Summary
Detta manuskript beskriver en metod för riktad leverans till en enda njure via en kateter placerad i den infrarenala buken aortan i musen.
Abstract
Det finns ett behov av riktade injektioner för att möjliggöra ökad och specifik njurexponering för effektiv utvärdering av läkemedelsmålen inom njurforskningsområdet. Ackumulering av läkemedel i vissa organ kan ge upphov till negativa och oönskade effekter, beroende på injiceras natur. För att minimera spridning och/eller ackumulering i andra vävnader leder den häribeskrivna metoden formuleringen i njurartärens blodomlopp genom att föra in en kateter i den infra njuraorta, strax under där den förgrenar sig i njurartären, vilket resulterar i njuren som först nått organ och distribution av formulering i hela njuren.
Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av metoden, liksom dess utmaningar och svårigheter. Den vägleder experimenteraren att bli skicklig med denna typ av mikrokirurgi som kräver noggrannhet under sterila förhållanden. Hastighet är avgörande för att minimera ischemin och att öva förfarandet kommer att öka risken för framgångsrika injektioner utan negativa effekter. Genom att modulera tiden mellan injektion och reperfusion samt den injicerade volymen minskar risken för spridning till andra organ.
Observera att den här tekniken är lämplig för strategier för enkel dosering.
Introduction
Inom det prekliniska forskningsområdet inom läkemedelsindustrin är modell- och metodutveckling en del av det dagliga arbetet. Det finns ett ökande intresse för förmågan att rikta läkemedel till specifika organ, eller till och med separata avdelningar i ett organ, utan större spridning/ infällning, via blodomloppet, i andra vävnader. Detta för att möjliggöra ökad och specifik exponering för effektiv utvärdering av läkemedelsmål i modeller av olika sjukdomsområden 1,2,3,4.
Ett vanligt sätt att leverera ämnen är genom systemiska vägar (t.ex. via svansvenen) eftersom det är mindre invasivt än den metod som beskrivs i detta manuskript. Systemisk administrering ökar dock risken för ökad metabolism eller ackumulering av föreningen i andravävnaderän det avsedda målorganet, när man passerar genom filtreringsorgan som lungan, levern och mjälten 2,3,5. Bortsett från att inte nå den avsedda vävnaden kan detta potentiellt ge upphov till negativa och/eller oönskade effekter, beroende på injiceras natur. Endast mycket små molekyler passerar kapillärerna i filtreringsorgan och därför är riktad leverans särskilt viktig om man arbetar med större molekyler 6.
För att minimera spillover och/eller ackumulering av injicerad formulering, i andra vävnader, leder den härin beskrivna metoden formuleringen in i njurartärens blodomlopp genom en kateter som sätts in i bukaortan strax under där den förgrenar sig i njurartären, vilket resulterar i njuren som först nått organ. En annan fördel med denna guidade administrering är att en lägre dos/volym kan användas för att uppnå samma exponeringsnivå som uppnås genom systemisk administrering 3.
Andra administreringsvägar har undersökts, till exempel injektioner via en kateter direkt i njurartären. I våra händer konstaterades detta utgöra en högre risk för underlåtenhet att återställa cirkulationen till njuren. Njurartärens mycket lilla diameter (ca 0,35-0,55 mm i diameter) gör snittet relativt stort och utgör en risk för obstruktion och/eller emboli vid stängning av ingångshålet. Enligt vår erfarenhet inträffade ofta skandinaviska skador på njuren när vi använde denna metod, och vi utvecklade därför detta nya sätt att framgångsrikt rikta in njuren genom att injicera ämnen genom snitt av den större stora aortan för att rikta in njuren.
Det finns liknande tekniker som utvecklas hos råttor som också manifesterar utmaningarna och risken för stenos / trombos som arbetar med injektioner direkt i njurartären 5. Detta stöder våra resultat eftersom kärlen hos möss är ännu mindre.
Detta manuskript och video beskriver i detalj hur injektioner kan riktas in i njurartären hos möss genom en kateter som sätts in i den infrarenala aortan, samt vägledning i hur man kan övervinna vanliga svårigheter i förfarandet, att arbeta på säkrast möjliga sätt och därmed öka reproducerbarheten.
Protocol
Experimentella försök godkändes av Göteborgs regionala djuretiska kommitté.
1. Preoperativ vård
- Använd sterila tekniker för att undvika infektioner.
- Under anestesi (t.ex. isofluran) och arbeta på det mest aseptiska sättet som möjligt, raka operationsområdet och ta bort pälsen med en hårborttagningskräm. Låt grädden vara i cirka 1 minut (högst 2 minuter för att undvika brännskador i huden). Tvätta försiktigt med vatten. Detta första steg kan helst göras 1-2 dagar före operationen för att undvika extra kylning av djuret precis före operationen.
