Direkte levering af lægemidler til nyrerne via nyrepulsåren

Summary

Dette manuskript beskriver en metode til målrettet levering til en enkelt nyre via et kateter placeret i infrarenal abdominal aorta i musen.

Abstract

Der er behov for direkte injektioner for at muliggøre øget og specifik nyreeksponering for effektiv evaluering af narkotikamål på nyreforskningsområdet. Akkumulering af lægemidler i visse organer kan give anledning til negative og uønskede virkninger, afhængigt af intravenøst stofbrug. For at minimere afsmittende virkninger og/eller akkumulering i andre væv dirigerer den heri beskrevne metode formuleringen ind i nyrepulsårens blodbanen ved at indsætte et kateter i infra renal aorta, lige under hvor det forgrener sig i nyrepulsåren, hvilket resulterer i nyrerne som først nået organ og distribution af formulering i hele nyrerne.

Dette manuskript giver en detaljeret beskrivelse af metoden samt dens udfordringer og vanskeligheder. Det guider eksperimentatoren til at blive dygtig med denne type mikrokirurgi, der kræver nøjagtighed under sterile forhold. Hastighed er afgørende for at minimere iskæmi og praktisere proceduren vil øge chancen for vellykkede injektioner uden bivirkninger. Ved at modulere tiden mellem injektion og genfusion samt det injicerede volumen mindskes risikoen for afsmitning til andre organer.

Bemærk, at denne teknik er velegnet til enkelt doseringsstrategier.

Introduction

På det prækliniske forskningsfelt inden for medicinalindustrien er model- og metodeudvikling en del af det daglige arbejde. Der er en stigende interesse for evnen til at dirigere lægemidler til bestemte organer, eller endda separate rum i et organ, uden større spillover / entrapment, via blodbanen, i andre væv. Dette for at muliggøre øget og specifik eksponering for effektiv evaluering af narkotikamål i modeller af forskellige sygdomsområder ^1,2,3,4.

En almindelig måde at levere stoffer på er ved hjælp af systemiske ruter (f.eks. via haleåren), da det er mindre invasivt end den metode, der er beskrevet i dette manuskript. Systemisk indgift øger imidlertid risikoen for øget metabolisme eller akkumulering af forbindelsen i andre væv end det tilsigtede målorgan, når de passerer gennem filtreringsorganer som lungerne, leveren og milten ^2,3,5. Bortset fra ikke at nå det bestemt væv, kan dette potentielt give anledning til negative og / eller uønskede virkninger, afhængigt af arten af injicerat. Kun meget små molekyler passerer kapillærerne i filtreringsorganer, og derfor er målrettet levering særlig vigtig, hvis man arbejder med større molekyler ⁶.

For at minimere spillover og / eller ophobning af injiceret formulering, i andre væv, den heri beskrevne metode dirigerer formuleringen ind i nyrepulsåren blodbanen gennem et kateter indsat i abdominal aorta lige under, hvor det grene ind i nyrepulsåren, hvilket resulterer i nyrerne som først nået organ. En anden fordel ved denne styrede indgift er, at der kan anvendes en lavere dosis/volumen for at opnå det samme eksponeringsniveau som ved systemisk indgift ³.

Andre indgiftsveje er blevet undersøgt, for eksempel injektioner via et kateter direkte ind i nyrepulsåren. I vores hænder viste dette sig at udgøre en højere risiko for manglende gendannelse af cirkulationen til nyrerne. Nyrepulsårens meget lille diameter (ca. 0,35-0,55 mm i diameter) gør snittet relativt stort og udgør en risiko for obstruktion og/eller blodprop, når indgangshullet lukkes. Ifølge vores erfaring opstod der ofte iskæmisk-relateret skade på nyrerne, når vi brugte denne metode, og vi udviklede derfor denne nye måde at målrette nyrerne på ved at injicere stoffer gennem indsnit i den større aorta for at målrette nyrerne.

