eficácia do composto.
Coletivamente, esses testes podem ser usados como uma tela inicial para alterações no estado metabólico lipídeto dos camundongos. São escolhidos para a acessibilidade dos instrumentos e reagentes. Com os resultados derivados desses ensaios, os pesquisadores podem formar uma imagem geral da aptidão metabólica de seus animais e decidir sobre abordagens mais sofisticadas e direcionadas.
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Protocol
Os animais estão alojados em condições padronizadas após os protocolos experimentais e de cuidados com animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Baylor College of Medicine (BCM). Os animais são alimentados com uma dieta padrão ou especial, ad libitum de água, e mantidos com um ciclo dia/noite de 12 horas.
1. Medição de lipídios de soro de jejum
- Transfira ratos para uma nova gaiola após as 17h e rápido com acesso gratuito à água, durante a noite (com cerca de 16 horas de jejum antes do experimento). O jejum noturno garante o esvaziamento completo dos tratos gastrointestinais dos ratos.
NOTA: Os ratos comem suas fezes durante o jejum, de modo que a retirada de alimentos não pode garantir que eles estejam adequadamente em jejum. - Na manhã seguinte, segure o rato pela cauda e coloque-o em uma superfície. Puxe suavemente na cauda do mouse para colocar o mouse no conterr mais. Coloque a contenção do nariz para retreinar o movimento do mouse enquanto ainda permite que o mouse respire. Aperte o botão da contenção do nariz. Monitore os movimentos torácicos para ter certeza de que o animal está respirando normalmente e minimizar o tempo que um rato passa em restrições.
- Faça uma incisão superficial (nick) na veia traseira do rato em movimento livre, e retire 25 μL de sangue da incisão em um capilar de vidro (preenchendo cerca de 1/3 do capilar) sem conter o mouse. Golpee rapidamente o sangue em um tubo de microcentrifuagem.
- Pare o sangramento usando pós esticéticos, reabasteça a alimentação na gaiola e certifique-se de que os ratos não apresentem sinais de estresse.
- Complete a retirada de sangue para todos os ratos.
- Deixe o sangue coagular deixando-o intacto à temperatura ambiente por 1 hora. Gire as amostras de sangue coagulado a 2.000 x g a 4 °C por 10 minutos em uma microcentrifuagem de bancada refrigerada e transfira supernascer (soro) para análise.
NOTA: O soro pode ser armazenado a -20 °C por várias semanas até a análise. Para armazenamento a longo prazo, mantenha o soro a -70°C. - Analise cada metabólito lipídeído usando o protocolo fornecido pelo fabricante.
2. Teste de Tolerância Intralíide Oral
- Após as 17:00, pese os camundongos para o cálculo do volume intralipíduo a ser dado a eles no dia seguinte. Em seguida, transfira os ratos para uma nova gaiola e acelere-os durante a noite (16 horas).
- Na manhã seguinte, marque caudas dos ratos alojados em uma gaiola para ajudar a identificá-los nas etapas subsequentes de sangramento.
- Faça um corte na veia da cauda e desenhe 15 μL de sangue da incisão em um capilar de vidro (preenchendo cerca de 1/5 do capilar), e rapidamente exploda o sangue em um tubo de microcentrifuuge para T = 0 soro.
NOTA: Não há necessidade de parar o sangramento durante o ensaio, a menos que os ratos apresentem sangramento excessivo. - Ratos gavage 20% intralipídio usando uma agulha de gavage 18G a uma proporção de 15 μl por grama de peso corporal, usando o peso corporal pré-jejum. Empilhe cada mouse por 1 minuto.
NOTA: Pesar o animal e determinar o tamanho adequado da agulha de gavage. Geralmente, uma agulha de gavage calibre 18 é apropriada para ratos >25 g, e uma agulha de gavage calibre 20-22 seria mais apropriada para animais menores. Esmague o rato, segurando a pele sobre os ombros para segurar a cabeça do animal no lugar. Coloque a agulha de gavage na boca e, em seguida, avance suavemente ao longo do paladar superior, até que o esôfago seja alcançado. O tubo deve passar sem resistência. Uma vez que a profundidade adequada é atingida, o Intralipid pode ser administrado lentamente. Remova suavemente a agulha seguindo o mesmo ângulo durante a inserção da agulha após a administração do Intralipid. Devolva o animal para a gaiola e monitore por sinais de respiração trabalhada ou outra angústia.
