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Bioengineering

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/61937
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4,5,6, 7,8, 9, 2,6,10
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 3Scribe Biosciences, 4Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 5California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 6Chan Zuckerberg Biohub, University of California San Francisco, 7Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of California Berkeley, 8Helen Wills Neuroscience Institute, University of California Berkeley, 9Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 10Center for Cellular Construction, University of California San Francisco

Summary

여기서 우리는 DNA 프로그래밍 된 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 마이크로 패턴 세포에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 벤치탑 포토리소그래피 플랫폼을 사용하여 유리 슬라이드에 DNA 올리고뉴클레오티드 패턴을 만든 다음 상업적으로 사용할 수 있는 보완적인 올리고뉴클레오티드로 세포막을 라벨로 표시합니다. 올리고스의 혼성화는 프로그램된 세포 접착을초래한다.

Abstract

세포의 상대적 위치는 세포 세포 상호 작용을 구성하는 마이크로 환경의 주요 특징입니다. 동일하거나 다른 유형의 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 마이크로 패턴화 기술이 유용합니다. DNA 프로그래밍된 세포 조립(DPAC)은 DNA 혼성화를 사용하여 기판 또는 다른 세포에 대한 세포의 접착을 표적으로 하는 마이크로패턴 기술이다. DPAC에서 가장 기본적인 작업은 지질 변형 올리고뉴클레오티드로 세포막을 장식한 다음 보완적인 DNA 서열로 패턴화된 기판 위로 흐르는 것으로 시작합니다. 세포는 보완적인 DNA 서열을 찾아서만 기판에 선택적으로 부착합니다. 비 부착 세포는 씻겨 서 서, 신봉 세포의 패턴을 공개. 추가 적인 수술은 세포 기판 또는 세포 세포 접착의 추가 라운드를 포함할 뿐만 아니라, 장기 배양을 위한 포함 하이드로겔에 DPAC에 의해 형성된 패턴을 전송하는 것을 포함합니다. 이전에는 표면에서 올리고뉴클레오티드를 패터닝하고 DNA 서열을 사용하여 세포를 꾸미기 위한 방법은 각각 특수 장비와 맞춤형 DNA 합성을 요구하였다. 우리는 저렴한 벤치 탑 포토리소그래피 설정과 모듈 형식을 사용하여 배포 된 시판 분석 폴리고뉴클레오티드 (CMO)를 사용하여 프로토콜의 업데이트 된 버전을보고합니다. CMO 표지 된 세포는 DNA 패턴 기판에 고효율을 준수합니다. 이 접근법은 높은 정밀도로 한 번에 여러 세포 유형을 패턴화하고 세포외 매트릭스 내에 내장된 미세 조직의 배열을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 마이크로 패턴을 방해하지 않고 고해상도, 3 차원 미세 환경에 세포를 포함 할 수있는 능력, 모든 세포 유형을 패터닝에 유연성을 포함한다.

Introduction

조직에서 서로 에 대하여 세포의 위치는 마이크로환경1,2,3,4의중요한 특징이다. 라이브 세포를 공간적으로 조절된 배열로 패턴화하는 데 사용되는 기술은 분화4,5,6,7,8,세포 운동성9,형태발생10,12,신진 대사13및 세포 세포 상호 작용7,14를 연구하기 위한 귀중한 실험도구입니다. . 패터닝 셀에 대한 다양한 방법이 존재하며, 각각 고유한 장점과단점3,4. 마이크로컨택트 인쇄 및 레이저 절단 스텐실과 같은 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 접착 섬을 만드는 방법은 간단하고 확장가능합니다. 그러나, 상이한 ECM 분자에 상이한 세포 유형의 접착제 특성이 종종유사하기때문에 한 번에 하나 또는 두 개 이상의 세포 유형을 패턴화하기어렵다. 더 복잡한 마이크로패턴은 자외선을 사용하여 PEG 코팅 부위를 축출하고 후속 단백질흡착(18,19)을허용하는 기술인 빛 유발 분자 흡착(LIMAP)으로 생성될 수 있다. 이 프로세스는 다중 세포 모형을 가진 고해상도 마이크로패턴을 만들기 위하여 반복될 수 있습니다. 그러나, 상이한 단백질 패치에 세포의 교차 결합이 발생할 수 있으며, 그 결과 패턴특이성(19). 마이크로 기계적 재구성 가능한 배양 장치에 파종 세포와 같은 물리적 방법은 동적 제어와 구조화 된 공동 배양을 만들 수 있지만, 마이크로 접촉 인쇄 또는 LIMAP14,8의패턴 디자인의 유연성없이. 다른 기술과 달리, 바이오프린팅은 하이드로겔20,21내의 세포의 3차원 배열을 생성할 수 있다. 그러나, 생체 인쇄 구조는 다른 마이크로 패턴화 기술보다 훨씬 낮은 해상도를 가지며, 수백 개의미크론(22)의순서에 평균 피처 크기가 있습니다. 이상적인 세포 패터닝 방법은 고해상도, 패턴 다중 셀 유형, 쉽게 접근 할 수있는 장비 및 시약을 사용하고 3 차원 (3D) 세포 배양을위한 하이드로 겔에 성공적인 패턴을 포함 할 수있는 능력을 가질 것이다. 이 문서에서는 DNA 혼성화의 유연성과 속도를 사용하여 기판에 세포 접착력을 표적으로 하는 세포 마이크로패턴 기술인 CMO-DPAC를 제시합니다. 이 방법은 이전 프로토콜23,24에서 더 저렴하고 모듈식이며 액세스할 수 있도록 조정되었습니다. 현재 프로토콜을 사용하여 모든 실험실은 특수 장비 나 전문 지식없이 완벽하게 작동하는 시스템을 설정할 수 있어야합니다.

