Summary
Questo protocollo induce in modo non invasivo l'iperglicemia nel pesce zebra per un massimo di 8 settimane. Utilizzando questo protocollo, è possibile fare uno studio approfondito degli effetti avversi dell'iperglicemia.
Abstract
I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per indagare gli effetti dell'iperglicemia cronica, un segno distintivo del diabete mellito di tipo II (T2DM). Questo protocollo ad immersione alternativa è un metodo non invasivo e step-wise per indurre iperglicemia per un massimo di otto settimane. I pesci zebra adulti sono alternativamente esposti allo zucchero (glucosio) e all'acqua per 24 ore ciascuno. Il pesce zebra inizia il trattamento in una soluzione di glucosio all'1% per 2 settimane, quindi una soluzione al 2% per 2 settimane e infine una soluzione al 3% per le restanti 4 settimane. Rispetto ai controlli trattati con acqua (stress) e trattati con mannitolo (osmotico), i pesci zebra trattati con glucosio hanno livelli significativamente più elevati di zucchero nel sangue. Il pesce zebra trattato con glucosio mostra livelli di zucchero nel sangue 3 volte superiori a quello dei controlli, suggerendo che dopo quattro e otto settimane l'iperglicemia può essere raggiunta. L'iperglicemia sostenuta è stata associata all'aumento della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e all'aumento dei livelli di fattore nucleare Kappa B (NF-kB) nella retina e alla diminuzione delle risposte fisiologiche, così come i deficit cognitivi che suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per modellare le complicanze della malattia.
Introduction
Il pesce zebra(Danio rerio)sta rapidamente diventando un modello animale ampiamente utilizzato per studiare sia la malattia che la cognizione1. La facilità di manipolazione genetica e la trasparenza embrionale attraverso le prime fasi di sviluppo, li rendono un candidato principale per studiare le malattie umane con una base genetica nota. Ad esempio, i pesci zebra sono stati utilizzati per studiare la sindrome di Holt-Oram, le cardiomiopatie, la malattia renale glomerulocistica, la distrofia muscolare e il diabete mellito (DM) tra le altremalattie 1. Inoltre, il modello zebrafish è ideale per le piccole dimensioni della specie, la facilità di manutenzione e l'elevata fecondità2,3.
Il pancreas zebrafish è sia anatomicamente che funzionalmente simile al pancreas di mammiferi4. Pertanto, le caratteristiche uniche di dimensioni, alta fecondità e strutture endocrine simili rendono zebrafish un candidato adatto per lo studio delle complicanze legate alla DM. Nel pesce zebra, ci sono due metodi sperimentali utilizzati per indurre l'iperglicemia prolungata che è caratteristica del DM: un afflusso di glucosio (modellazione di tipo 2) e la cessazione della secrezione di insulina (modellazione tipo 1)5,6. Sperimentalmente, per fermare la secrezione di insulina, le cellule β pancreatiche possono essere distrutte chimicamente usando iniezioni di Streptozotocina (STZ) o Alloxan. STZ è stato utilizzato con successo nei roditori e nei pesci zebra, con conseguenti complicazioni associate alla retinopatia7,8,9,deficit cognitivi10e rigenerazione degli arti11. Tuttavia, nel pesce zebra, β-cellule si rigenerano dopo il trattamento, causando la necessaria "iniezione di richiamo" di STZ per mantenere le condizioni diabetiche12. In alternativa, il pancreas del pesce zebra può essere rimosso6. Si tratta sia di procedure altamente invasive, dovute alle iniezioni multiple, sia di un ampio tempo di recupero.