NOTA: Pesquisadores que são inexperientes com técnicas de gavage oral ou sangramento na cauda podem empilhar cada rato por 2 minutos ou até mais. - Retire sangue em T = 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas: Retire 15 μL de sangue (1/5 capilar) por rato através da hemorragia da cauda, e golpee rapidamente o sangue em um tubo de microcentrifusagem.
- Gire as amostras de sangue a 2.000 x g em temperatura ambiente por 10 minutos em um microcentrifuuge. Transfira o supernatante, incluindo a camada de gordura flutuante, para um tubo PCR para armazenamento. O supernante pode ser armazenado a -20 °C por várias semanas até a análise.
NOTA: O supernaspe deve ser plasma. Se algumas amostras já coagularam até o momento da centrifugação, não afeta a medição de triglicerídeos. - Após a última coleta de sangue, pare o sangramento usando pós esticéticos, reabasteça a ração na gaiola, e certifique-se de que os ratos não mostrem sinais de estresse extremo.
- Carregue 2 μL de padrão triglicerídeo e colecione supernantes em uma placa de 96 poços.
- Adicione 200 μL de reagente de triglicerídeo e deixe a placa incubar por 5 minutos a 37 °C para o desenvolvimento de cores.
- Meça a absorvância a 500 nm com um comprimento de onda de referência de 660 nm em um leitor de placa de laboratório e calcule a concentração da amostra.
3. β3 Receptor Adrenérgico Agonista CL 316.243 Ensaio de Lipólise Estimulada
- Prepare a CL 316.243 como uma solução de estoque de 5 mg/mL (50x) em soro fisiológico estéril e armazene a -20°C até o uso.
- Pela manhã, pese os camundongos para calcular a quantidade de solução CL 316.243 diluída necessária para o experimento. O rato receberá 10 μL por grama de peso corporal de CL diluído 316.243, para uma dose final de 1 mg/kg de peso corporal.
- Transfira os ratos para uma nova gaiola com livre acesso à água, e acelere-os por 4 horas.
- Faça solução 1x CL 316.243 suficiente a partir de estoque 50x usando soro fisiológico. A concentração final da solução 1x CL 316.243 é de 0,1 mg/mL. Use soro fisiológico para o grupo de tratamento de controle.
- Marque as caudas dos ratos alojados na mesma gaiola para fácil identificação durante os degraus sangrando.
- Faça um corte na veia da cauda, e desenhe 15 μL de sangue da incisão em um capilar de vidro (preenchendo cerca de 1/5 do capilar), e rapidamente exploda o sangue em um tubo de microcentrifuuge para T = 0 amostra.
NOTA: Não há necessidade de parar o sangramento durante o ensaio, a menos que os ratos apresentem sangramento excessivo. - Injete solução CL 316.243 diluída (ou controle se incluída no experimento) intraperitoneal a um volume de 10 μL/g de peso corporal. Empilhe cada mouse por 1 minuto. Use um máximo de 5 ratos para cada experimento de 60 minutos, ou 10 ratos para uma equipe de duas pessoas.
- Retirar sangue em T = 5, 15, 30, 60 minutos: saque 15 μL de sangue (1/5 capilar) por camundongo através de sangramento na cauda.
- Após a última coleta de sangue, pare o sangramento usando pós esticéticos, reabasteça a ração na gaiola, e certifique-se de que os ratos não mostrem sinais de estresse extremo.
- Gire amostras de sangue a 2.000 x g a 4 °C durante 5 minutos em uma microcentrifuga refrigerada. Transfira o supernatante para um tubo PCR para armazenamento. O supernante pode ser armazenado a -20°C por várias semanas até a análise.
- Carga 1 μL de 2x padrões de glicerol diluídos serialmente (0,156, 0,312, 0,625, 1,25 e 2,5 mg/ml concentrações equivalentes a trioleina) e coletados supernantes em uma placa de 96 poços. Adicione 100 μL de reagente glicerol livre e deixe a placa incubar por 5 minutos a 37 °C para que a cor se desenvolva.
- Meça a absorvância em 540 nm usando um leitor de placa de laboratório e calcule a concentração da amostra.
