Summary
本原稿は、マウスの腎腹部大動脈に置かれたカテーテルを介して単一の腎臓への標的送達方法を記述する。
Abstract
腎研究分野における薬物標的の効率的な評価のために、増加し、特定の腎被ばくを可能にする特異的注射の必要性がある。特定の臓器に薬物が蓄積すると、注射剤の性質によっては、有害で望ましくない影響を引き起こす可能性があります。他の組織における波及および/または蓄積を最小限に抑えるために、本明細書記載の方法は、腎動脈に分岐する静脈内大動脈にカテーテルを挿入することによって製剤を腎動脈血流に導き、腎臓が最初に臓器に達し、腎臓全体に製剤を分配する。
本稿は、その方法の詳細な説明、課題と困難を提供します。これは、無菌条件下で精度を必要とするマイクロ手術のこのタイプで熟練するように実験者を導きます。速度は虚血を最小限に抑えるために重要であり、手順を練習することは悪影響を及ぼすことなく正常に注射する可能性を高めます。注射と再灌流の間の時間だけでなく、注入されたボリュームを調節することによって、他の器官への波及のリスクが軽減されます。
この手法は、単一の投下戦略に適していることに注意してください。
Introduction
製薬業界における前臨床研究分野では、モデルとメソッドの開発が日常業務の一部です。血流を介して他の組織に大きな波及/閉じ込めを行うことなく、特定の器官、あるいは臓器の別々のコンパートメントに薬物を導く能力に対する関心が高まっている。これは、異なる疾患領域1、2、3、4のモデルにおける薬物標的の効率的な評価のための増加および特異的暴露を可能にする。
物質を送達する一般的な方法は、この原稿に記載されている方法よりも侵襲性が低いため、全身経路(例えば、尾静脈を介して)によるものである。しかし、全身投与は、意図した標的器官よりも他の組織における化合物の代謝または蓄積の増加のリスクを増大させ、肺、肝臓および脾臓2、3、5などの濾過器官を通過する場合である。運命の組織に到達しないことは別として、これは潜在的に有害および/または望ましくない影響を引き起こす可能性があります, 注射剤の性質に応じて.非常に小さな分子だけが濾過器官の毛細血管を通過し、より大きな分子6で作業する場合は特に標的送達が重要である。
注入された製剤の波及および/または蓄積を最小にするために、他の組織において、本明細書記載の方法は、それが腎動脈に分岐するすぐ下の腹部大動脈に挿入されたカテーテルを通して腎動脈血流に製剤を導き、腎臓が最初に器官に達した。このガイド付き投与のもう一つの利点は、より低い用量/体積が、全身投与 3を介して達成されたのと同じレベルの暴露に達するために使用することができるということです。
他の投与経路は、例えば、腎動脈に直接カテーテルを介して注射を探索されている。私たちの手の中で, これは腎臓に循環を復元するために失敗のリスクが高い提示することが判明しました。.腎動脈の直径が非常に小さい(直径約0.35~0.55mm)と切開が比較的大きくなり、入り口穴を閉じると閉塞や塞栓のリスクが生じます。私たちの経験によると、この方法を使用すると、腎臓への虚血関連の損傷がしばしば起こったので、腎臓を標的とする大きな大オルタの切開を通じて物質を注入することによって、腎臓を標的にすることに成功したこの新しい方法を開発しました。
同様の技術がラットで開発されているが、腎動脈に直接注射を働く狭窄/血栓症の課題とリスクを明らかにする 5.これは、マウスの血管がさらに小さいので、我々の発見を支える。
この原稿とビデオでは、眼底大動脈に挿入されたカテーテルを介してマウスの腎動脈に注射を向ける方法と、手順における一般的な困難を克服する方法についてのガイダンスを詳細に説明し、可能な限り安全な方法で作業し、再現性を高める。
Protocol
実験的な手順は、ヨーテボリ、スウェーデンの地域実験動物倫理委員会によって承認されました。
1. 術前ケア
- 感染を避けるために無菌技術を使用してください。
- 麻酔(例えば、イオブルラン)の下で、可能な限り無菌的な方法で働いて、手術領域を剃り、脱毛クリームで毛皮を取り除く。クリームを約1分間放置します(皮膚にやけどを避けるため最大2分間)。水で丁寧に洗います。この第一ステップは、手術の直前に動物の余分な冷却を避けるために、手術の1〜2日前に行うことが好ましい。
- 目の上に眼用潤滑油を塗布して乾燥を防ぎます。
- 感染を避けるために、手術領域を消毒用の皮膚クレンザーで洗浄し、手術直前に消毒剤(クロルヘキシジン)で領域を拭いてください。
- 鎮痛
- 動物が末期手順でない場合は鎮痛薬で動物を投与する前に:ブプレノルフィン(例えば、テムゲシック)0.05-0.1 mg/kg s.c。
- 抗 凝固 剤
- 血栓を避けるために抗凝固剤を使用してください: 手術の直前に尾静脈を介してヘパリンの10 IU (最大 5 mL/kg).