세포의 DNA 프로그램 어셈블리 (DPAC)는 세포 세포 간격 및 조직 기하학을 정밀하게 제어하여 단세포 해상도에서 세포를 패턴화하는 강력한 조직 공학 기술입니다. DPAC에서 세포막은 세포막에서 혼성화하도록 설계된 두 개의 지질 변형 올리고를 사용하여 DNA 올리고뉴클레오티드 (올리고스)로 장식되어 있습니다. 올리고는 소수성 지질에 공각되기 때문에, 그들은 신속하게 세포막에 분할25 그들은 혼성, 비 공유 결합 분자의 순 소수성을 증가, 따라서 세포 표면에서 자신의 수명을 향상(26) 올리고스는 다른 세포 나 DNA 기능화 유리 슬라이드에 보완 적인 올리고와 혼성화 할 수있는 방식으로 세포 표면에 제시되어 규정 된 조성, 세포 세포 간격 및 기하학(23,24)로정의 된 2D 또는 3D 세포 패턴을 만듭니다. 패턴된 미세 조직은 표면에서 효소로 갈라져 장기간 3D 배양을 위해 하이드로겔에 내장될 수 있습니다. 1차 세포 또는 줄기 세포와 병용으로 사용될 경우, 세포의 결과 수집은23,27,28로형태 형성을 겪을 수 있다. DPAC는 경쟁 신호6,29에대응하여 성인 신경 줄기 세포 운명의 역학을 조사하기 위해 적용되었으며, 유방 상피 세포의 자가 조직을 연구하고23,28,중간 엽 응축(27)을 통해 "조직 종이 접기"를 생성한다.

DPAC는 다중 세포 집단의 정확한 배치를 허용하고 압출 기반 바이오 프린터 (미크론의 순서에)22,23보다실질적으로 더 나은 해상도를 가지고 있습니다. 또한, 마이크로컨택트 프린팅과 같은 ECM 기반 패터닝 방법과 달리, DPAC는 ECM 코팅표면(15,23)에상이한 세포 유형의 차동 접착을 요구하지 않는다. 조직의 구성이 행동에 미치는 영향, 세포가의사결정을 내릴 때 여러 세포 및 미세 환경 단서를 통합하는방법,세포 쌍이 서로 상호 작용하는 방법에 대한 질문에 답하는 데 이상적입니다. 다른 마이크로패턴 방법에 비해 이 방법의 장점은 단일 이미징 평면에서 3D 세포 배양에 사용될 수 있다는 것입니다, 조직 자기 조직 및 유기성 형태발생의 시간 경과 연구를 용이하게23,27,30.

이러한 장점에도 불구하고 DPAC의 성공적인 구현은 맞춤형 올리고뉴클레오티드 시약의 합성과 DNA 패터닝23,24에대한 특수 장비에 대한 접근을 요구하여 광범위한 채택을 제한하고 있습니다. 예를 들어, 원래 프로토콜에 사용되는 최적의 지질 변형 올리고(LMO)는 맞춤형 합성, 리뇨세액산 또는 팔미티산으로 수정되어야 하며,26을정제해야 한다. 이 과정은 DNA 신디사이저와 고성능 액체 크로마토그래피 기구의 사용뿐만 아니라 메틸라민과 같은 관련 시약의 구입을 필요로, 기관 및 연방 규정 모두의 대상이되는 규제 물질. 대안으로, LMO는 대량으로 사용자 정의 구입할 수 있지만, 이것은 기술에 상당한 선행 투자가 필요합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 맞춤형 합성 LMO 대신 시판 되는 콜레스테롤 수정 올리고(CMO)를 사용하는 DPAC 버전이 개정되었습니다. 비용을 더욱 절감하고 플랫폼의 유연성을 높이기 위해 모듈식 3올리고 시스템으로 변경했습니다. 각 고유 세포 집단에 대해 새로운 콜레스테롤 변형 올리고를 주문하는 대신, 이 프로토콜의 사용자는 모든 세포 집단에 대해 동일한 콜레스테롤 변형 올리고("유니버설 앵커"와 "유니버설 코 앵커")를 사용한 다음 유니버설 앵커와 다른 유형의 아민 기능 DNA를 혼성화하는 저렴하고 수정되지 않은 올리고("어댑터 스트랜드")를 사용할 수 있습니다.