Der er lignende teknikker, der udvikles hos rotter, der også manifesterer udfordringerne og risikoen for stenose / trombose, der arbejder med injektioner direkte ind i nyrepulsåren ⁵. Dette understøtter vores resultater, da fartøjerne i mus er endnu mindre.

Dette manuskript og video beskriver i detaljer, hvordan injektioner kan ledes ind i nyrepulsåren hos mus gennem et kateter indsat i infrarenal aorta, samt vejledning i, hvordan man overvinder fælles vanskeligheder i proceduren, at arbejde på den sikreste måde muligt og derved øge reproducerbarheden.

Protocol

Forsøgsprocedurer blev godkendt af det regionale laboratorium Animal Ethics Committee i Göteborg, Sverige.

1. Præoperativ pleje

1. Brug sterile teknikker til at undgå infektioner.
   1. Under anæstesi (f.eks isoflurane) og arbejder på den mest aseptiske måde muligt, barbere kirurgi område og fjerne pelsen med en hårfjerning creme. Lad cremen stå i ca. 1 minut (højst 2 minutter for at undgå hudforbrændinger). Vask forsigtigt med vand. Dette første skridt kan helst gøres 1-2 dage før operationen for at undgå ekstra afkøling af dyret lige før operationen.
   2. Påfør oftalmisk smøremiddel på øjnene for at forhindre tørhed.
   3. For at undgå infektioner skal du vaske det kirurgiske område med antiseptisk hudrens og tørre området med desinfektionsmiddel (chlorhexidin) lige før operationen.
2. Analgesi
   1. Fordosis dyret med smertestillende midler, hvis det ikke er en terminal procedure: Buprenorphin (f.eks temgesic) 0,05-0,1 mg/kg s.c.)
3. Antikoagulantia
   1. Brug antikoaguleringsmidler for at undgå blodpropper: 10 IE heparin gennem haleåren lige før operationen (højst 5 mL/kg).

