Summary
Este manuscrito descreve um método de entrega direcionada a um único rim através de um cateter colocado na aorta abdominal infrarenal no camundongo.
Abstract
Há necessidade de injeções direcionadas para permitir o aumento e a exposição renal específica para avaliação eficiente de alvos de drogas no campo da pesquisa renal. O acúmulo de drogas em determinados órgãos pode dar origem a efeitos adversos e indesejados, dependendo da natureza do injetor. Para minimizar o derramamento e/ou acúmulo em outros tecidos, o método descrito aqui direciona a formulação para a corrente sanguínea da artéria renal inserindo um cateter na aorta infra renal, logo abaixo de onde se ramifica na artéria renal, resultando no rim como órgão atingido pela primeira vez e distribuição da formulação em todo o rim.
Este manuscrito fornece uma descrição detalhada do método, bem como seus desafios e dificuldades. Ele orienta o experimentador a se tornar hábil com este tipo de microcirurgia que requer precisão em condições estéreis. A velocidade é crucial para minimizar a isquemia e praticar o procedimento aumentará a chance de injeções bem sucedidas sem efeitos adversos. Modulando o tempo entre injeção e reperfusão, bem como o volume injetado, o risco de derramamento para outros órgãos é mitigado.
Observe que esta técnica é adequada para estratégias de dosagem única.
Introduction
No campo de pesquisa pré-clínico dentro da indústria farmacêutica, o desenvolvimento de modelos e métodos faz parte do trabalho diário. Há um interesse crescente pela capacidade de direcionar drogas para órgãos específicos, ou mesmo separar compartimentos de um órgão, sem grande repercussão/armadilha, via corrente sanguínea, para outros tecidos. Isso permite uma exposição aumentada e específica para avaliação eficiente de metas medicamentosas em modelos de diferentes áreas da doença 1,2,3,4.
Uma forma comum de entregar substâncias é por rotas sistêmicas (por exemplo, através da veia traseira) uma vez que é menos invasiva do que o método descrito neste manuscrito. No entanto, a administração sistêmica aumenta o risco de aumento do metabolismo ou acúmulo do composto em outros tecidos além do órgão alvo pretendido, ao passar por órgãos filtrantes como o pulmão, o fígado e o baço 2,3,5. Além de não atingir o tecido destinado, isso poderia potencialmente dar origem a efeitos adversos e/ou indesejados, dependendo da natureza do injetado. Apenas moléculas muito pequenas passam os capilares dos órgãos filtrantes e, portanto, a entrega direcionada é especialmente importante se trabalhar com moléculas maiores 6.
Para minimizar o derramamento e/ou acúmulo de formulação injetada, em outros tecidos, o método descrito aqui direciona a formulação para a corrente sanguínea da artéria renal através de um cateter inserido na aorta abdominal logo abaixo de onde se ramifica na artéria renal, resultando no rim como órgão atingido pela primeira vez. Outra vantagem com esta administração guiada é que uma dose/volume mais baixo pode ser usada para atingir o mesmo nível de exposição alcançado via administração sistêmica 3.
Outras rotas de administração têm sido exploradas, por exemplo, injeções através de um cateter diretamente na artéria renal. Em nossas mãos, isso foi encontrado para apresentar um maior risco de falha em restaurar a circulação para o rim. O diâmetro muito pequeno da artéria renal (aproximadamente 0,35-0,55 mm de diâmetro) torna a incisão relativamente grande e representa um risco de obstrução e/ou embolia ao fechar o orifício de entrada. De acordo com nossa experiência, danos isquêmicos ao rim muitas vezes ocorreram ao usar este método, e, portanto, desenvolvemos essa nova maneira de atingir com sucesso o rim injetando substâncias através da incisão da aorta maior para atingir o rim.
Existem técnicas semelhantes sendo desenvolvidas em ratos que também manifestam os desafios e o risco de estenose/trombose trabalhando com injeções diretamente na artéria renal 5. Isso corrobora nossas descobertas, uma vez que os vasos em camundongos são ainda menores.
Este manuscrito e vídeo descrevem, em detalhes, como as injeções podem ser direcionadas para a artéria renal em camundongos através de um cateter inserido na aorta infrarenal, bem como orientações sobre como superar as dificuldades comuns no procedimento, para trabalhar da maneira mais segura possível e, assim, aumentar a reprodutibilidade.
Protocol
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Regional de Ética Animal do Laboratório de Gotemburgo, Suécia.
1. Cuidados pré-operatórios
- Use técnicas estéreis para evitar infecções.
- Sob anestesia (por exemplo, isoflurane) e trabalhando da forma mais asséptica possível, raspe a área de cirurgia e remova a pele com um creme de depilação. Deixe o creme por cerca de 1 minuto (máximo de 2 minutos para evitar queimaduras na pele). Lave com cuidado com a água. Este primeiro passo pode ser feito preferencialmente 1-2 dias antes da cirurgia para evitar um resfriamento extra do animal logo antes da cirurgia.
