Summary
Dette manuskriptet beskriver en metode for målrettet levering til en enkelt nyre via et kateter plassert i den infrarenale abdominal aorta i musen.
Abstract
Det er behov for rettede injeksjoner for å muliggjøre økt og spesifikk nyreeksponering for effektiv evaluering av narkotikamål på nyreforskningsfeltet. Akkumulering av legemidler i visse organer kan gi opphav til uønskede og uønskede effekter, avhengig av arten av injektat. For å minimere smitte og/eller akkumulering i andre vev, styrer den heri beskrevne metoden formuleringen inn i nyrearteriens blodstrøm ved å sette inn et kateter i infra nyreaorta, like under der den forgrener seg inn i nyrearterien, noe som resulterer i nyrene som først nådde organ og fordeling av formulering gjennom hele nyrene.
Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av metoden, samt dens utfordringer og vanskeligheter. Den veileder eksperimentet til å bli dyktig med denne typen mikrokirurgi som krever nøyaktighet under sterile forhold. Hastighet er avgjørende for å minimere iskemien og praktisere prosedyren vil øke sjansen for vellykkede injeksjoner uten bivirkninger. Ved å modulere tiden mellom injeksjon og reperfusjon samt det injiserte volumet, reduseres risikoen for smitte til andre organer.
Vær oppmerksom på at denne teknikken er egnet for enkle doseringsstrategier.
Introduction
På det prekliniske forskningsfeltet innen legemiddelindustrien er modell- og metodeutvikling en del av det daglige arbeidet. Det er en økende interesse for evnen til å lede narkotika til bestemte organer, eller til og med skille rom i et organ, uten større oversvømmelse / entrapment, via blodstrøm, inn i andre vev. Dette for å muliggjøre økt og spesifikk eksponering for effektiv evaluering av legemiddelmål i modeller av ulike sykdomsområder 1,2,3,4.
En vanlig måte å levere stoffer på er ved systemiske ruter (f.eks. via halevenen) siden den er mindre invasiv enn metoden som er beskrevet i dette manuskriptet. Imidlertid øker systemisk administrering risikoen for økt metabolisme eller akkumulering av forbindelsen i andre vev enn det tiltenkte målorganet, når du passerer gjennom filtreringsorganer som lunge, lever og milt 2,3,5. Bortsett fra å ikke nå det bestemte vevet, kan dette potensielt gi opphav til uønskede og / eller uønskede effekter, avhengig av arten av injektat. Bare svært små molekyler passerer kapillærene til filtreringsorganer, og derfor er målrettet levering spesielt viktig hvis du arbeider med større molekyler 6.
For å minimere smitte og/eller akkumulering av injisert formulering, i andre vev, styrer den her beskrevne metoden formuleringen inn i nyrearteriens blodstrøm gjennom et kateter satt inn i buka aorta like under der den forgrener seg inn i nyrearterien, noe som resulterer i nyrene som først nådde organ. En annen fordel med denne veiledede administrasjonen er at en lavere dose/ volum kan brukes for å nå samme eksponeringsnivå som oppnådd via systemisk administrasjon 3.
Andre administrasjonsveier har blitt utforsket, for eksempel injeksjoner via et kateter direkte inn i nyrearterien. I våre hender ble dette funnet å utgjøre en høyere risiko for manglende gjenoppretting av sirkulasjonen til nyrene. Den svært små diameteren på nyrearterien (ca. 0,35-0,55 mm i diameter) gjør snittet relativt stort og utgjør en risiko for obstruksjon og/eller emboli når du lukker inngangshullet. Ifølge vår erfaring oppstod iskemisk-relatert skade på nyrene ofte ved bruk av denne metoden, og vi utviklet derfor denne nye måten å målrette nyrene på ved å injisere stoffer gjennom snitt av større aorta for å målrette nyrene.
Det finnes lignende teknikker som utvikles hos rotter som også manifesterer utfordringene og risikoen for stenose /trombose som arbeider med injeksjoner direkte inn i nyrearterien 5. Dette støtter våre funn siden fartøyene i mus er enda mindre.
Dette manuskriptet og videoen beskriver i detalj hvordan injeksjoner kan rettes inn i nyrearterien hos mus gjennom et kateter satt inn i den infrarenale aorta, samt veiledning i hvordan man kan overvinne vanlige vanskeligheter i prosedyren, å jobbe på den sikreste måten som mulig og dermed øke reproduserbarheten.
Protocol
Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Regional Laboratory Animal Ethics Committee of Göteborg, Sverige.
1. Preoperativ omsorg
- Bruk sterile teknikker for å unngå infeksjoner.