원래 DPAC 프로토콜의 또 다른 제한은 고해상도 액체 프린터 (예를 들어, 나노 에나블러, 바이오 포스 나노 사이언스)를 사용하여 DNA 패턴 슬라이드를 만든23,24. 이 계측기는 뛰어난 해상도와 낮은 시약 요구 사항을 자랑하지만 대부분의 기관에서사용할 수 없으며 인쇄 속도가 상대적으로 낮습니다(초당 약 1개의 피쳐 패턴). 최근에는 DNA 특징을 표면에 패턴화하기 위해 두 가지 포토리소그래피 방법이 개발되었습니다. 비올라와 동료들은 UV라이트(30)에노출되면 단일 좌초 DNA 올리고를 공유하여 결합한 폴리아크라일라미드 및 벤조페논 코팅을 사용하였다. 이 방법을 사용하여, 그(것)들은 세포 수축 및 자기 조직의 결과로 대규모, 프로그램된 모양 변경을 겪은 조직 발판을 만들 수 있었습니다. Scheideler 외. 알데히드 기능화슬라이드(29)에아민 변형 DNA 올리고를 선택적으로 노출시키기 위해 양성 포토레지스트의 UV 노출을 사용하는 방법을 개발하였다. 베이킹과 환원 아미네이션 후, 아민 변형 DNA는 표면에 공유 바인딩됩니다. 이 방법은 성인 신경 줄기 세포의 반응을 조사하여 공간적으로 제시된 자가 재생 및 분화 단서를 조사하는 데 사용되었습니다. 이 문서는 Scheideler 외.의 프로토콜을 조정하여 CMO 표지 된 세포를 캡처할 DNA 패턴을 만듭니다. 이 포토패싱 프로토콜은 클린룸을 사용하지 않고 수행할 수 있습니다. 벤치탑이나 연기 후드에 쉽게 배치할 수 있는 저렴하고 시판적인 장비를 사용합니다. 저렴한 또는 DIY (직접 할 - 그것) 포토 리스그래피 장비의 사용은 깨끗한 방 시설에 액세스하지 않고 연구자에게 접근성을 증가하고 연구원이 시간 이나 자원의 큰 투자없이 기술을 시도 할 수 있습니다31,32. 그러나, 클린룸 시설에서 흔흔게 발견되는 상용 스핀 코터 및 마스크 정렬기를 사용하여 다중 DNA 기능의 더 나은 해상도와 정렬을 달성할 수 있다.

여기서는 DNA 기반 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 세포를 패턴화하는 방법을 설명합니다. 첫째, 포지티브 포토레지스트를 사용한 포토패싱은 알데히드 변형 유리 기판에 아민 변형 DNA의 고해상도 패턴을 생성하는 데 사용됩니다. 다음으로, 슬라이드는 비특이적 세포 부착을 감소시키기 위해 처리되고 PDMS 흐름 셀은 패턴 된 영역 위에 세포를 제한하기 위해 생성된다. 세포는 그 때 콜레스테롤로 기능화되고 그 결과로 세포막으로 삽입하는 짧은 DNA 올리고뉴클레오티드로 표지됩니다. 세포는 DNA micro패턴을 통해 그 때 흐르게 됩니다. 유리 표면의 세포 표면 DNA와 DNA 사이의 혼성화는 DNA 패턴에 대한 세포의 특정 접착을 초래한다. 비 부착 세포는 씻겨 서 부착 된 세포 패턴을 드러냅니다. 이 프로세스는 여러 세포 유형을 패턴화하거나 다층 구조를 만들기 위해 반복될 수 있다. 원하는 경우, 세포는 3D 세포 배양을 위한 ECM에 완전히 내장될 수 있다.

Protocol

1. 설계 실험

  1. 피처 크기, 기능 간격, 관련된 세포 유형 수 및 서로에 대한 세포의 배열을 고려하여 원하는 실험을 계획합니다. 실험 설계 가이드인 보충 파일 1및 예제 올리고 시퀀스가 포함된 보충 파일 2를참조하십시오.
  2. 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 포토마스크를 디자인합니다. 예를 들어 추가 파일 3에서포토마스크가 제공됩니다.
    1. 표준 현미경 슬라이드(25mm x 75mm)의 치수사각형을 그립니다.
    2. 폭 10mm, 길이 10mm의 직사각형 영역 4개영역을 슬라이드 전체에 고르게 분포합니다.
    3. 각 리전 내에서 실험에 원하는 크기, 모양 및 간격인 피처를 그립니다. 셀은 실험에서 이러한 피처만 준수합니다.
    4. 여러 셀 유형에 대해 정렬된 포토마스크를 만들려면 모든 피처 집합이 있는 마스터 드로잉을 만든 다음 각 셀 유형에 해당하는 버전을 저장합니다.
    5. 이 CAD 도면에서 1.2.3 투명 및 더 큰 영역검은색으로 그려진 고해상도(인치당 최소 20,000점)의 투명도 포토마스크를 주문합니다.