2. 外科的処置
- 器具をオートクレーブし、滅菌カテーテルを使用します。石鹸とヒビスクラブで急いで洗い流し、フェイスマスク、ヘアネット、無菌の外科用ガウンと手袋を着用してください。第二の人が動物とすべての「汚い」タスクを処理してもらいます。
- 麻酔の場合は、イオブルランを使用してください。5%のイオブルランを使ってマウスを麻酔ボックスに入れることで麻酔を誘発する。誘導後、反射神経と呼吸を確認して麻酔の深さを確認します。
- 手術中にマウスにフェイスマスクを置き、2%イオブルランの維持用量を与える。
- 手術台に置く前に、ヒビスクラブとクロルヘキシジンで動物を洗ってください。
- 麻酔後、熱くなった外科用パッドの上にマウスを置き、低タック粘着テープを使用して上下の手足をパッドに固定します。肺の圧迫を防ぐために、上肢が正常な位置に維持されていることを確認してください。可能であれば、非電気熱源を使用してください。
注:手術中の調整を容易にするため、吸入麻酔(イオブルランなど)を使用しています。 - マウスをラップでドレープし(例えば、プレスンシール)、手術顕微鏡で作業を行います。
- 常に手術領域に生理を加えることによって乾燥から組織を保護します。これはまたティッシュの伸縮性を保つのを助け、外科を行っている間損傷の危険を最小にする。生理液は動物の冷却を避けるために約37°Cでなければなりません。
- 鉗子とはさみで正中切開で腹腔を開いた後、湿った折り畳み、圧縮して他のすべての臓器を押しのけて手術領域を良く見ることができます。
- 手術領域(5 mm鈍いフック)の良い概要を持っているレトラクターを使用してください。
- 大大小と左腎臓を局所化する。
- 2つのマイクロサージャリー鉗子を使用して、腎臓から大歯(2.10.1を参照)と尾行(2.10.2を参照)の両方を腎臓から静かにきれいにし、その下に合字を置きます(6-0シルク)。構造物をつままないように注意してください。組織を優しく伸ばして引っ張り、可能な限り腎動脈に近づけることによって、あなたの方法を働かしてください。血管の周りには、容易に発見できないいくつかの神経があります。損傷した神経は麻痺または他の問題を引き起こす可能性があるので、この覚えておいてください。
- 腎臓(上記)を、この合字を使用して大麦を持ち上げて、注射を行いながら血流を一時的に閉塞する。この位置では、腎動脈の真上、大動脈が反対方向に分岐する(腸に対して、 図1を参照)。この方法で注入を押すことを避けるために、この枝の下に合字を置きます。注入手順を開始するまで、緊張せずに合字を残します。
- Caudally (下) 腎臓, 他の潜在的な枝を避けるために大動脈が腎臓/腎動脈に分岐する場所の近くに切開を置きます.腎臓から尾大動脈は腹部静脈に非常に近い。静脈を損傷しないように非常に注意してください。
- 注射
- すべての合字が整っている場合。最初に下の合字を伸ばし、上合字を伸ばして血流を閉塞させ、注入された液体を腎臓に向ける。
- 鍼針(Ø 0.25 mm)を使用して、カテーテルの先端(32GA)を大間に穿刺して導き、射出中に移動したり漏れたりしないように合字に1つの結び目を付けて固定します。(図1)。はさみの代わりに鍼治療針を使用すると、血管内の最小限の入り口穴を作ります。
- 50 μLの液体を注入します。腎臓は青白くなり、注射が腎臓を浸透させ、運命の場所に終わったことを示す。
- この時点で、2 つの異なるシナリオが考えられます。
- 入り口穴を閉じる前に、上合字の緊張を慎重に緩めることによって腎臓に循環を返します。このようにして虚血は改善されるが、注入された液体は潜在的に腎静脈を介して急速にクリアされ、したがって十分な留まる時間を許さないことに注意してください。
- または血流を返さずに手術を進める。
- 上合字を再び締めた後、カテーテルを引き出し、大間を縫合し、完全な循環を返す。
- カテーテルを保持している合字を取り外します。
- カテーテルを撤回します。
- 入口穴を単一のステッチ(エチロン11-0、丸み針)で縫合する。