- Under anestesi (f.eks. isofluran) og arbeid på en mest mulig aseptisk måte, barber operasjonsområdet og fjern pelsen med en hårfjerningskrem. La kremet stå i ca. 1 minutt (maksimalt 2 minutter for å unngå hudforbrenninger). Vask forsiktig med vann. Dette første trinnet kan fortrinnsvis gjøres 1-2 dager før operasjonen for å unngå ekstra kjøling av dyret rett før operasjonen.
- Påfør oftalmisk smøremiddel på øynene for å forhindre tørrhet.
- For å unngå infeksjoner, vask det kirurgiske området med antiseptisk hudrens og tørk området med desinfeksjonsmiddel (klorhexidin) rett før operasjonen.
- Analgesi
- Fordose dyret med smertestillende midler hvis det ikke er en terminal prosedyre: Buprenorfin (f.eks. temgesisk) 0,05-0,1 mg/kg s.c.)
- Antikoagulantia
- Bruk antikoagulantia for å unngå blodpropp: 10 IE heparin gjennom hale venen rett før operasjonen (maksimum 5 ml/kg).
2. Kirurgisk prosedyre
- Autoklaver instrumentene og bruk sterile katetre. Få den overspenningsvasken opp med såpe og hibiscrub og bruk munnbind, hårnett og en steril kirurgisk kjole og hansker. Få en annen person til å håndtere dyrene og alle "skitne" oppgaver.
- For anestesi, bruk isofluran. Induser anestesi ved å plassere musen i en anestesiboks med 5% isofluran. Etter induksjonen, kontroller dybden av anestesi ved å sjekke reflekser og pust.
- Under operasjonen legger du en ansiktsmaske på musen for å gi en vedlikeholdsdose på 2% isofluran.
- Vask dyret med hibiscrub og klorhexidin før du legger på det kirurgiske bordet.
- Etter bedøvelse, plasser musen på en oppvarmet kirurgisk pute i en liggende stilling og fest øvre og nedre lemmer til puten ved hjelp av lav-tack tape. Sørg for at de øvre ekstremitetene opprettholdes i normal posisjon for å forhindre lungekompresjon. Bruk eventuelt en ikke-elektrisk varmekilde.
MERK: Vi bruker anestesi (f.eks. isofluran) for enklere justeringer under operasjonen. - Draper musen med plastfolie (f.eks. Press'n Seal) og utfør arbeidet med et kirurgisk mikroskop.
- Beskytt vevet mot tørking ved å stadig legge saltvann inn i operasjonsområdet. Dette bidrar også til å holde vevet elastisk og minimerer risikoen for skade mens du utfører operasjonen. Saltvannsvæsken bør være rundt 37 °C for å unngå kjøling av dyret.
- Etter å ha åpnet bukhulen med et midtlinje snitt med tang og saks, bruk en fuktig, brettet, komprimer for å skyve alle andre organer til side for å få god utsikt over operasjonsområdet.
- Bruk retraktorer for å få god oversikt over operasjonsområdet (5 mm stump krok).
- Lokaliser aorta og venstre nyre.
- Bruk to mikrokirurgiske tang, rengjør aortaen forsiktig, både kranialt (se 2.10.1) og caudally (se 2.10.2) fra nyrene, fra omkringliggende vev og plasser en ligatur under den (6-0 Silk). Vær forsiktig så du ikke klemmer noen strukturer. Arbeid deg inn ved å forsiktig strekke og trekke vevet, komme så nær nyrearterien som mulig. Rundt fartøyene er det flere nerver som ikke lett oppdages. Husk dette siden skadede nerver kan forårsake lammelse eller andre problemer postoperativt.
- Kranialt (over) nyrene, bruk denne ligaturen til å løfte aorta for å midlertidig okkludere blodstrømmen mens du utfører injeksjonen. I denne posisjonen, rett over der nyrearterien, aortagrenene i motsatt retning (til tarmene, se figur 1). For å unngå å skyve injeksjonen på denne måten, legg ligaturen under denne grenen. La ligaturen stå uten spenning til du starter injeksjonsprosedyren.
- Caudally (under) nyrene, plasser snittet nær der aortagrenene til nyrene / nyrearterien for å unngå andre potensielle grener. Årsaksmessig fra nyrene er aorta svært nær bukvenen. Vær veldig forsiktig så du ikke skader venen.
- Injeksjon
- Når alle ligaturer er på plass; strekk først den nedre og for det andre den øvre ligaturen for å okkludere blodstrømmen for å lede den injiserte væsken til nyrene.
- Bruk en akupunkturnål (Ø 0,25 mm), punktering og før den (avrundede) spissen av kateteret (32GA) inn i aortaen og fest den med en enkelt knute på ligaturen slik at den ikke beveger seg eller lekker under injeksjonen. (Figur 1). Ved å bruke en akupunkturnål i stedet for en saks, kan du lage et minimalt inngangshull i fartøyet.