- Aplique lubrificante oftálmico nos olhos para evitar o ressecamento.
- Para evitar infecções, lave a área cirúrgica com limpador de pele antisséptico e limpe a área com desinfetante (clorexidina) logo antes da cirurgia.
- analgesia
- Pré-dose do animal com analgésicos se não for um procedimento terminal: Buprenorfina (por exemplo, temgesic) 0,05-0,1 mg/kg.c.)
- Anticoagulantes
- Use anticoagulantes para evitar coágulos sanguíneos: 10 UI de heparina pela veia traseira logo antes da cirurgia (máximo de 5 mL/kg).
2. Procedimento cirúrgico
- Autoclave os instrumentos e use cateteres estéreis. Lave o surgente com sabão e hibiscrub e use uma máscara facial, uma rede de cabelo e um vestido cirúrgico estéril e luvas. Tenha uma segunda pessoa para lidar com os animais e todas as tarefas "sujas".
- Para a anestesia, use isoflurane. Induzir anestesia colocando o rato em uma caixa de anestesia com 5% de isoflurane. Após a indução, verifique a profundidade da anestesia verificando reflexos e respiração.
- Durante a cirurgia, coloque uma máscara facial no mouse para dar uma dose de manutenção de 2% de isoflurane.
- Lave o animal com hibiscrub e clorexidina antes de colocar na mesa cirúrgica.
- Após anestesiar, coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida em uma posição supina e fixe os membros superiores e inferiores na almofada usando fita adesiva de baixa aderência. Certifique-se de que as extremidades superiores sejam mantidas em uma posição normal para evitar a compressão pulmonar. Se possível, use uma fonte de calor não elétrica.
NOTA: Usamos anestesia de inalação (por exemplo, isoflurane) para facilitar os ajustes durante a cirurgia. - Drape o mouse com plástico (por exemplo, Press'n Seal) e realize o trabalho com um microscópio cirúrgico.
- Proteja os tecidos da secagem, adicionando salina constantemente na área cirúrgica. Isso também ajuda a manter o tecido elástico e minimiza o risco de danos durante a realização da cirurgia. O soro fisiológico deve ficar em torno de 37 °C para evitar o resfriamento do animal.
- Depois de abrir a cavidade abdominal com uma incisão midline com fórceps e tesouras, use uma compressa úmida, dobrada, para empurrar todos os outros órgãos de lado para ter uma boa visão sobre a área da cirurgia.
- Use retráteis para ter uma boa visão geral da área de cirurgia (gancho de 5 mm).
- Localize a aorta e o rim esquerdo.
- Usando dois fórceps de microcirurgia, limpe suavemente a aorta, tanto cranialmente (ver 2.10.1) quanto caudally (ver 2.10.2) do rim, dos tecidos circundantes e coloque uma ligadura por baixo (6-0 Silk). Tenha cuidado para não beliscar nenhuma estrutura. Trabalhe seu caminho, esticando suavemente e puxando os tecidos, chegando o mais perto possível da artéria renal. Ao redor dos vasos há vários nervos não facilmente descobertos. Tenha isso em mente, pois os nervos danificados podem causar paralisia ou outros problemas pós-operatórios.
- Cranialmente (acima) do rim, use esta ligadura para levantar a aorta para ocluir momentaneamente o fluxo sanguíneo durante a realização da injeção. Nesta posição, logo acima de onde a artéria renal, a aorta se ramifica na direção oposta (para os intestinos, ver Figura 1). Para evitar empurrar a injeção desta forma, coloque a ligadura abaixo deste ramo. Deixe a ligadura sem tensão até iniciar o procedimento de injeção.
- Caudally (abaixo) do rim, coloque a incisão perto de onde a aorta se ramifica na artéria renal/renal para evitar outros ramos potenciais. Caudally do rim a aorta está muito perto da veia abdominal. Tenha muito cuidado para não danificar a veia.
- injecção
- Quando todas as ligaduras estiverem no lugar; primeiro esticar a ligadura superior e, em segundo lugar, a ligadura superior para ocluir a corrente sanguínea para direcionar o fluido injetado para o rim.
- Usando uma agulha de acupuntura (Ø 0,25 mm), puna e guie a ponta (arredondada) do cateter (32GA) para dentro da aorta e fixe-a com um único nó na ligadura para que não se mova ou vaze durante a injeção. (Figura 1). O uso de uma agulha de acupuntura em vez de uma tesoura permite a criação de um orifício mínimo de entrada no vaso.