2. 알데히드 기능화 슬라이드에 사진 패턴 DNA (Scheideler 외에서 적응 프로토콜29)

  1. 여러 세포 유형을 패터닝하는 경우, 특징의 정렬을 용이하게하기 위해 DNA 패터닝 전에 알데히드 기능 슬라이드에 fiducial 마커를 제조합니다. 신탁 마커를 만드는 다른 방법은 보충 파일 1에서제안됩니다.
    1. 금속 신탁 마커를 만들려면 2.3 - 2.11 단계에 설명된 대로 S1813 양성 포토레지스트를 적용하십시오. 나중에 쉽게 정렬할 수 있는 큰 기능이 포함된 포토마스크를 사용합니다. DNA 패터닝에 사용될 포토마스크의 설계에 이러한 기능을 통합합니다.
    2. 전자건증발(29)을이용하여 티타늄의 박막(100Angstroms)을 슬라이드에 증착한다. 아세톤을 사용하여 과도한 금속과 포토레지스트를 제거한 다음 DNA 포토패닝으로 진행합니다.
  2. DNA 완충제에서 5'아민 변형 올리고의 20 μM 용액을 준비한다(물에서 인산나트륨 50mMM, pH = 8.5). 제안된 올리고 시퀀스에 대한 보충 파일 2를 참조하십시오.
    참고: 일부 패턴 및 용도에 아민 변형 올리고의 5 μM을 조금만 사용할 수 있으므로 표면 DNA 농도를 최적화해야 할 수 있습니다.
  3. 핫 플레이트를 100°C로 예열합니다.
  4. 양면 테이프 또는 진공을 사용하여 알데히드 기능성 유리 슬라이드를 스핀 코터의 로터에 부착합니다.
    주의: 스핀 코팅 시 슬라이드 분리는 안전 위험입니다. 아크릴 상자와 같은 뚜껑이 있는 밀폐된 용기에 항상 스핀 코터를 사용하십시오.
    참고: 다이아몬드 서기관 또는 이와 유사한 기구를 사용하여 슬라이드 모서리에 레이블을 지정하여 유리를 긁습니다. 이는 포토레지스트가 세척된 후 슬라이드 식별 및 방향에 도움이 됩니다.
  5. 일회용 파이펫을 사용하여 포지티브 포토레지스트를 알데히드 슬라이드에 떨어뜨립니다. 코팅도 중간에 하나의 큰 낙하 대신 슬라이드를 가로 질러 포토 레지스트의 작은 방울을 추가(보충 도 1A).
  6. 스핀 코터를 사용하여 슬라이드를 3000 rpm에서 30 s로 회전합니다.
  7. 슬라이드를 100°C 핫플레이트에 1.5분(소프트 베이크)에 놓고 포토레지스트를 교차연결합니다.
  8. 핫플레이트에서 슬라이드를 제거합니다. 슬라이드 위에 이 실험에 원하는 기능을 갖춘 포토마스크를 놓고 포토마스크를 유리조각(보조 도 1B, C)으로무게로 내려놓습니다. 불투명 한 상자(보충 도 1D)에서전체 설정을 덮습니다. UV 램프(365nm 파장, 360mW, 슬라이드5인치, 총 복사 에너지 밀도 100mJ/cm2)로2분 동안 노출합니다.
    참고: 자외선은 포토마스크의 투명한 영역 아래에 있는 포토레지스트의 폴리머 결합을 깨고 DNA가 나중에 부착할 수 있는 영역을 만듭니다.
  9. 3-5 분(보충 도 1E)에대한 개발자 솔루션에 몰입하여 슬라이드를 개발합니다.
  10. 여분의 개발자 솔루션을 물로 헹구는 다. 공기 또는 질소의 스트림에서 건조. (보충도 1F).
  11. 현미경의 밑에 슬라이드를 보고 광석 소학이 성공했다는 것을 확인하십시오. 포토레지스트는 UV 라이트에 민감하기 때문에 이 단계를 신속하게 수행한 다음 슬라이드를 다른 슬라이드를 준비하는 동안 어둠 속에 저장합니다(해당하는 경우).
    참고: 패턴이 성공적으로 된 슬라이드는 각 피쳐에 대해 가장자리를 급격히 정의하고 크래킹이 없으며 가장자리에 피처 왜곡이 없어야 합니다. 정확하고 잘못된 포토리소그래피의 예는 보충 도 2A에제공됩니다. 포토리소그래피가 원하는 기능 품질을 제공하지 않는 경우 문제 해결 제안에 대한 표 1을 참조하십시오.
  12. 슬라이드의 각 광패턴 영역에 20 μM 아민 변형 올리고 용액(2.1단계)의 액적을 추가합니다. 파이펫 팁을 사용하여 전체 영역에 방울을 부드럽게 분산시키십시오. (추가도 1G).
  13. DNA 용액이 슬라이드 표면 (약 1 시간)에 완전히 건조 될 때까지 65-70 °C 오븐에서 슬라이드를 굽습니다.
  14. 패턴이 있는 구운 슬라이드를 15cm 세포 배양 접시에 넣고 셰이커 위에 연기 후드를 놓아 환원 아미네이션을 수행합니다. 100 mg의 나트륨 보하이드라이드를 계량합니다. 연기 후드에 40mL의 인산염 완충식식염(PBS)을 넣고 부드럽게 섞어 패턴 슬라이드가 들어 있는 접시에 추가합니다. 부드러운 흔들림으로 15 분 동안 반응을 진행하십시오.
    참고: 올리고의 아민은 먼저 슬라이드 표면에 알데히드가 있는 쉬프 베이스를 형성합니다. 이것은 DPAC에서 사용하기 전에 돌이킬 수없는 채권으로 변환해야하는 가역적 인 공유 채권입니다. 환원 작용제(borohydride) 첨가하여 Schiff 기지를 환원 아미네이션에 의해 이차 아민으로 변환합니다.
    주의: 물로 보로하이드라이드 나트륨의 반응은 수소 가스를 생성하고 반응이 시작된 후 몇 시간 또는 며칠 동안 계속 그렇게 할 것입니다. 연기 후드에서 환원 아미네이션 단계를 수행하고 모든 나트륨 borohydride 용액 폐기물을 연기 후드에 열거나 느슨하게 덮인 용기에 24 시간 이상 보관하십시오.
  15. 물에 0.1 % 나트륨 도데딜 황산염 (SDS)로 두 번 세척하여 반응되지 않은 DNA를 제거한 다음 증류수로 세 번 제거하십시오. 질소 또는 공기의 스트림에서 슬라이드를 건조.
  16. 슬라이드를 아세톤으로 헹니 나머지 포토레지스트를 제거합니다.
    참고 : 이 시점에서, DNA는 돌이킬 수 없을 정도로 및 공동으로 슬라이드에 부착되었으며 모든 반응되지 않은 알데히드 기능 그룹은 알코올로 변환되었습니다. 포토레지스트가 더 이상 필요하지 않습니다.
  17. 여러 개의 올리고가 패턴이 지정되면 2.4단계로 돌아가 포토마스크를 fiducial 마크에 정렬하고 반복합니다.
    참고: 실험은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 진공 건조기에 슬라이드를 저장합니다. 건조한 조건에서 슬라이드는 품질을 잃지 않고 최대 3 개월 동안 보관 할 수 있습니다.