- まず、下の合字を緩め、次に非常にゆっくりと上の合字を緩めます。漏れがある場合は、もう一度合字を締め、数秒待ってからもう一度やり直してください。虚血損傷を避けるために、虚血時間の合計を最大5〜10分に保ちます。
- 領域を押して固体をテストし、脈動を探し、腎臓が再循環が確立されていることを再確認するために「正常な着色」に戻ることを確認します。
- 糸を切り、大間の下の合字を取り除きます。
- 圧縮を取り除き、腸を所定の位置に押し戻します。腹腔に生理食糸を加え、腹膜(Vicryl 6-0)を縫合してから、皮膚を金属クリップで閉じる前に、いくつかの流体を返します。
- 動物を目覚めさせる前に、皮下のレヒドレックスの0.7-1 mLを与えられる。
注:全体の手順は、十分な訓練を受けた緊急のために約30〜45分かかります。
3. 術後ケア
- ケージの一部の下に加熱パッド(約38°C)を配置し、手術後2〜3日間、動物が暖かい環境で目を覚ますことができます。
- 麻酔を提供し続ける (ブプレノルフィン, 例えば, テムゲシック 0.05-0.1 mg/kg s.c.) 2-3 回/日手術後 3 日間.
- 動物が脱水症状を示す場合は、時に10 mL/kgのレハイドレックス.cを与える。
Representative Results
映画は最高のビデオ品質を持つものを提示するために、異なる手術からのビデオのミックスです。いくつかのシーケンスは、マウスが目を覚ますはずの練習セッションから取られています。したがって、マウスは必ずしも適切にドレープされません。動物が目を覚ますとき、私たちは常に無菌的な方法で働きます。
組織学的分析は、腎動脈に直接注射を行うことは、結果として不可逆性虚血を伴う血流の不十分な再循環のために腎臓損傷を引き起こすことを明らかにした(図2)。腹部大動脈を通る注射は、一方、虚血性損傷を引き起こさなかった(図3)。
大石を介した灌流が腎臓を最初に到達した器官となるのを可視化するために、エバンスブルー色素を用いた(図4)。他の器官は、腎静脈を通過するまで青くならない。
我々はまた、この方法を用いて、間葉系幹細胞を用いて浸透した腎臓に注入された製剤の生着を増加させることができることを示した(図5)。
上の写真:左腎臓の最初の合字を配置する場所を記述します。中央の画像:カテーテルの配置直前の手術領域の概要(プロトコルで2.11)。下の写真:注射直前の手術領域の概要(プロトコルでは2.10)
図2:腎動脈への直接注射 腎動脈にNaClを直接注入した研究の設計、およびIHC結果は、 この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図3:大起節投与後7日目のIHC結果。 IHCは、腹部大動脈を介して腎動脈へのNaClの注入を伴う研究から結果、 注射の7日後 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:エバンスブルー染料の注入 エバンスブルー染料の大オルタを介した注射の連続図を示す上図。エバンスブルー染料の大動脈を介して注射後の腎臓の断面を示す下の写真。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:腹動脈注入は、右腎臓と比較して、左腎臓における間葉系幹細胞の生着を有意に増加させた。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、懸濁液中にCM-Dil(赤色蛍光)で標識した。100万個の標識されたMSCが3匹のマウスで腹動脈を介して注入された。MSD注入の3時間後、マウスを終了させた。左右の腎臓は収穫され、凍結切断のためにOCTに埋め込まれた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
この方法は、腎損傷を引き起こすことなく、腎臓に製剤を提供することに成功しています.これは、製剤(例えば、小分子、茎/前駆細胞、またはマイクロベシクル)の任意の種類の送達に使用することができます。この方法は、健康な動物または腎疾患モデルに適用することができる。