- Injiser 50 μL væske. Nyrene skal bli bleke, noe som indikerer at injeksjonen har perfundert nyrene og havnet på det bestemte stedet.
- På dette tidspunktet er det to forskjellige scenarier mulig.
- Gi litt sirkulasjon tilbake til nyrene ved å forsiktig løsne spenningen i den øvre ligaturen før du lukker inngangshullet. På denne måten er iskemi ameliorated, men vær oppmerksom på at injisert væske potensielt kan ryddes raskt via nyrevenen og dermed ikke tillate nok oppholdstid.
- Eller fortsett med operasjonen uten å gi blodstrømmen tilbake.
- Etter å ha strammet den øvre ligaturen igjen, trekk kateteret, suturer aorta og gi tilbake full sirkulasjon.
- Fjern ligaturen som holder kateteret.
- Trekk ut kateteret.
- Suturer inngangshullet med en enkelt maske (ethilon 11-0, avrundet nål).
- Løsne først den nedre ligaturen og løsne deretter den øvre sakte. Hvis det er lekkasje strammer ligaturen igjen, vent noen sekunder og prøv igjen. Hold den totale iskemitiden til maksimalt 5-10 minutter for å unngå iskemisk skade.
- Test soliditeten ved å skyve området og se etter pulseringer og sørg for at nyrene går tilbake til "normal farging" for å sikre at resirkulering er etablert.
- Klipp trådene og fjern ligaturene under aorta.
- Fjern komprimeringen og skyv tarmene tilbake på plass. Gi tilbake noen væsker, ved å legge saltvann inn i bukhulen og suturere peritonea (Vicryl 6-0) før du lukker huden med metallklemmer.
- Før du våkner, får dyrene 0,7-1 ml Rehydrex subkutant.
MERK: Hele prosedyren tar rundt 30-45 minutter for en godt trent surgent.
3. Postoperativ omsorg
- La dyrene våkne opp i et varmt miljø ved å plassere en varmepute (rundt 38 °C) under en del av buret i 2-3 dager.
- Fortsett å gi analgesi (Buprenorfin, f.eks. temgesisk 0,05-0,1 mg/kg s.c.) 2-3 ganger/dag i 3 dager postoperativt.
- Gi 10 ml/kg Rehydrex s.c. av og til hvis dyr viser tegn på dehydrering.
Representative Results
Filmen er en blanding av videoer fra forskjellige operasjoner for å presentere de med den beste videokvaliteten. Noen sekvenser er hentet fra øvelsesøkter der musen ikke skal våkne. Derfor er musen ikke alltid riktig drapert. Når et dyr skal våkne, jobber vi alltid på en aseptisk måte.
Histologiske analyser viste at å utføre injeksjonene direkte inn i nyrearterien ga opphav til nyreskade, sannsynligvis på grunn av utilstrekkelig resirkulering av blodstrømmen med irreversibel iskemi som et resultat (Figur 2). Injeksjon gjennom abdominal aorta, derimot, forårsaket ingen iskemisk skade (Figur 3).
Evans blå fargestoff ble brukt til å visualisere at perfusjon via aorta vil resultere i at nyrene blir det første nådde organet (Figur 4). Ingen andre organer ble blå før etter passasjen ut gjennom nyrevenen.
Vi har også vist at ved hjelp av denne metoden kan vi øke engraftment av injiserte formuleringer til perfused nyre ved hjelp av mesenchymale stamceller (Figur 5).
Figur 1: Plassering av suturer og kateter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Topp bilde: Beskriver hvor du skal plassere den første ligaturen, kranialt av venstre nyre. Mellombilde: Oversikt over operasjonsområdet rett før plassering av kateter (2,11 i protokoll). Nederste bilde: Oversikt over operasjonsområdet rett før injeksjon (2.10 i protokoll)
Figur 2: Injeksjoner direkte i nyrearterien. Design av, og IHC resultater fra, en studie med injeksjon av NaCl direkte inn i nyrearterien Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: IHC-resultater på dag 7 etter administrering av aorta. IHC resultater fra en studie med injeksjon av NaCl i nyrearterien via abdominal aorta, 7 dager etter injeksjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Injeksjon av Evans blå fargestoff. Topp bilde som viser en seriell visning av en injeksjon via aorta av Evans blå fargestoff. Nederst bilde som viser et tverrsnitt av en nyre etter injeksjon via aorta av Evans blå fargestoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Abdominal arteriell infusjon økte engraftment av mesenchymale stamceller i venstre nyre betydelig sammenlignet med høyre nyre. Human benmarg avledet mesenchymale stamceller ble merket med CM-Dil (rød fluorescens) i suspensjon. En million merkede MSCer ble infundert gjennom bukarterien hos tre mus. Tre timer etter MSD-infusjon ble mus avsluttet. Venstre og høyre nyrer ble høstet og innebygd i OCT for kryoseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne metoden har vært vellykket i å levere formuleringer til nyrene uten å forårsake nyreskade. Den kan brukes til levering av alle slags formuleringer (f.eks. små molekyler, stamceller eller stamceller). Metoden kan brukes hos friske dyr eller i nyresykdomsmodeller.