2. Kirurgisk procedure

1. Autoklaver instrumenterne og brug sterile katetre. Få den kraftige vask op med sæbe og hibiscrub og brug en ansigtsmaske, et hårnet og en steril kirurgisk kjole og handsker. Har en anden person håndtere dyrene og alle "beskidte" opgaver.
2. Til anæstesi, brug isoflurane. Fremkald anæstesi ved at placere musen i en anæstesikasse med 5% isofluran. Efter induktionen skal du kontrollere anæstesiens dybde ved at kontrollere reflekser og vejrtrækning.
   1. Under operationen skal du placere en ansigtsmaske på musen for at give en vedligeholdelsesdosis på 2% isofluran.
3. Vask dyret med hibiscrub og chlorhexidin, før det sættes på det kirurgiske bord.
4. Efter bedøvelse, placere musen på en opvarmet kirurgisk pad i en liggende position og fastsætte de øvre og nedre lemmer til puden ved hjælp af lav-tack tape. Sørg for, at de øvre ekstremiteter holdes i en normal position for at forhindre lungekompression. Hvis det er muligt, skal du bruge en ikke-elektrisk varmekilde.
   BEMÆRK: Vi bruger inhalationsbedøvelse (f.eks. isoflurane) for lettere justeringer under operationen.
5. Drapere musen med plastfolie (f.eks Press'n Seal) og udføre arbejdet med et kirurgisk mikroskop.
6. Beskyt vævene mod tørring ved konstant at tilføje saltvand i operationsområdet. Dette hjælper også med at holde vævet elastisk og minimerer risikoen for skader, mens du udfører operationen. Saltvandet skal være omkring 37 °C for at undgå afkøling af dyret.
7. Efter åbning af bughulen med en midterlinje snit med pincet og saks, skal du bruge en fugtig, foldet, komprimere til at skubbe alle andre organer til side for at få et godt overblik over kirurgi området.
8. Brug retractorer til at få et godt overblik over operationsområdet (5 mm stump krog).
9. Lokalisere aorta og venstre nyre.
10. Ved hjælp af to mikrokirurgi pincet, forsigtigt rense aorta, både cranially (se 2.10.1) og kaudalet (se 2.10.2) fra nyrerne, fra omkringliggende væv og placere en ligatur under det (6-0 Silke). Pas på ikke at klemme nogen strukturer. Arbejd dig ind ved forsigtigt at strække og trække vævene og komme så tæt på nyrepulsåren som muligt. Omkring fartøjerne er der flere nerver, der ikke let opdages. Husk dette, da beskadigede nerver kan forårsage lammelse eller andre problemer post operatively.
    1. Cranially (ovenfor) nyrerne, skal du bruge denne ligatur til at løfte aorta til et øjeblik okkluderet blodgennemstrømningen, mens du udfører injektionen. I denne position, lige over hvor nyrepulsåren, forgrener aortaen sig i den modsatte retning (til tarmene, se figur 1). For at undgå at skubbe injektionen på denne måde, skal du sætte ligaturen under denne gren. Forlad ligaturen uden spænding, indtil injektionsproceduren påbegyndes.
    2. Caudally (nedenfor) nyrerne, placere snittet tæt på, hvor aorta grene til nyre / nyrearterie for at undgå andre potentielle grene. Caudally fra nyrerne aorta er meget tæt på abdominal venen. Vær meget forsigtig med ikke at beskadige venen.
11. Injektion
    1. Når alle ligaturer er på plads; stræk først den nederste og for det andet den øvre ligatur for at okkluderede blodbanen for at lede den injicerede væske til nyrerne.
    2. Ved hjælp af en akupunkturnål (Ø 0,25 mm) punkteres og føres kateterets (afrundede) spids (32GA) ind i aortaen, og den fastgøres med en enkelt knude på ligaturen, så den ikke bevæger sig eller lækker under injektionen. (Figur 1). Ved hjælp af en akupunktur nål i stedet for en saks gøre det muligt at gøre en minimal indgang hul i fartøjet.
    3. Der injiceres 50 μL væske. Nyrerne skal blive blege, hvilket indikerer, at injektionen har perfunderet nyrerne og endte på det bestemt sted.
    4. På dette tidspunkt er der to forskellige scenarier muligt.
       1. Giv nogle cirkulation tilbage til nyrerne ved forsigtigt løsne spændingen i den øverste ligatur, før du lukker indgangshullet. Denne måde iskæmi er forbedret, men vær opmærksom på, at den injicerede væske potentielt kan ryddes hurtigt via nyre venen og dermed ikke tillader nok dvæle tid.
       2. Eller fortsæt med operationen uden at give blodgennemstrømningen tilbage.
    5. Efter at have strammet den øverste ligatur igen, skal du trække kateteret tilbage, suturere aortaen og give fuld cirkulation tilbage.
       1. Fjern ligaturen, der holder kateteret.
       2. Træk kateteret tilbage.
       3. Sutur indgangshullet med en enkelt søm (ethilon 11-0, afrundet nål).
       4. Først løsne den nederste ligatur og derefter meget langsomt løsne den øverste. Hvis der er lækage stramme ligaturen igen, vente et par sekunder og prøv igen. Hold den samlede iskæmi tid til højst 5-10 minutter for at undgå iskæmisk skade.
       5. Test soliditeten ved at skubbe området og kigge efter pulsationer og sørge for, at nyrerne vender tilbage til "normal farve" for at sikre, at recirkulering er etableret.
       6. Skær trådene og fjern ligaturerne under aorta.
       7. Fjern kompresset og skub tarmene tilbage på plads. Giv tilbage nogle væsker, ved at tilføje saltvand i bughulen og sutur peritonea (Vicryl 6-0), før du lukker huden med metal klip.
       8. Før man vågner op, får dyrene 0,7-1 mL Rehydrex subkutalt.
          BEMÆRK: Hele proceduren tager omkring 30-45 minutter for en veluddannet overspænding.