3. 슬라이드 소수성 (선택 사항) 만들기 (Todhunter 등에서 적응 된 프로토콜24)

참고: 슬라이드의 표면 화학을 수정하여 더 불활성이고 소수성으로 만드는 것이 유리하지만 필요하지는 않습니다. 비특이적 세포 부착은 이러한표면(33)에서감소하여, 따라서 슬라이드의 무늬가 없는 영역으로 세포의 비특이적 결합을 완화한다. 또한, 패턴 된 세포가 궁극적으로 하이드로겔 내에 내장되어 슬라이드에서 옮겨질 경우 표면 처리는 왜곡이나 찢어지지 않고 슬라이드를 가로 질러 셀 라덴 하이드로 겔의 안정적인 이동에 필수적입니다. 실라화(tridecafluoro-1,2,2-테트라하이드로옥틸) 디메틸클로로시란으로 인해 슬라이드 표면에 소수성 불소칼증 이 존재합니다.


주의: 아세트산과 메틸렌 염화물 연기에 노출되는 것을 방지하기 위해 화학 연기 후드에서 3.1 단계에서 모든 단계를 수행합니다.

  1. 10% 아세트산으로 슬라이드를 헹구고 공기 흐름 아래에서 건조시합니다.
  2. 유리 코플린 항아리에서 60mL 메틸렌 염화물(디클로로메탄), 트리에틸라민 0.6mL, 0.6mL(트리데바플루오로-1,2,테트라하이드로옥틸) 디메틸클로로시란용액을 준비한다. 금속 주걱으로 저어서 섞습니다.
    참고: 이러한 시약은 물에 민감합니다. 그들은 건조한 조건하에서 저장하고 가능한 한 신선한 사용해야합니다.
  3. 슬라이드를 시레인 용액이 포함된 코플린 항아리에 추가합니다. 코플린 항아리를 궤도 셰이커(60-80rpm으로 설정)에 놓고 시레인과 슬라이드의 반응이 15분 동안 진행되도록 합니다.
  4. 금속 집게를 사용하여 실레인 용액에서 슬라이드를 제거합니다. 메틸렌 염화물이 들어 있는 코플린 항아리에 1분간 밀어 내밀어 슬라이드에서 과도한 시란을 제거합니다.
  5. 에탄올이 들어 있는 50mL 원콘 튜브에 슬라이드를 담급하십시오. 선동. 증류수를 포함하는 50mL 원물 튜브에 슬라이드를 담급하십시오. 선동.
    참고: 메틸렌 염화물과 물은 오해의 소지가 없으므로 최종 물이 헹구기 전에 과도한 메틸렌 염화물을 제거하기 위해 에탄올 린스가 필요합니다.
  6. 물에서 슬라이드를 제거하고 검사합니다. 슬라이드는 90°보다 큰 접촉 각도를 가진 물방울이 있는 상당히 건조해야 합니다. 슬라이드가 완전히 건조하고 사용될 때까지 진공 건조기에 보관할 수 있습니다.
    참고: 실험은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드를 건조한 상태로 보관합니다.