- Injete 50 μL de fluidos. O rim deve ficar pálido, indicando que a injeção perfundiu o rim e acabou no lugar destinado.
- Neste ponto há dois cenários diferentes possíveis.
- Dê alguma circulação de volta ao rim, afrouxando cuidadosamente a tensão na ligadura superior antes de fechar o orifício de entrada. Desta forma, a isquemia é amenizado, mas esteja ciente de que o fluido injetado pode potencialmente ser limpo rapidamente através da veia renal e, portanto, não permitindo tempo suficiente de moradia.
- Ou proceder com a cirurgia sem devolver o fluxo sanguíneo.
- Depois de apertar novamente a ligadura superior, retire o cateter, sutura a aorta e devosse a circulação total.
- Remova a ligadura segurando o cateter.
- Retire o cateter.
- Suturar o orifício de entrada com um único ponto (ethilon 11-0, agulha arredondada).
- Primeiro solte a ligadura inferior e, em seguida, solte lentamente a parte superior. Se houver vazamento, aperte a ligadura novamente, espere alguns segundos e tente novamente. Mantenha o tempo total de isquemia no máximo de 5-10 minutos para evitar danos isquêmicos.
- Teste a solidez empurrando a área e procure pulsações e certifique-se de que o rim retorna à "coloração normal" para restabelecer que a recirculação seja estabelecida.
- Corte os fios e remova as ligaduras por baixo da aorta.
- Remova a compressa e empurre os intestinos de volta no lugar. Devorei alguns fluidos, adicionando soro fisiológico na cavidade abdominal e suturando a peritonea (Vicryl 6-0) antes de fechar a pele com clipes de metal.
- Antes de acordar, os animais recebem 0,7-1 mL de Rehydrex subcutâneamente.
NOTA: Todo o procedimento leva cerca de 30-45 minutos para um surgent bem treinado.
3. Cuidados pós-operatórios
- Permita que os animais acordem em um ambiente quente colocando uma almofada de aquecimento (em torno de 38 °C) debaixo de parte da gaiola por 2-3 dias após o funcionamento.
- Continue fornecendo analgesia (Buprenorfina, por exemplo, temgesic 0.05-0.1 mg/kg s.c.) 2-3 vezes/dia durante 3 dias após o funcionamento.
- Dê 10 mL/kg de Rehydrex s.c. ocasionalmente se os animais apresentarem sinais de desidratação.
Representative Results
O filme é uma mistura de vídeos de diferentes cirurgias para apresentar os com a melhor qualidade de vídeo. Algumas sequências foram tiradas de sessões de treino onde o mouse não deve acordar. Portanto, o mouse nem sempre está devidamente drapeado. Quando um animal deve acordar, sempre trabalhamos de forma asséptica.
Análises histológicas revelaram que a realização das injeções diretamente na artéria renal deu origem a lesões renais, provavelmente devido à recirculação insuficiente do fluxo sanguíneo com isquemia irreversível como resultado(Figura 2). A injeção através da aorta abdominal, por outro lado, não causou nenhuma lesão isquêmica(Figura 3).
O corante azul evans foi usado para visualizar que a perfusão através da aorta resultará no rim ser o primeiro órgão atingido(Figura 4). Nenhum outro órgão ficou azul até depois da passagem pela veia renal.
Também mostramos que, usando este método, podemos aumentar o enenxerto de formulações injetadas no rim perfumado usando células-tronco mesenquimais(Figura 5).
Figura 1: Colocação de suturas e cateter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Foto de cima: Descrevendo onde colocar a primeira ligadura, cranialmente do rim esquerdo. Imagem do meio: Visão geral sobre a área de cirurgia logo antes da colocação do cateter (2.11 no protocolo). Imagem inferior: Visão geral sobre a área da cirurgia logo antes da injeção (2.10 no protocolo)
Figura 2: Injeções diretamente na artéria renal. Design de, e IHC resulta de, um estudo com injeção de NaCl diretamente na artéria renal Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados do IHC no dia 7 após a administração da aorta. IHC resulta de um estudo com injeção de NaCl na artéria renal via aorta abdominal, 7 dias após a injeção Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Injeção de tinta azul Evans. Foto de topo mostrando uma visão serial de uma injeção através da aorta de corante azul Evans. Imagem inferior mostrando uma seção transversal de um rim após injeção via aorta de corante azul Evans. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Infusão arterial abdominal aumentou significativamente o enxerto de células-tronco mesenquimais no rim esquerdo em comparação com o rim direito. As células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana foram rotuladas com CM-Dil (fluorescência vermelha) em suspensão. Um milhão de MSCs rotulados foram infundidos através da artéria abdominal em três camundongos. Três horas após a infusão de MSD, os ratos foram eliminados. Rins esquerdo e direito foram colhidos e incorporados em OUTUBRO para criosectioning. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este método tem sido bem sucedido em entregar formulações ao rim sem causar danos renais. Pode ser usado para a entrega de qualquer tipo de formulação (por exemplo, pequenas moléculas, células-tronco/progenitoras ou microvesculas). O método pode ser aplicado em animais saudáveis ou em modelos de doenças renais.