3. Postoperativ pleje

1. Lad dyrene vågne op i et varmt miljø ved at placere en varmepude (ca. 38 °C) under en del af buret i 2-3 dage efter operativt.
2. Fortsætte med at give analgesi (Buprenorphin, f.eks. temgesic 0,05-0,1 mg/kg s.c.) 2-3 gange om dagen i 3 dage efter operativt.
3. Giv 10 mL/kg Rehydrex s.c. lejlighedsvis, hvis dyrene udviser tegn på dehydrering.

Representative Results

Filmen er en blanding af videoer fra forskellige operationer for at præsentere dem med den bedste videokvalitet. Nogle sekvenser er taget fra øvelsessessioner, hvor musen ikke skal vågne op. Derfor er musen ikke altid korrekt draperet. Når et dyr skal vågne op, arbejder vi altid på en aseptisk måde.

Histologiske analyser viste, at udførelsen af injektionerne direkte i nyrepulsåren gav anledning til nyreskader, sandsynligvis på grund af utilstrækkelig recirkulering af blodgennemstrømningen med irreversibel iskæmi som følge heraf (figur 2). Injektion gennem abdominal aorta forårsagede derimod ingen iskæmisk skade (figur 3).

Evans blå farvestof blev brugt til at visualisere, at perfusion via aorta vil resultere i nyrerne er den første nåede organ (Figur 4). Ingen andre organer blev blå, før efter passagen ud gennem nyre venen.

Vi har også vist, at vi ved hjælp af denne metode kan øge engraftment af injicerede formuleringer til den perfunderede nyre ved hjælp af mesenchymale stamceller (Figur 5).

Figur 1: Placering af suturer og kateter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Øverste billede: Beskriver, hvor man skal placere den første ligatur, cranially af venstre nyre. Mellembillede: Oversigt over operationsområdet lige før kateterets placering (2.11 i protokol). Nederste billede: Oversigt over operationsområdet lige før injektion (2.10 i protokol)

Figur 2:Injektioner direkte i nyrepulsåren. Design af, og IHC resultater fra, en undersøgelse med injektion af NaCl direkte ind i nyrepulsåren Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: IHC-resultater på dag 7 efter aorta-administration. IHC resultater fra en undersøgelse med injektion af NaCl i nyrepulsåren via abdominal aorta, 7 dage efter injektion Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4:Injektion af Evans blå farvestof. Top billede, der viser en seriel visning af en injektion via aorta af Evans blå farvestof. Nederste billede, der viser et tværsnit af en nyre efter injektion via aorta af Evans blå farvestof. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Infusion af abdominal arteriel arteriel signifikant øget engraftment af mesenchymale stamceller i venstre nyre sammenlignet med højre nyre. Human knoglemarv afledt mesenchymale stamceller blev mærket med CM-Dil (rød fluorescens) i suspension. En million mærket MSCs blev infunderet gennem abdominal arterie i tre mus. Tre timer efter MSD-infusionen blev mus afsluttet. Venstre og højre nyrer blev høstet og indlejret i OCT for cryosectioning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne metode har haft succes med at levere formuleringer til nyrerne uden at forårsage nyreskader. Det kan bruges til levering af enhver form for formuleringer (f.eks små molekyler, stamceller / stamceller, eller mikrovesicles). Metoden kan anvendes i sunde dyr eller i nyresygdomsmodeller.

I figur 2 og figur 3præsenteres histologien. Figur 2 viser histologi 180 minutter efter perfusion, mens figur 3 viser historien 7 dage efter infusionen. Årsagen til dette er, at eksperimenterne med nyrearterie kun var 180 minutter lange. For at være sikker på, at vi ikke havde nogen kronisk skade med denne nye metode, ventede vi med vilje 7 dage på at evaluere dem. N-tallet er lille, men dette er blot et eksempel.

Bemærk, at denne nyudviklede metode til aorta administration til at målrette nyrerne er en invasiv metode med relativt lav gennemstrømning og er kun egnet til enkelt doseringsstrategier. Gentagen dosering er ikke mulig med denne metode.