Al contrario, l'iperglicemia può essere indotta in modo non invasivo attraverso l'esposizione al glucosio esogeno. In questo protocollo, i pesci sono immersi in una soluzione di glucosio altamente concentrata per 24 ore5,13 o continuamente per 2 settimane14,15,16. Il glucosio esogeno viene assunto transdermicamente, per ingestione e/o attraverso le branchie con conseguente elevati livelli di zucchero nel sangue. Poiché questa tecnica non invasiva non manipola direttamente i livelli di insulina, non può pretendere di indurre il DM di tipo 2. Tuttavia, può essere utilizzato per esaminare le complicanze indotte dall'iperglicemia, che è uno dei principali sintomi del DM di tipo 2.
Recentemente, il mutante zebrafish pdx1-/- è stato sviluppato manipolando il gene pancreatico e duodenale omeobox 1, un gene legato alla causa genetica del DM di tipo 2 nell'uomo. Utilizzando questo mutante, i ricercatori sono stati in grado di replicare l'interruzione dello sviluppo pancreatico, l'alto livello di zucchero nel sangue e studiare la retinopatia diabetica indotta da iperglicemia17,18.
In questo articolo, descriviamo un metodo di induzione dell'iperglicemia non invasiva che utilizza un protocollo ad immersione alternata. Questo protocollo mantiene condizioni iperglicemiche per un massimo di 8 settimane con complicazioni successive osservate. In breve, i pesci zebra adulti vengono posti in una soluzione di zucchero per 24 ore e quindi in una soluzione d'acqua per 24 ore. A differenza dell'immersione continua in soluzioni esterne di glucosio, alternare giorni tra zucchero e acqua imita l'aumento e la caduta della glicemia nel diabete. Un protocollo di glucosio alternato consente inoltre di indotta l'iperglicemia per periodi di tempo più lunghi, poiché i pesci zebra non sono così in grado di compensare le elevate condizioni esterne di glucosio. Come prova di principio, forniamo dati che mostrano che l'iperglicemia indotta usando questo protocollo altera la chimica retinica e la fisiologia.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'American University.
1. Preparazione dei serbatoi di soluzione
- Ottenere sei serbatoi, due per ogni gruppo sperimentale (glucosio, mannitolo e acqua). Etichettare uno dei due serbatoi "serbatoio di alloggiamento" (oterrà il pesce) ed etichettare l'altro "serbatoio di soluzione" (terrà la soluzione).
NOTA: Il gruppo di trattamento del mannitol è il controllo osmotico e il gruppo di trattamento delle acque è un controllo della manipolazione / stress. È importante tenere separati i serbatoi, le compagnie aeree/ pietre aeree, i coperchi e i prodotti per la pulizia per ogni gruppo di trattamento - Utilizzare un serbatoio da 2 L se il numero totale di pesci utilizzati è inferiore a 20. Utilizzare un serbatoio da 4 L se il numero totale di pesci utilizzati è superiore a 20.
NOTA: Utilizzare una N di 5-10 per gruppo di trattamento per punto di tempo di campionamento. - Tenere i serbatoi in un bagno d'acqua a 28-29 °C per mantenere la temperatura dell'acqua.
- Il primo giorno, mettere il pesce nelle rispettive soluzioni di trattamento (glucosio, mannitolo, acqua) per 24 ore ('Acqua da treatment'). Il secondo giorno, trasferire il pesce dalle loro soluzioni di trattamento all'acqua per 24 ore ('Trattamento in acqua'). Il giorno 3, trasferire il pesce dall'acqua alle soluzioni di trattamento ('Acqua al trattamento'). Questa esposizione alternata continua per il resto dell'esperimento (Figura 1). Trasferire quotidianamente pesci di controllo trattati con acqua dall'acqua all'acqua.
- Assicurarsi che il pesce venga nutrito e trasferito all'interno della stessa finestra di 2 ore ogni giorno per tutta la durata dell'esperimento.
2. Preparare il pesce
- Utilizzare zebrafish adulti (4 mesi - 1 anno)5.
- Dai da mangiare al pesce macinato a scaglie di Tetramin ogni giorno all'arrivo in laboratorio.
- Registrare il pH e la temperatura di tutti i serbatoi e registrare le condizioni generali del pesce.