Na Figura 2 e Figura 3,a histologia é apresentada. A Figura 2 mostra histologia 180 minutos após a perfusão, enquanto a Figura 3 mostra a história 7 dias após a infusão. A razão para isso é que os experimentos com artéria renal foram de apenas 180 minutos de duração. Para ter certeza de que não tivemos nenhum dano crônico com este novo método, nós propositadamente esperamos 7 dias para avaliá-los. O número n é pequeno, mas este é apenas um exemplo.
Observe que este método recém-desenvolvido de administração de aorta para atingir o rim é um método invasivo com rendimento relativamente baixo e é adequado apenas para estratégias de dosagem única. A dosagem repetida não é possível com este método.
Com pequenos ajustes das colocações de ligadura, este método poderia possivelmente ser usado para infundir ambos os rins simultaniously5,7. Com o risco aumentado de derramamento através da ramificação aórtica decidimos manter a ligadura ocluante o mais próximo possível do rim, levando a injeção apenas para o rim esquerdo. Também pode ser usado além de outros modelos ou técnicas como a não-ofefictomia ou talvez até mesmo a lesão simultânea de isperfusão renal (IRI). Em nossa opinião, fazer a injeção apenas 24 horas após a cirurgia doIRI 3 é muito duro e afetará substancialmente a recuperação do animal.
Ao usar novas cepas de camundongos, deve-se sempre realizar um experimento piloto em alguns animais dessa cepa para garantir que o método não precise ser ajustado de alguma forma. Por exemplo, em algumas cepas, o ramo de vasos da aorta pode ser posicionado um pouco diferente. A posição das ligaduras pode mudar um pouco para garantir que a formulação acabe no local certo.
desidratação
Abrir a cavidade abdominal representa um grande risco de desidratação. Por isso, é imprescindível adicionar fluidos (em torno de 37 °C) durante e após a cirurgia para garantir uma boa base para a recuperação pós-operatória. Normalmente damos 1 mL/camundongos.c. pós-cirurgia.
isquemia
Tempo de cirurgia prolongado ou se não atingir a recirculação total resultará em isquemia. É importante registrar o tempo real de isquemia e garantir que a circulação para o rim (e as pernas traseiras) sejam restauradas. Treinamento constante e refrescante de habilidades são, como sempre, importantes. Realizar o procedimento mais rapidamente reduz o tempo em que o rim é exposto à isquemia. Manter o tempo de isquemia (ligadura da aorta) para cerca de 5 min (10 min no máximo) tem sido mostrado para não prejudicar o rim.
Repercussão
Considerando o risco de derramamento para outros órgãos quando a formulação injetada está reentrando na circulação através da veia renal, o volume injetado deve ser mantido ao mínimo. Recomendamos um volume máximo de 50 μL. A dosagem também foi encontrada, por outros, como um fator crítico para a eficiência3.
Efeitos adversos (trombose e paralisia)
Inicialmente, ao configurar o modelo, experimentamos problemas não consistentes com paralisia nas pernas traseiras. Após a dose relevante de anticoagulante (10 UI de heparina na veia traseira) no pré-operatório, este efeito adverso foi significativamente diminuído. Depois de consultar especialistas na área, também começamos a ser ainda mais cuidadosos em trabalhar com cirurgias atraumáticas, o que significa não beliscar em nenhum tecido e tocar o mínimo possível de áreas. Essas ações realizadas em conjunto reduziram a frequência de paralisia de cerca de 50% para praticamente nenhuma.
Inicialmente durante o desenvolvimento do método, aplicamos tecido anticoagulante na artéria renal para fechar o orifício de incisão. Isso não foi possível ao fazer injeções na aorta, já que a pressão é muito maior na aorta. O anticoagulante também aumenta o risco de trombose se entrar no lúmen do vaso.
Certifique-se de não ter a adventitia exposta no lúmen da aorta ao suturar já que a adventitia é muito trombogênica. Evite também qualquer invertido bordas de ferida ou estreitando a aorta suturando até a coxa.
Agora temos um método estabelecido para entregar formulações diretamente ao rim.
Disclosures
O autor não tem nada a revelar.
Acknowledgments
Obrigado a René Remie na RRSSC por me ajudar a afinar a técnica e os laboratórios Instech para colaboração na produção de um cateter especial projetado. Um grande agradecimento também a todos os colegas da AstraZeneca P&D por discussões produtivas com dicas e truques, bem como xerox para completar o vídeo com som.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
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