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Representative Results
Mostramos com três trechos que cada ensaio oferece informações valiosas sobre o metabolismo lipídico dos camundongos. Para os camundongos machos C57BL/6J, desafiados por oito semanas de alimentação de dieta rica em gordura (HFD) a partir das oito semanas de idade, os níveis totais de colesterol foram significativamente elevados, enquanto os triglicerídeos de soro e NEFA não foram(Tabela 1),sugerindo que o triglicerídeo e o NEFA no sangue não são regulados predominantemente por um desafio de gordura dietética. Na segunda coorte de camundongos, os substrem C57BL/6J e C57BL6/N do C57BL6 foram alimentados com o HFD por oito semanas, começando com oito semanas de idade. Seus níveis de triglicerídeos de soro foram comparados após um desafio intralipído oral. Os resultados demonstraram uma diferença impressionante entre os subestretos 6N e 6J, com 6J tendo um pico significativamente mais alto nos níveis de triglicerídeos séricos após a administração intralipídrica, indicando uma absorção aprimorada ou um desembaraço de triglicerídeo muito mais lento(Figura 1). Por fim, para camundongos C57BL/6J masculinos de oito semanas alimentados com comida normal (NC), um único tratamento CL 316.243 (peso corporal de 1 mg/kg) levou a um aumento significativo no soro glicerol. No entanto, o pré-tratamento intraperitoneal diário de camundongos com 1 mg/kg de peso corporal CL 316.243 por uma semana levou a uma reação contundente à CL 316.243, sugerindo o desenvolvimento da resistência à CL 3116.263 nesses camundongos(Figura 2).
| Parâmetros do soro | NC | HFD | Valor P |
| Colesterol (mg/dL) | 132,7±10,3 | 202.3±8.4 | 0.0002 |
| Triglicerídeos (mg/dL) | 91,7±9.1 | 79,3±4,5 | 0.26 |
| Ácidos graxos não esterificados (mmol/L) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
Tabela 1: Espécies lipídicas de jejum em camundongos alimentados com comida normal (NC) ou dieta rica em gordura (HFD) por oito semanas. Os dados são expressos como valores médios ± SEM. N = 6 para grupo NC, n = 12 para grupo HFD. Ovalor P foi determinado usando o teste t-deduas caudas do Aluno.
Figura 1: Um exemplo de resultados demonstrando a diferença no triglicerídeo sérico de substreinamentos C57BL/6 após um desafio intralipídio oral. Os dados são expressos como valores médios ± SEM. N = 5 para cada grupo. Ovalor P foi determinado usando o teste t-deduas caudas do Aluno em cada ponto de tempo. * p < .05, ** p < .01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um exemplo de resultados demonstrando o desenvolvimento da resistência ao tratamento CL 316.243 em camundongos C57BL/6J após uma semana de tratamento diário cl 316.243. Os dados são expressos como valores médios ± SEM. N = 5 para cada grupo. Ovalor P foi determinado usando o teste t-deduas caudas do Aluno em cada ponto de tempo. ** p < .01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os três ensaios descritos funcionam robustamente no laboratório, com algumas considerações críticas. O jejum noturno é necessário para determinar os níveis lipídes de soro de jejum e o teste de tolerância intralipídica oral. Para o teste de tolerância intralipídida oral, é fundamental girar o sangue à temperatura ambiente para minimizar a formação de uma camada de gordura, especialmente nos pontos de tempo de 1 e 2 horas; é importante não descartar essa camada de gordura se ela se formar. Certifique-se de transferir o supernaente com a camada lipídica, e pipet suavemente para misturá-los para determinação de triglicerídeos.
Interpretação dos níveis lipídes de soro de jejum
O jejum tem sido mostrado para reduzir os níveis totais de colesterol em camundongos7, enquanto dietas cronicamente consumindo alto teor de gordura aumenta os níveis totaisde colesterol 8. Existem dois tipos principais de colesterol: lipoproteína de alta densidade -colesterol (HDL-C) e colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C). HDL-C é considerado o lipídio "bom" em humanos. Ele carrega colesterol e transporta-o para o fígado para ser liberado para fora do sistema. Os LDL-Cs compõem a maior parte do colesterol no soro humano, e podem se acumular em artérias, levando a grandes doenças da artéria. No entanto, os camundongos carecem de uma enzima importante, proteína de transferência de ésteris (CETP)9, que media a troca de triglicérides por colesterol esterificado entre HDL e apoB-lipoproteínas10. Isso dá aos camundongos um perfil de partícula de lipoproteína completamente diferente, com o HDL sendo a principal espécie. Como resultado, uma mudança nos níveis totais de colesterol sérico reflete principalmente mudanças nos níveis de HDL-C.