3. Trasferimento di pesce
- Trasferire il pesce in ogni gruppo di trattamento dal serbatoio di alloggiamento al serbatoio di soluzione corrispondente utilizzando una rete di pesce standard.
- Riposizionare il serbatoio contenente il pesce nel bagno d'acqua, sostituire la pietra d'aria e il coperchio del serbatoio. Questo serbatoio è ora il "serbatoio dell'alloggiamento" e il serbatoio che in precedenza deteneva il pesce è ora il "serbatoio della soluzione".
- Scartare la vecchia soluzione e pulire il serbatoio, insieme ai coperchi dei serbatoi, alle compagnie aeree, alle pietre aeree e alle reti per prevenire l'accumulo di glucosio e mannitol.
NOTA: Non lavare gli articoli con sapone. Utilizzare acqua e una spazzola/spugna dedicata per ogni condizione di trattamento per pulire correttamente i serbatoi. - Asciugare i "serbatoi di soluzione" appena puliti con un tovagliolo di carta. Preparare le soluzioni per il giorno successivo utilizzando questo serbatoio. Assicurarsi che gli altri articoli siano asciugati e separati da gruppi di trattamento appropriati.
NOTA: Tenere un registro delle soluzioni che il pesce viene trasferito da e verso ogni giorno, nonché delle soluzioni preparate per il giorno successivo. Ad esempio: pesce trasferito dal glucosio all'H2O, nuova soluzione di glucosio all'1% preparata per domani.
4. Preparazione della soluzione post-trasferimento
- Preparazione di soluzioni zuccheri
- Riempire ogni serbatoio della soluzione con 2 L (o 4 L) di Acqua di sistema (l'acqua di sistema è definita come acqua che è stata trattata con il corretto rapporto di soluzione salina ed è alla stessa temperatura delle cisterne di stoccaggio e trattamento).
- Misurare la corretta quantità di glucosio e mannitol (vedere il passaggio 5 sotto) utilizzando una bilancia di carico superiore e barche di pesata separate per ogni sostanza chimica.
- Aggiungere l'aliquota di glucosio o mannito pesata al serbatoio della soluzione appropriato e pulito, che contiene solo acqua di sistema.
- Mescolare le soluzioni di glucosio e mannitol con aste di mescolare il vetro separate fino a quando gli zuccheri non sono completamente sciolti.
- Restituire i serbatoi di soluzione al bagno d'acqua e coprire con i coperchi corrispondenti.
- Preparazione di soluzioni idriche
- Riempire i serbatoi sperimentali (2 L o 4 L) con Acqua di sistema.
- Riportare questi "serbatoi di soluzione" al bagno d'acqua e coprire con i coperchi corrispondenti.
5. Variazione delle percentuali
- Mantenere il pesce in una soluzione all'1% durante le prime 2 settimane di trattamento: 40 g di glucosio o mannitolo in un serbatoio da 4 L.
- Mantenere il pesce in una soluzione al 2% durante le settimane 3 e 4 del trattamento: 80 g di glucosio o mannitol in un serbatoio da 4 L.
- Mantenere il pesce in una soluzione al 3% per le ultime 4 settimane di trattamento: 120 g di glucosio o mannitolo in un serbatoio da 4 L.
6. Misurazione dei livelli di glucosio nel sangue e raccolta dei tessuti
- Anestetizzare il pesce 2 alla volta in una soluzione di tricaina allo 0,02%.
- Decapitare il pesce direttamente dietro le branchie usando un rasoio.
- Misurare il valore della glicemia.
NOTA: Usiamo un misuratore di glucosio nel sangue (ad esempio, Freestyle Lite) per misurare la glicemia e posizionare la striscia di prova direttamente sul cuore esposto (campione di sangue cardiaco). - Sezionare il tessuto desiderato dal pesce (cervello, muscoli, ecc.).