I figur 2 og figur 3presenteres histologien. Figur 2 viser histologi 180 minutter etter perfusjon, mens figur 3 viser historie 7 dager etter infusjon. Årsaken til dette er at forsøkene med nyrearterie bare var 180 minutter lange. For å være sikre på at vi ikke hadde noen kronisk skade med denne nye metoden, ventet vi med vilje 7 dager på å evaluere dem. N-tallet er lite, men dette er bare et eksempel.
Merk at denne nyutviklede metoden for aortaadministrasjon for å målrette nyrene er en invasiv metode med relativt lav gjennomstrømning og er kun egnet for enkelt doseringsstrategier. Gjentatt dosering er ikke mulig med denne metoden.
Med mindre justeringer av ligaturplasseringene kan denne metoden muligens brukes til å tilføre begge nyrene samtidig5,7. Med den økte risikoen for smitte gjennom aorta forgrening bestemte vi oss for å holde okkluderende ligatur så nær nyrene som mulig, noe som førte injeksjonen til venstre nyre bare. Den kan også brukes i tillegg til andre modeller eller teknikker som uninephrectomy eller kanskje til og med samtidig nyre iskemi reperfusjonsskade (IRI). Etter vår mening er det for hardt å gjøre injeksjonen bare 24 timer etter IRI3-operasjonen og vil påvirke dyrets utvinning betydelig.
Når man bruker nye stammer av mus, bør man alltid utføre et piloteksperiment på noen dyr fra den stammen for å sikre at metoden ikke trenger å justeres på en eller annen måte. For eksempel, i noen stammer kan kargreningen fra aorta plasseres litt annerledes. Ligaturenes posisjon kan endres noe for å sikre at formuleringen havner på riktig sted.
Dehydrering
Åpning av bukhulen utgjør en stor risiko for dehydrering. Det er derfor viktig å tilsette væsker (rundt 37 °C) både under og etter operasjonen for å sikre et godt grunnlag for utvinningspost operativt. Vi pleier å gi 1 ml/mus.c. etter operasjonen.
Ischemia
Langvarig operasjonstid eller hvis du ikke når full resirkulering vil resultere i iskemi. Det er viktig å registrere den faktiske iskemitiden og sørge for at sirkulasjonen til nyrene (og bakbenene) gjenopprettes. Konstant trening og forfriskende ferdigheter er, som alltid, viktig. Å utføre prosedyren reduserer raskere tiden nyrene blir utsatt for iskemi. Å holde iskemitiden (ligasjon av aorta) til rundt 5 min (10 min maks) har vist seg å ikke skade nyrene.
Smitteeffekter
Tatt i betraktning risikoen for smitte til andre organer når den injiserte formuleringen kommer inn i sirkulasjonen gjennom nyrevenen, bør det injiserte volumet holdes på et minimum. Vi anbefaler et maksimalt volum på 50 μL. Dosering har også blitt funnet, av andre, å være en kritisk faktor for effektivitet3.
Bivirkninger (trombose og lammelse)
I utgangspunktet når vi satte opp modellen, opplevde vi ikke-konsistente problemer med lammelse i bakbenene. Etter relevant dose antikoagulant (10 IE heparin i hale vene) preoperativt, ble denne bivirkningen betydelig redusert. Etter å ha konsultert eksperter på feltet, begynte vi også å være enda mer forsiktige med å jobbe med atraumatisk kirurgi, noe som betyr ingen klemming i noe vev og berøring av så lite områder som mulig. Disse tiltakene samlet reduserte lammelsesfrekvensen fra rundt 50% til nesten ingen.
I utgangspunktet under metodeutvikling brukte vi antikoagulantvev på nyrearterien for å lukke snitthullet. Dette var ikke mulig når du gjør injeksjoner i aorta siden trykket er så mye høyere i aorta. Antikoagulant øker også risikoen for trombose hvis den kommer inn i fartøyets lumen.
Pass på at du ikke har adventitia eksponert i lumen av aorta når suturering siden adventitia er svært trombogene. Unngå også inverterende sårkanter eller innsnevring av aorta ved å suturere til låret.
Vi har nå en etablert metode for å levere formuleringer direkte til nyrene.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Takk til René Remie hos RRSSC for å hjelpe meg med å finjustere teknikken og Instech-laboratoriene for samarbeid i å produsere et spesialdesignet kateter. En stor takk også til alle kolleger på AstraZeneca FoU for produktive diskusjoner med tips og triks, samt Xerox for å fullføre videoen med lyd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