図2と図3では、神学を示しています。図2は、輸液後180分のヒストロジーを示し、図3は注入後7日目の歴史を示す。その理由は、腎動脈の実験がわずか180分であったためです。この新しい方法で慢性的な損傷がないことを確認するために、我々は意図的にそれらを評価するために7日間待ちました。n 個の数値は小さいですが、これは単なる例です。
この新しく開発した大オルタ投与法は、比較的低いスループットを有する侵襲的な方法であり、単一投下戦略にのみ適している。この方法では、繰り返しのドージングはできません。
合字配置のわずかな調整により、この方法は、両方の腎臓を5,7に注入するために使用される可能性があります。大動脈分岐による波及のリスクの増加に伴い、閉塞した合字を腎臓にできるだけ近づけることに決め、左腎臓への注射のみを導いた。また、他のモデルや、ウニネフレトミーのような技術、あるいはおそらく同時腎虚血再灌流傷害(IRI)に加えて使用することができる。私たちの意見では、IRI3手術後わずか24時間で注射を行うことはあまりにも厳しく、動物の回復に大きな影響を与えます。
新しいマウス株を使用する場合は、その菌株の一部の動物に対してパイロット実験を行い、その方法を何らかの方法で調整する必要がないことを確認する必要があります。例えば、大大体からの血管分岐をある株において、少し異なる位置に置くことができる。合字の位置は、製剤が適切な位置で終わることを確実にするためにいくらか変わるかもしれません。
脱水
腹腔を開くことは脱水症状の大きなリスクをもたらす。従って手術の間および後の両方の液体(37°Cの周り)を加える必要がある後、回復の基礎を維持するためには、術後に。通常、手術後に1mL/マウス.c与えます。
虚血
長時間の手術時間または完全な再循環に達しなかった場合は虚血をもたらす。実際の虚血時間を記録し、腎臓(および後ろ足)への循環が回復することを確認することが重要です。常にトレーニングを行い、スキルをリフレッシュすることが重要です。より速く手順を実行すると、腎臓が虚血にさらされる時間が短縮されます。虚血時間(大大通りの結紮)を5分(最大10分)程度に保つことは、腎臓に害を与えないことが示されている。
波及
注入された製剤が腎静脈を通して循環に再入するとき、他の器官への波及の危険性を考慮して、注入された容積は最小限に抑えるべきである。最大体積50 μLを推奨します。
副作用 (血栓症と麻痺)
当初、モデルを設定する際に、後ろ足の麻痺に関する不整合の問題が発生しました。抗凝固剤の関連用量(尾静脈のヘパリンの10 IU)の投与後、この有害作用は有意に減少した。また、現場の専門家に相談した後、私たちはまた、外傷性手術、つまり組織につままず、できるだけ少ない領域に触れることに、さらに注意を払い始めました。これらの行動は、麻痺の頻度を約50%から事実上なしに減少させた。
当初、方法開発中に、腎動脈に抗凝固組織を適用して切開穴を閉じた。大大間の圧力が非常に高いので、大間への注射を行うとき、これは不可能でした.抗凝固剤はまた、血管内腔に入ると血栓症のリスクを高める。
アドベンチシアは非常に血栓性であるため、縫合時に大大門の内腔にエクスポーズを起こす必要はありません。また、巻きエッジを反転したり、大腿に縫合することによって大間を狭くすることを避けます。
私たちは今、腎臓に直接製剤を提供するための確立された方法を持っています。
Disclosures
著者は開示するものは何もない。
Acknowledgments
特別な設計カテーテルを製造する上でコラボレーションのための技術とインステックラボを微調整するのを助けてくれたRRSSCのルネ・レミーに感謝します。AstraZeneca R&D の同僚の皆さんも、ヒントやコツやゼロックスでの音声でビデオを完成させるための生産的な議論に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