- Conservare il tessuto raccolto congelando il ghiaccio secco e conservandolo in un congelatore a -80 °C, fissandolo in paraformaldeide al 4% o mettendo in una soluzione tampone per un uso immediato.
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo (Figura 1), i valori della glicemia sono significativamente elevati dopo 4 settimane e 8 settimane di trattamento (Figura 2A), con iperglicemia definita come 3 volte le medie di controllo provenienti sia da gruppi trattati con acqua che da gruppi trattati con mannito. I controlli trattati con acqua vengono trasferiti ogni giorno all'interno e all'uscita dall'acqua, fornendo un controllo dello stress/movimentazione. Il mannitolo funge da controllo osmotico negli studi sul glucosio in vitro19,20, in quanto è uno zucchero a 6 atomi di carbonio come il glucosio ma non viene assunto dalle cellule. Per essere coerenti con questi studi e altri studi su zebrafish21, abbiamo somministrato mannitolo nelle stesse concentrazioni del glucosio per determinare se gli effetti osservati erano dovuti all'elevata osmolarità derivante dall'esposizione al glucosio o da un effetto specifico del glucosio.
La glicemia viene misurata anestetizzando il pesce usando lo 0,02% di Tricaine fino a quando i movimenti branchiali non hanno rallentato e quindi decapitato. I livelli di glucosio nel sangue, misurati con un misuratore di glucosio nel sangue(figura 2B),sono determinati posizionando la striscia di prova del glucometro direttamente sul cuore perforato (cioè sangue cardiaco).
Il tessuto retinico raccolto dopo 4 settimane di iperglicemia mostra un aumento dei livelli di proteina acida fibrillare gliale (GFAP)(Figura 3A). L'espressione GFAP si osserva nelle cellule gliali di Muller nella retina, che vengono alterate nella retinopatiadiabetica 22,23. L'aumento del contenuto di GFAP e/o dei modelli di immunoreattività si osserva anche nei ratti diabetici indotti dalla STZ24,25,26,27,28, pdx1-/- pescimutanti 17e nelle retine dell'uomo diabetico29. Questo aumento della GFAP è associato ad un aumento dei livelli di fattore nucleare Kappa B (NF-kB)(Figura 3B)30,suggerendo che l'iperglicemia indotta nel pesce zebra utilizzando il protocollo di immersione alternativo innesca una risposta infiammatoria e gliosi reattiva. Le registrazioni ERG dopo 4 settimane di trattamento hanno identificato una diminuzione della risposta nelle retine trattate con glucosio rispetto ai controlli trattati con mannitolo (Figura 4A). Le ampiezze dei componenti a-onda (fotorecettore) e b-onda (cellule bipolari) sono diminuite nei pesci iperglicemici (Figura 4B). Queste risposte ERG alterate sono correlate a specifici cambiamenti nei coni rossi e/o verdi30,21, che appaiono particolarmente sensibili all'insulto iperglicemico. Risposte ERG alterate si osservano anche nei modelli animali di diabete31,32,33,34,35 e nell'uomo diabetico. Il pesce zebra trattato con glucosio mostra anche una diminuzione delle prestazioni cognitive (vedi Rowe et al., 2020, in questo numero), suggerendo che l'iperglicemia prolungata porta anche a deficit di funzionalità cognitiva che sono segnalati anche nei pazienti diabetici più anziani.