Tanto em camundongos quanto em humanos, altos níveis de triglicerídeos de soro podem aumentar a inflamação de baixo grau e podem prejudicar a função cardíaca11,12. No entanto, o HFD não aumenta os níveis de triglicerídeos de soro. Fatores genéticos podem desempenhar um papel dominante nos níveis de triglicerídeos séricos sobre as condições metabólicas13. O NEFA no sangue pode ser absorvido avidamente e utilizado por muitos órgãos, suprimido pela insulina e alimentação, e aumentado pela epinefrina14. A alimentação por HFD não altera o nível de NEFA do soro, sugerindo que a sugestão hormonal domina a regulação dos níveis de NEFA sérico.
Interpretação do teste de liberação intralíide oral
Um intralipídio administrado oralmente é absorvido pelas células epiteliais intestinais e transportado em partículas de lipoproteína na corrente sanguínea, onde é liberado e usado por órgãos periféricos. Alterações na atividade lipoproteína da lipase, captação de triglicerídeos de tecido periférico e oxidação afetarão a dinâmica dos níveis de triglicerídeos séricos. Por exemplo, adipócitos marrons e bege avidamente oxidados para a produção de calor. A exposição a frio aumenta significativamente a atividade de adipócito marrom e bege, acelerando o despejo plasmá plasma de triglicerídeos15. O teste de liberação de tolerância intralipídida oral foi crucial para avaliar os efeitos da exposição ao frio no metabolismo de triglicerídeos, como demonstrado no artigo15.
Avaliação de compostos voltados para lipólise tecidual adiposa
A ativação da lipólise é transmitida pelo sistema nervoso simpático, fatores endócrinos e vários metabólitos. Muitos compostos foram colocados em desenvolvimento por empresas farmacêuticas para promover a lipólise tecidualadiposa 16,17. Avaliar sua eficácia em modelos animais pré-clínicos, como camundongos, é fundamental para facilitar o processo de desenvolvimento. Aqui usamos um agonista receptor β3-adrenérgico, CL 316.243, como exemplo para ilustrar como podemos avaliar como um rato responde ao composto e se o camundongo exibe diferentes níveis de sensibilidade ao composto em diferentes estados metabólicos. Como visto nos resultados exemplares, o uso repetido da CL 316.243 causou dessensibilização ao tratamento nos camundongos. Utilizamos cl 316.243 para ilustrar como poderíamos avaliar a resposta de um rato ao tratamento agudo; mais importante, esse conceito e design podem ser facilmente aplicados a outras moléculas visando o metabolismo lipídico do tecido adiposo.
Limitações
Algumas espécies lipídicas selecionadas oferecem informações limitadas sobre o metabolismo lipídico em camundongos. Devido à pequena quantidade de soro disponível a partir do sangramento da cauda, este protocolo mede apenas o colesterol total e não distingue HDL-C e LDL-C, pois esses ensaios requerem quantidades significativas de sangue. Como os camundongos são únicos na forma como não têm o CETP, o colesterol total é uma boa aproximação, e mais HDL-C em camundongos não indica um perfil lipídeco saudável, de modo que as informações adicionais obtidas pela distinção do colesterol em diferentes partículas de lipoproteína são limitadas.
Os níveis lipídes de lipídios de soro, incluindo os níveis de triglicerídeos, são geralmente um efeito líquido de absorção e excursão por muitos órgãos agindo de forma muito dinâmica. Interpretar os resultados geralmente requer uma configuração experimental com apenas uma variável. Como mostrado no resultado exemplar, nenhuma conclusão específica sobre a absorção ou excursão lipídica pode ser feita entre subestres C57BL/6J e C57BL/6N de camundongos C57BL/6. No entanto, no estudo citado de exposição a frio15, conhecimentos prévios e, por vezes, suposições podem ser usados para excluir contribuições de outras variáveis, e os autores foram capazes de fixar um tecido específico e descobriram que o tecido adiposo marrom contribuiu para o melhor desembaraço do triglicerídeo.
Por fim, o metabolismo é um processo dinâmico. A mudança de um metabólito em uma via metabólica lipídica fornece apenas um instantâneo do estado geral. Para entender o fluxo, é necessário um estudo de fluxo mais sofisticado usando técnicas de rastreamento de isótopos.
Em resumo, a simplicidade é tanto o poder quanto a fraqueza deste protocolo. Os três ensaios aqui apresentados não são projetados para o estudo de vias específicas do metabolismo lipídico, mas sim para fornecer um rastreamento inicial ou um ponto de partida para avaliar o metabolismo lipídico em pesquisas gerais de nutrição e obesidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), subvenção R00-DK114498, e pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), conceder CRIS: 3092-51000-062 a Y. Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
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