4. PDMS 유동 셀 준비 및 실험을 위한 슬라이드

참고: 직사각형 PDMS 흐름 셀은 슬라이드의 패턴 영역 위에 셀을 집중하는 데 사용됩니다. 3D로 배양된 실험의 경우, 유동 세포는 하이드로겔을 위한 금형을 형성한다.

  1. SU-8 마스터를 PDMS 유량 셀의 금형으로 사용하도록 합니다.
    1. 핫플레이트를 95°C로 예열합니다.
    2. 실리콘 웨이퍼에 SU-8 2075의 5mL을 추가합니다.
    3. 10대 500rpm의 웨이퍼에서 SU-8을 스핀코트, 30대1,000rpm으로 이어진다. 이렇게 하면 높이34에서최대 240 μm의 피처가 생성됩니다.
    4. 핫플레이트에 웨이퍼를 45분 이상 부드럽게 구워줍니다.
    5. 핫플레이트에서 웨이퍼를 제거합니다. 화면(보충 파일 4참조) (에멀젼 사이드 다운 참조)을 웨이퍼 위에 놓고 유리 디스크로 아래로 무게하여 포토마스크와 슬라이드 사이의 접촉을 보장합니다.
    6. 350mJ/cm2의광채 에너지 밀도를 위해 UV 광(365 nm)으로 노출한다.
    7. 핫플레이트에서 웨이퍼를 12-15분 간 구우습니다.
    8. 웨이퍼를 넓은 유리 용기에 놓습니다. SU-8 개발자 솔루션으로 웨이퍼를 덮습니다. 셰이커에 놓고 적어도 15 분 동안 교반하면서 개발하십시오.
    9. 집게를 사용하여 개발자 솔루션에서 웨이퍼를 제거합니다. 분출 병에서 더 많은 개발자 솔루션을 분사하여 5s에 대해 헹구습니다. 이소프로필 알코올로 스프레이하여 헹지 를 입습니다. 흰색 침전제가 나타나면 웨이퍼를 개발자 솔루션으로 반환하고 더 오래 개발합니다.
    10. 공기 또는 질소의 스트림에서 마른 웨이퍼.
    11. 5 분 동안 슬라이드를 굽습니다.
      참고: 마스터 웨이퍼가 만들어지면 피쳐가 그대로 유지되는 한 무기한 으로 다시 사용할 수 있습니다.
  2. PDMS를 준비합니다.
    1. 계량 보트에서 폴리디메틸실록산 엘라스토머와 크로스링커를 10:1 비율로 추가합니다(질량별). 교부하여 믹싱도 합니다.
    2. 더 이상 거품이 보이지 않게 될 때까지 15-30 분 동안 진공 건조기에서 PDMS를 가스 해제합니다.
    3. 마스터 웨이퍼를 15cm 조직 배양 접시에 놓습니다. 웨이퍼 위에 PDMS를 붓습니다. 거품이 나타나면 진공 건조기에서 몇 분 동안 가스를 해제합니다.
    4. 60°C 오븐에서 3시간 동안 굽습니다.
      참고: 베이킹 후 PDMS 유동 셀을 벤치탑에 무기한 저장할 수 있습니다.
  3. 실험을 위해 PDMS 흐름 셀을 준비합니다.
    1. CMO-DPAC 실험을 시작하기 직전에 마스터 웨이퍼에서 필요한 수의 PDMS 유동 셀을 잘라냅니다. 플라즈마는 표면 친수성 렌더링90 s에 대한 10 cc / 분 실내 공기로 산화.
    2. 각 개별 유동 셀을 잘라서 각 측면에 1-2mm의 PDMS가 남아 있는 다음 유동 셀의 위쪽과 아래쪽을 잘라 내어 입구와 콘센트를 만듭니다.
    3. 2단계와 3단계에서 생성된 패턴 슬라이드를 검색합니다. 포토마스크 위에 정렬합니다.
    4. 포토마스크를 참조로 사용하여 각 패턴 영역의 위치에 PDMS 흐름 셀을 슬라이드에 배치합니다.
    5. 보충도 1H에도시된 바와 같이, 인산완충식염(PBS) + 1% 소 세럼 알부민(BSA)을 각 유류셀의 입구에 50μL을 추가한다. 유동 셀이 PBS + 1 % BSA에 의해 완전히 채워지고 큰 거품이 없는지 확인합니다. 5단계와 6단계로 즉시 진행합니다.
      참고: BSA로 차단하면 슬라이드 표면에 대한 비특이적 셀 접착력을 최소화합니다.

5. 콜레스테롤 변형 DNA로 세포를 들어 올리고 라벨을 부착하십시오.