- Applicera oftalmiskt smörjmedel på ögonen för att förhindra torrhet.
- För att undvika infektioner, tvätta operationsområdet med antiseptisk hudrengöringsmedel och torka området med desinfektionsmedel (klorhexidin) precis före operationen.
- Smärtlindring
- Fördos djuret med smärtstillande medel om det inte är ett terminalt förfarande: Buprenorfin (t.ex. temgesic) 0,05-0,1 mg/kg s.c.)
- Antikoagulantia
- Använd antikoagulantia för att undvika blodproppar: 10 IE heparin genom svans venen precis före operationen (högst 5 ml/kg).
2. Kirurgiskt ingrepp
- Autoklavera instrumenten och använd sterila katetrar. Få överspänningen att tvätta sig med tvål och hibiskusb och bär ansiktsmask, hårnät och steril operationsrock och handskar. Ha en andra person som hanterar djuren och alla "smutsiga" uppgifter.
- För anestesi, använd isofluran. Inducera anestesi genom att placera musen i en anestesilåda med 5% isofluran. Efter induktionen, kontrollera anestesidjupet genom att kontrollera reflexer och andning.
- Under operationen, placera en ansiktsmask på musen för att ge en underhållsdos på 2% isofluran.
- Tvätta djuret med hibiskrud och klorhexidin innan du lägger på operationsbordet.
- Efter bedövning, placera musen på en uppvärmd kirurgisk kudde i ett supin läge och fixera de övre och nedre extremiteterna på dynan med hjälp av låghäftande tejp. Se till att de övre extremiteterna bibehålls i normalt läge för att förhindra lungkompression. Använd om möjligt en icke-elektrisk värmekälla.
OBS: Vi använder inandningsbedövning (t.ex. isofluran) för enklare justeringar under operationen. - Drapera musen med plastfolie (t.ex. Press'n Seal) och utför arbetet med ett kirurgiskt mikroskop.
- Skydda vävnaderna från torkning genom att ständigt tillsätta saltlösning i operationsområdet. Detta hjälper också till att hålla vävnaden elastisk och minimerar risken för skador under operationen. Saltlösningen bör vara runt 37 °C för att undvika kylning av djuret.
- Efter att ha öppnat bukhålan med ett mittlinjesnitt med tång och sax, använd en fuktig, vikt, komprimera för att skjuta alla andra organ åt sidan för att få en bra utsikt över operationsområdet.
- Använd upprullningsdon för att få en bra överblick över operationsområdet (5 mm trubbig krok).
- Lokalisera aortan och den vänstra njuren.
- Använd två mikrokirurgiska tångar, rengör försiktigt aortan, både hjärnskålen (se 2.10.1) och kaudally (se 2.10.2) från njuren, från omgivande vävnader och placera en ligatur under den (6-0 Silke). Var försiktig så att du inte klämmer några strukturer. Arbeta dig in genom att försiktigt sträcka och dra vävnaderna, komma så nära njurartären som möjligt. Runt kärlen finns flera nerver som inte är lätta att upptäcka. Tänk på detta eftersom skadade nerver kan orsaka förlamning eller andra problem postoperativt.
- Cranially (ovan) njuren, använd denna ligatur för att lyfta aortan för att tillfälligt ocklusera blodflödet medan du utför injektionen. I detta läge, precis ovanför där njurartären, förgrenar sig aortan i motsatt riktning (till tarmarna, se figur 1). För att undvika att skjuta injektionen på detta sätt, lägg ligaturen under denna gren. Lämna ligaturen utan spänning tills injektionsproceduren påbörjas.
- Caudally (nedan) njuren, placera snittet nära där aortan förgrenar sig till njur-/njurartären för att undvika andra potentiella grenar. Caudally från njuren aortan är mycket nära buken venen. Var mycket försiktig så att du inte skadar venen.
- Injektion
- När alla ligaturer är på plats; först sträcka den nedre och för det andra den övre ligaturen för att ockludera blodomloppet för att rikta den injicerade vätskan till njuren.
- Använd en akupunkturnål (Ø 0,25 mm), punktera och styra kateterns (rundade) spets (32GA) i aortan och säkra den med en enda knut på ligaturen så att den inte rör sig eller läcker under injektionen. (Figur 1). Genom att använda en akupunkturnål i stället för en sax kan du göra ett minimalt ingångshål i kärlet.
- Injicera 50 μL vätskor. Njuren ska bli blek, vilket indikerar att injektionen har perfused njuren och hamnat på den avsedda platsen.