Figura 1: Schema del protocollo di immersione alternativo. Questa è una rappresentazione visiva del processo di trasferimento. Il pesce viene mantenuto in soluzione all'1% per 2 settimane, soluzione al 2% per 2 settimane e quindi soluzione al 3% per le restanti 4 settimane. Ogni giorno, il pesce viene trasferito in soluzione di zucchero o acqua. I trattamenti di controllo trasferiscono il pesce in entrata e in uscita dall'acqua (0% glucosio - controllo di manipolazione) ogni 24 ore o in entrata e in uscita dal mannito (controllo osmotico), con concentrazioni di mannitolo parallele a quelle utilizzate per il glucosio. Abbiamo misurato i livelli di glucosio nel sangue, eseguito esperimenti e raccolto tessuti dopo 4 e 8 settimane di trattamento (in scatola). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I livelli di glucosio nel sangue sono elevati dopo 4 e 8 settimane di trattamento. (A) I pesci trattati con glucosio hanno una quantità di zucchero nel sangue superiore a 3 volte superiore a quella dei pesci di controllo trattati con acqua e mannito, con un aumento significativo (p = 0,029 a 4 settimane; p < 0,001 a 8 settimane). Ciò significa che dopo 4 e 8 settimane il pesce zebra trattato con glucosio era iperglicemico. I dati sono stati raccolti da n = 5 pesci trattati con mannitolo, n = 8 pesci trattati con glucosio e n = 3 pesci di controllo dell'acqua a 4 settimane; n = 5 pesci trattati con mannito, n = 10 pesci trattati con glucosio e n = 7 pesci trattati con acqua a 8 settimane. (B) Una rappresentazione visiva di un pesce zebra e del misuratore di glucosio nel sangue Freestyle Lite che usiamo per misurare i livelli di glucosio nel sangue. I livelli di zucchero nel sangue vengono misurati da un campione di sangue cardiaco dopo che il pesce è stato anestetizzato in una soluzione di tricaina allo 0,02% e decapitato. I valori sono ± SE <. = p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: I livelli di GFAP sono aumentati nel pesce zebra trattato con glucosio. I pesci zebra trattati con glucosio hanno aumentato i livellidiproteine acide fibrillari gliali (GFAP; 1:1000) e (B) Rel-A (NfK-B; 1:1000) come determinato dall'analisi della densitometria delle macchie occidentali. β-actin (1:1000) fungeva da controllo di carico. L'aumento dei livelli di Rel-A è stato significativo (p < 0,003, asterischi). W = controllo trattato con acqua, G = trattato con glucosio, M = trattato con mannitolo. W2, G2, M2 sono repliche per W, G e M. Ciò suggerisce che c'è un insulto alla retina nel pesce zebra iperglicemico che causa gliosi reattiva. (Modificato dalla figura 7, Tanvir et al., 201830, pubblicato originariamente secondo i termini di una licenza CC-BY). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La risposta erg è ridotta nei pesci trattati con glucosio. (A) Tracce rappresentative di ERG da retine di zebrafish trattate con glucosio (rosso), trattato con mannito (verde) e acqua (nera) evocato con uno stimolo di 570nm su sfondo rosso adattante. Il bloccante del recettore del glutammato CNQX (50μM) era presente nella soluzione da bagno per isolare il fotorecettore e le risposte delle cellule bipolari ON. Unità: asse y = μV, asse x = tempo. L'impulso dell'onda quadra riflette la durata dell'impulso luminoso. (B) Quantificare i cambiamenti nelle ampiezze di risposta. Ampiezze di risposta normalizzate medie per le onde a del fotorecettore (ampiezza a1, destra), misurate come deflessione verso il basso all'inizio dell'impulso della luce quadrata, e onde b della cella bipolare (ampiezza b2, a sinistra), misurate da trogolo a picco durante l'impulso luminoso. Entrambi i valori sono stati significativamente ridotti nei tessuti trattati con glucosio e mannitolo (p < 0,001 per a1; p < 0,0001 per b2; n = 14 occhi per trattamento). I valori sono stati normalizzati al controllo trattato con acqua. Questo è coerente con altri modelli di animali diabetici (come i roditori) e negli esseri umani con diabete. (Tratto dalla Figura 4, Tanvir et al. 201830, pubblicato originariamente secondo i termini di una licenza CC-BY). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il diabete è un problema nazionale. Gli studi dimostrano che entro il 2030, si stima che 400 milioni di persone avranno una qualche forma di diabete. Nei modelli di roditori, il DM di tipo 2 viene studiato utilizzando la manipolazione genetica. Nei ratti, i ratti grassi diabetici Zucker (ZDF) e i ratti grassi Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), forniscono maggiori informazioni sugli effetti del tipo 2 DM10. Inoltre, diete ad alto contenuto di grassi sono state utilizzate nei roditori per indurre l'iperglicemia. Ciò rispecchia la procedura non invasiva proposta nel presente documento. Utilizzando il nostro protocollo non invasivo, possiamo indurre iperglicemia per un massimo di 8 settimane, simulando quindi iperglicemia prolungata in zebrafish altrimenti sani.