  1. 콜레스테롤 변형 DNA 솔루션을 준비합니다.
    1. 실험에서 각 셀 세트에 대해, 어댑터 스트랜드의 100 μM 스톡 용액의 3 μL과 콜레스테롤 변형 유니버설 앵커 스트랜드의 100 μM 스톡 용액의 3 μL을 함께 섞는다. 1 분 동안 인큐베이션. 이것은 올리고를 미리 혼성화할 것입니다. 인산염 완충식식염(PBS)의 69μL을 추가하여 4 μM 유니버설 앵커 + 어댑터 용액을 만듭니다.
    2. 실험의 각 셀 집합에 대해 100 μM 유니버설 콜레스테롤 변형 공동 앵커 스트랜드 스톡 솔루션의 3 μL을 PBS 12 μL에 추가하여 20 μM 솔루션을 만듭니다.
  2. 단일 셀 서스펜션을 준비합니다.
    1. 부착 셀의 경우 트립신 또는 기타 해리제를 사용하여 배양 플라스크에서 세포를 제거하십시오. 배양 매체를 추가하여 트립신과 원심분리기를 중화하여 세포를 환원합니다. 비 부착 세포의 경우 세포 현탁액과 원심분리기를 수집하여 세포를 펠릿합니다.
    2. 얼음 차가운 PBS 또는 혈청이 없는 매체의 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브로 1-3 백만 개의 세포를 이송합니다. 원심 분리기 160 x g에서 4 분 동안.
      참고: 사용되는 세포 유형이 응집/응집되기 쉬운 경우, 모든 세척 단계에 칼슘과 마그네슘 이온이 없는 PBS를 사용하여 원치 않는 세포 응집수를 줄입니다. 생존능력이 사용되는 셀 유형에 대한 특별한 관심사인 경우 PBS 대신 혈청이 없는 미디어를 사용하십시오. 태아 소 혈청을 포함하는 매체는 지질 변형 올리고의 통합을 방해할 수 있기 때문에 세포 라벨링에 권장되지 않습니다. 35
  3. 콜레스테롤 변형 올리고로 세포를 라벨.
    1. 얼음 차가운 PBS 또는 혈청이 없는 매체의 75 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 생존가능성을 극대화하고 세포 표면에서 콜레스테롤으로 변형된 올리고의 손실을 최소화하기 위해 라벨링 및 세척 과정 전반에 걸쳐 얼음 양동이에 세포를 보관하십시오.
      참고: DNA를 추가하기 전에 세포를 다시 중단하면 DNA의 분포가 세포 집단 전체에 걸쳐 균일합니다.
    2. 5.1단계에서 생성된 4μM 유니버설 앵커 + 어댑터 용액의 75 μL을 셀 서스펜션을 포함하는 마이크로센심분리기 튜브에 추가합니다. 파이펫팅으로 완전히 섞으세요. 얼음에 5 분 동안 배양.
    3. 마이크로센심분리기 튜브에 유니버설 코 앵커 솔루션의 15 μL을 추가합니다. 파이펫팅으로 완전히 섞으세요. 얼음에 5 분 동안 배양.
    4. 셀 서스펜션에서 과도한 올리고를 제거합니다. 미세 원심 분리튜브에 얼음차가운 PBS 또는 세럼이 없는 매체 1mL를 추가합니다. P1000 파이펫과 섞으세요. 원심분리기는 4°C에서 4분 동안 160 x g의 원심분리기. 상부체를 폐기합니다. 두 번 더 반복합니다.
      참고: 세포가 응집되기 쉬운 경우 최종 세척 전에 40 μm 필터를 통해 셀 서스펜션을 전달합니다. 세포가 마이크로 센심 분리기 튜브의 측면에 흡착하는 경향이있는 경우, 카제인으로 튜브를 미리 차단하는 것이 좋습니다.