Med mindre justeringer af ligaturplaceringerne kunne denne metode muligvis bruges til at tilføre begge nyrer simultaniously^5,7. Med den øgede risiko for spillover gennem aorta forgrening besluttede vi at holde okkluderende ligatur så tæt på nyrerne som muligt, hvilket fører injektionen til venstre nyre kun. Det kan også bruges i tillæg til andre modeller eller teknikker som uninephrectomy eller måske endda samtidig nyreiskæmi reperfusion skade (IRI). Efter vores mening er injektionen kun 24 timer efter IRI^{3-operationen} for hård og vil påvirke dyrets genopretning betydeligt.

Når man bruger nye musstammer, bør man altid udføre et pilotforsøg på nogle dyr fra denne stamme for at sikre, at metoden ikke behøver at blive justeret på en eller anden måde. For eksempel kan karforgreningen fra aortaen i nogle stammer placeres lidt anderledes. Ligaturernes position kan ændre sig noget for at sikre, at formuleringen ender på det rigtige sted.

Dehydrering
Åbning af bughulen udgør en stor risiko for dehydrering. Det er derfor bydende nødvendigt at tilsætte væsker (ca. 37 °C) både under og efter operationen for at sikre et godt grundlag for nyttiggørelse post operatively. Vi plejer at give 1 mL/mus s.c. efter operationen.

Iskæmi
Forlænget operationstid, eller hvis det ikke lykkes at opnå fuld recirkulering, vil det resultere i iskæmi. Det er vigtigt at registrere den faktiske iskæmi tid og sørg for, at omsætning til nyrerne (og bagbenene) er genoprettet. Konstant træning og forfriskende færdigheder er som altid vigtigt. Udførelse af proceduren hurtigere reducerer den tid, nyrerne udsættes for iskæmi. At holde iskæmitiden (ligation af aorta) til ca. 5 min (10 min max) har vist sig ikke at skade nyrerne.

Afsmitning
I betragtning af risikoen for afsmitning til andre organer, når den injicerede formulering igen kommer i omløb gennem nyreåren, bør det injicerede volumen holdes på et minimum. Vi anbefaler et maksimalt volumen på 50 μL. Dosering har også af andre vist sig at være en kritisk faktor for effektivitet³.

Bivirkninger (trombose og lammelse)
I første omgang, når du opretter den model, vi oplevede ikke-konsekvente problemer med lammelse i bagbenene. Efter relevant dosis antikoagulant (10 IE heparin i haleåren) præoperativt blev denne skadelige virkning signifikant reduceret. Efter at have konsulteret eksperter på området begyndte vi også at være endnu mere forsigtige med at arbejde med atraumatisk kirurgi, hvilket betyder, at vi ikke klemmede i væv og rørte så lidt områder som muligt. Disse foranstaltninger reducerede tilsammen hyppigheden af lammelse fra ca. 50 % til næsten ingen.

I første omgang under metodeudvikling anvendte vi antikoagulerende væv på nyrearterien for at lukke snithullet. Dette var ikke muligt, når du foretager injektioner i aorta, da trykket er så meget højere i aorta. Antikoagulant øger også risikoen for trombose, hvis det kommer ind i fartøjet lumen.

Sørg for ikke at have adventitia udsat i aortaens lumen, når du syr siden adventitia er meget thrombogenic. Undgå også at vende sårkanter eller indsnævre aorta ved at suturere til låret.

Vi har nu en etableret metode til at levere formuleringer direkte til nyrerne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt hook 5mm 8/pack	Cooper surgical	3316-8G
ETHILON Nylon Suture 11/0	Ethicon	W2881	For vessel
Microsurgery forceps curved	Karo Pharma	FRC-15 RM-8
Microsurgery forceps straight	Karo Pharma	FRS-15 RM-8
Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga	Instech	C07SS-MRA1813
Vicryl, 6-0, BV-1 needle	Angthos	W9575	For abdominal cavity