Dopo aver misurato la glicemia, il tessuto (retina e cervello) può essere raccolto per un'analisi successiva. Le differenze fisiologiche, come le registrazioni di elettroretinogramma (ERG), possono essere misurate direttamente dalle coppe per gli occhiretiniche 21,30. Le risposte comportamentali (cioè le risposte optomotorie o le differenze cognitive (Rowe et al., 2020) possono essere valutate prima della misurazione della glicemia. Per la determinazione western di Blot dei livelli proteici, il tessuto viene posto nel tampone RIPA o congelato flash e conservato a -80 °C. A causa delle differenze nelle dimensioni/ contenuto proteico, potrebbero essere necessario raggruppare diverse retine prima dell'analisi. Per l'immunocitochimica, il tessuto viene fissato in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore e quindi equilibrato in una soluzione di saccarosio al 30% prima della sessatura congelata (20 μm).
Per ottimizzare i risultati, pesare attentamente sia il mannitol che il glucosio e assicurarsi che le soluzioni siano accuratamente mescolate. È anche molto importante mantenere un programma attivo dei giorni di trasferimento, per assicurarsi che zucchero e acqua si alternano quotidianamente e alla stessa ora del giorno. Inoltre, assicurarsi di misurare attentamente l'acqua in quanto troppo poco o troppo può cambiare la concentrazione della soluzione. Infine, monitorare attentamente il pH e la temperatura delle soluzioni, poiché il trasferimento di pesci in soluzioni estreme può scioccare il pesce e causare mortalità. Non vi è alcuna prova che l'esposizione prolungata al glucosio o alte concentrazioni di glucosio, se esposte gradualmente, abbia effetti tossici sul pesce zebra. Se il protocollo viene seguito correttamente, non ci si dovrebbe aspettare alcuna morte estranea del pesce zebra.
Mentre questo è un metodo collaudato per indurre l'iperglicemia, una limitazione di questo protocollo è che non si può accertare che i pesci siano iperglicemici fino a dopo che sono stati sacrificati. Un'altra limitazione è che non valutiamo i livelli di pancreas o insulina e, pertanto, non possiamo affermare di indurre il diabete di tipo 2, solo che induciamo iperglicemia. Tuttavia, questo è anche ciò che rende questa procedura migliore dei metodi concorrenti: non è invasiva. Abbiamo osservato complicazioni di iperglicemia prolungata indotte da questo protocollo che sono riportate nei modelli di roditori e negli individui diabetici. In futuro, è possibile utilizzare questa procedura per esaminare tecniche terapeutiche che aiutano ad alleviare i sintomi della DM, come la retinopatia.
In sintesi, questo protocollo ad immersione alternata non invasiva è un modo efficace per indurre l'iperglicemia per un massimo di 8 settimane. Questo metodo è un potente strumento che consente di esaminare le complicanze dell'iperglicemia cronica e la successiva determinazione dei trattamenti terapeutici. Offre anche l'opportunità di confrontare i risultati della ricerca biomedica tra gli organismi modello.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere VPC, CJR e MCP per lo sviluppo di questo protocollo. L'EMM ha ricevuto sostegno finanziario dall'American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support per svolgere questa ricerca. Questo lavoro è stato anche supportato da un American University Faculty Mellon Award e finanziamenti attraverso l'American University College of Arts and Sciences (entrambi a VPC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
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