- För närvarande finns det två olika scenarier möjliga.
- Ge lite cirkulation tillbaka till njuren genom att försiktigt lossa spänningen i den övre ligaturen innan du stänger ingångshålet. Detta sätt ischemi är ameliorated men vara medveten om att den injicerade vätskan potentiellt kan rensas snabbt via njurlymfknuta andan och därmed inte tillåta tillräckligt med uppehållstid.
- Eller fortsätt med kirurgi utan att ge blodflödet tillbaka.
- När du har dragit åt den övre ligaturen igen, dra ut katetern, suturera aortan och ge tillbaka full cirkulation.
- Ta bort ligaturen som håller katetern.
- Dra tillbaka katetern.
- Suturera ingångshålet med ett enda stygn (ethilon 11-0, rundad nål).
- Lossa först den nedre ligaturen och lossa sedan mycket långsamt den övre. Om det finns läckage dra åt ligaturen igen, vänta några sekunder och försök igen. Håll den totala ischemitiden till högst 5-10 minuter för att undvika ischemiska skador.
- Testa soliditeten genom att trycka på området och leta efter pulseringar och se till att njuren återgår till "normal färgning" för att försäkra att recirkulation är etablerad.
- Klipp gängorna och ta bort ligaturerna under aortan.
- Ta bort kompressen och tryck tillbaka tarmarna på plats. Ge tillbaka lite vätska genom att tillsätta saltlösning i bukhålan och suturera peritonean (Vicryl 6-0) innan du stänger huden med metallklämmor.
- Innan du vaknar ges djuren 0,7-1 ml Rehydrex subkutant.
OBS: Hela proceduren tar cirka 30-45 minuter för en välutbildad överspänning.
3. Postoperativ vård
- Låt djuren vakna i en varm miljö genom att placera en värmedyna (cirka 38 °C) under en del av buret i 2-3 dagar efter operativt.
- Fortsätt att tillhandahålla analgesi (Buprenorfin, t.ex. temgesic 0,05-0,1 mg/kg s.c.) 2-3 gånger/dag i 3 dagar efter operativt.
- Ge 10 ml/kg Rehydrex s.c. ibland om djur visar tecken på uttorkning.
Representative Results
Filmen är en blandning av videor från olika operationer för att presentera de med bästa videokvalitet. Vissa sekvenser har tagits från övningssessioner där musen inte ska vakna. Därför är musen inte alltid ordentligt draperad. När ett djur ska vakna arbetar vi alltid på ett aseptiskt sätt.
Histologiska analyser visade att utförandet av injektionerna direkt i njurartären gav upphov till njurskada, sannolikt på grund av otillräcklig recirkulation av blodflödet med irreversibel ischemi som ett resultat (Figur 2). Injektion genom bukaortan orsakade däremot ingen ischemisk skada ( figur3).
Evans blå färgämne användes för att visualisera att perfusion via aortan kommer att resultera i att njuren är det första nådde organet (Figur 4). Inga andra organ blev blå förrän efter passagen ut genom njurlymfknutor venen.
Vi har också visat att vi med denna metod kan öka engraftment av injicerade formuleringar till den perfunderade njuren med hjälp av mesenkymala stamceller (Figur 5).
Bild 1:Placering av suturer och kateter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Toppbild: Beskriver var man ska placera den första ligaturen, kranialt av den vänstra njuren. Bild i mitten: Översikt över operationsområdet precis före placering av kateter (2.11 i protokollet). Nedersta bilden: Översikt över operationsområdet precis före injektion (2.10 i protokollet)
Figur 2: Injektioner direkt i njurartären. Design av, och IHC resultat från, en studie med injektion av NaCl direkt i njurartären Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: IHC-resultat dag 7 efter aorta administrering. IHC-resultat från en studie med injektion av NaCl i njurartären via bukaortan, 7 dagar efter injektion Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Injektion av Evans blå färgämne. Översta bilden visar en seriell vy av en injektion via aortan av Evans blå färgämne. Nedre bilden visar ett tvärsnitt av en njure efter injektion via aorta av Evans blå färgämne. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Buken kranskärlens infusion ökade avsevärt engraftment av mesenchymal stamceller i vänster njure jämfört med rätt njure. Mänskliga benmärg härledda mesenchymal stamceller var märkta med CM-Dil (röd fluorescens) i suspension. En miljon märkta MSCs infunderades genom bukartären i tre möss. Tre timmar efter MSD infusion avslutades möss. Vänster och höger njurar skördades och inbäddades i OCT för cryosectioning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Denna metod har lyckats leverera formuleringar till njuren utan att orsaka njurskador. Det kan användas för leverans av alla typer av formuleringar (t.ex. små molekyler, stam-/stamceller eller mikrovesicles). Metoden kan tillämpas på friska djur eller i njursjukdomsmodeller.
I figur 2 och figur 3presenteras histologin. Figur 2 visar histologi 180 minuter efter perfusion medan figur 3 visar historien 7 dagar efter infusionen. Anledningen till detta är att experimenten med njurartären bara var 180 minuter långa. För att vara säker på att vi inte hade några kroniska skador med denna nya metod väntade vi avsiktligt 7 dagar för att utvärdera dem. N-numret är litet men det här är bara ett exempel.
Observera att denna nyutvecklade metod för aorta administrering för att rikta njuren är en invasiv metod med relativt låg genomströmning och är lämplig för enstaka dosering strategier endast. Upprepad dosering är inte möjlig med denna metod.
Med mindre justeringar av ligaturplaceringarna kan denna metod eventuellt användas för att ingjuta båda njurarna simultaniously5,7. Med den ökade risken för spridning genom aorta förgrening bestämde vi oss för att hålla den ocklusion ligaturen så nära njuren som möjligt, vilket leder injektionen till vänster njure endast. Det kan också användas utöver andra modeller eller tekniker som uninephrectomy eller kanske även samtidig njurlymfknutor ischemi reperfusion skada (IRI). Enligt vår mening, att göra injektionen bara 24 timmar efter IRI3 kirurgi är för hård och kommer att påverka djurets återhämtning avsevärt.
När man använder nya stammar av möss bör man alltid utföra ett pilotförsök på vissa djur från den stammen för att säkerställa att metoden inte behöver justeras på något sätt. I vissa stammar kan till exempel kärlets förgrening från aortan placeras lite annorlunda. Ligaturens position kan ändras något för att säkerställa att formuleringen hamnar på rätt plats.
Uttorkning
Att öppna bukhålan utgör en stor risk för uttorkning. Det är därför absolut nödvändigt att tillsätta vätskor (cirka 37 °C) både under och efter operationen för att säkerställa god grund för återhämtning efter operativt. Vi brukar ge 1 ml/möss s.c. efter operationen.
Ischemi
Förlängd operationstid eller om du inte når full recirkulation kommer det att resultera i ischemi. Det är viktigt att registrera den faktiska ischemitiden och se till att cirkulationen till njuren (och bakbenen) återställs. Ständig träning och uppfräschning av färdigheter är, som alltid, viktigt. Att utföra proceduren snabbare minskar den tid njuren utsätts för ischemi. Att hålla ischemitiden (ligering av aortan) till cirka 5 min (10 min max) har visat sig inte skada njuren.
Spridningseffekter
Med tanke på risken för spridning till andra organ när den injicerade formuleringen åter kommer in i cirkulationen genom njurvenen, bör den injicerade volymen hållas till ett minimum. Vi rekommenderar en maximal volym på 50 μL. Dosering har också visat sig, av andra, vara en kritisk faktor för effektivitet3.
Biverkningar (trombos och förlamning)
Inledningsvis när vi satte upp modellen upplevde vi icke-konsekventa problem med förlamning i bakbenen. Efter relevant dos av antikoagulantia (10 IE heparin i svans ven) preoperatively, minskade denna negativa effekt avsevärt. Efter att ha konsulterat experter inom området började vi också vara ännu mer försiktiga med att arbeta med atraumatisk kirurgi, vilket innebär att vi inte klämer i några vävnader och rör vid så lite områden som möjligt. Dessa åtgärder tillsammans minskade frekvensen av förlamning från cirka 50% till praktiskt taget ingen.
Ursprungligen under metodutveckling applicerade vi antikoagulantia vävnad på njurartären för att stänga snitthålet. Detta var inte möjligt när man gjorde injektioner i aortan eftersom trycket är så mycket högre i aortan. Antikoagulantia ökar också risken för trombos om det kommer in i kärlets lumen.
Se till att inte ha adventitia exponerad i aortans lumen när du suturing eftersom adventitia är mycket thrombogenic. Undvik också inverterande sårkanter eller förträngning av aortan genom att suturing till lår.
Vi har nu en etablerad metod för att leverera formuleringar direkt till njuren.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Tack till René Remie på RRSSC för att ha hjälpt mig att finjustera tekniken och Instech-labben för samarbete med att producera en specialdesignad kateter. Ett stort tack också till alla kollegor på AstraZeneca FoU för produktiva diskussioner med tips och tricks samt Xerox för att slutföra videon med ljud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