6. DNA 표지 세포를 패턴으로 지정

  1. 얼음차가운 PBS 또는 혈청 이없는 매체에서 세포를 다시 중단하여 적어도 2,500만 개의 세포/mL의 세포 밀도 를 생성합니다.
    참고: 4단계에서 설명된 10mm x 15mm x 200 μm PDMS 유동 셀 중 4개를 사용한 슬라이드1회슬라이드의 경우, 이 조밀한 셀 서스펜션의 약 100μL이 필요합니다. 이러한 세포의 대부분은 패턴을 준수하지 않고 궁극적으로 폐기될 것이지만, 패턴위에 세포의 매우 집중된 용액을 갖는 것은 세포 패터닝의 효율성을 극적으로 향상시킵니다.
  2. 슬라이드를 선택하고 약간 기울이십시오. 패턴 슬라이드의 각 유동 셀입구에 셀 서스펜션 25μL을 추가합니다. 콘센트에서 PBS + 1% BSA 용액을 제거하여 셀 서스펜션이 PDMS 유동 셀을 채울 수 있도록 합니다. 얼음이나 실온에서 30초 동안 배양합니다.
    참고: 이 시점에서 현미경 의 밑에 유동 세포를 보는 것은 세포 사이 거의 또는 전혀 간격없이 조밀하게 포장된 세포를 보여주어야 합니다. 보충 도 2B를참조하십시오.
  3. 슬라이드의 콘센트에서 셀 서스펜션 5 μL을 흡인하고 입구에 다시 추가합니다. 흐름 셀당 10회 반복합니다.
    참고: CMO 표지된 세포의 DNA 패턴 슬라이드에 대한 접착은 거의 즉각적입니다. 패턴을 통해 세포를 여러 번 흐르면 세포가 주어진 DNA 반점 위로 흐르고 포획될 확률이 높아집니다.
  4. 부드럽게 파이펫 PBS 또는 혈청없는 매체는 여분의 세포를 씻어 각 흐름 셀의 입구로. 콘센트에서 셀 서스펜션을 수집합니다. 2-4번 반복하거나 현미경 아래 슬라이드의 육안 검사가 남은 과도한 세포가 없음을 확인합니다.
    참고: 제1 세척에서 과잉 세포를 저장하는 것이 유리할 수 있습니다. 패터닝 효율이 만족스럽지 않으면, 초과 세포는 더 많은 세포 조밀 한 용액을 생성하기 위해 PBS의 낮은 부피에서 원심 분리 및 재중단 될 수 있으며, 그 후 프로세스는 6.2 단계에서 반복 될 수있다.
  5. 패턴의 각 셀 집합에 대해 6.1-6.4 단계를 반복합니다. 여러 세포 유형이 표면 템플릿에 의해 직접 패턴화되는 패턴의 경우 패턴의 가장 풍부한 셀 유형으로 시작하여 가장 풍부한 셀 유형으로 마무리하십시오.
    참고: 세포가 모두 직교 DNA 서열로 표지되는 조건에서도 세포를 풀링하는 대신 셀룰러 어셈블리의 각 라운드를 순차적으로 수행하는 것이 좋습니다. 세포를 풀링하면 각 세포 집단을 효과적으로 희석시키고 패터닝 효율을 감소시킵니다.
  6. 최종 셀 어셈블리 라운드가 완료되면 다음 단계는 특정 실험에 따라 달라집니다. 셀이 유리에 남아 있는 경우 슬라이드가 포함된 페트리 접시에 미디어를 추가한 다음 부드럽게 집게를 사용하여 PDMS 흐름 셀을 슬라이드에서 벗어나게 합니다. 세포가 하이드로겔에 내장되어 3D로 배양될 경우 7단계로 진행한다.

7. 3D 배양용 하이드로겔로 이전(선택 사항)

  1. 2% DNase를 포함하는 하이드로겔 전구체 용액을 준비합니다.
    참고: 솔루션의 구성은 실험 적인 설정에 따라 달라집니다. Matrigel 및 Matrigel과 콜라겐의 혼합물 나는이 프로토콜에서 잘 작동하지만, 다른 하이드로 겔도 가능하다.
  2. 각 유량 셀의 입구에 2% DNase를 포함하는 하이드로겔 용액 50μL을 추가합니다. 출구에서 과도한 유체를 흡인하여 하이드로겔 용액을 유량 셀로 유도합니다. 점성 하이드로겔 전구체의 경우, 슬라이드를 약간 기울이면 하이드로겔이 유량 셀로 흘러들어가는 데 도움이 될 수 있다.
  3. 하이드로겔이 세포와 표면 사이의 DNA 기반 접착력을 설정하고 절단할 수 있도록 37°C에서 30-45분(하이드로겔 겔화 운동제에 따라 다름)으로 슬라이드를 배양한다.
  4. 슬라이드에서 각 유동 셀을 제거하고 하이드로겔 전구체 용액 위에 놓습니다.
    1. 하이드로겔 전구체 50μL을 2웰 챔버 슬라이드 또는 6웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
    2. 각 유동 셀의 양쪽에 있는 PBS의 파이펫 10 μL.
    3. 면도날 이나 미세 한 점 핀셋을 사용하여 유동 셀의 전체 길이를 따라 PBS를 배포 한 다음 유동 셀의 측면을 부드럽게 들어 올려 PBS가 하이드로겔 밑으로 돌진합니다.
      참고: 슬라이드를 가로질러 하이드로겔을 "플로팅"하여 왜곡이나 찢어지지 않고 이송할 수 있습니다.
    4. 면도날을 사용하여 유동 셀을 유리 슬라이드 가장자리로 부드럽게 이동합니다.
    5. 슬라이드를 반전시면 됩니다. 면도날을 사용하면 흐름 셀을 슬라이드에서 밀어 내므로 면도날 위에 떨어지십시오.
    6. 곡면 집게를 사용하여 면도날에서 유동 셀을 선택합니다. 유동 셀을 반전하여 셀이 바닥에 있는 다음 하이드로겔 전구체 용액의 액적 위에 놓습니다.
    7. 각 흐름 셀에 대해 7.4.1 - 7.4.6 단계를 반복합니다.
  5. 패턴 세포를 함유한 하이드로겔이 하이드로겔 밑줄에 결합하여 패턴 세포의 전체 포함을 초래할 수 있도록 적어도 30분 동안 배양한다.
  6. PDMS 흐름 셀을 제거합니다.
    1. PDMS 흐름 셀을 몰입하기에 충분한 미디어를 추가합니다.
      참고: 미디어의 유입은 하이드로겔과 PDMS 유동 셀 사이의 접착력을 느슨하게 합니다.
    2. 유동 셀의 긴 축을 따라 방향의 곡면 포셉을 사용하여 흐름 셀이 튀어 나와 미디어로 떠들 때까지 부드럽게 움직입니다. 집게로 유동 셀을 수집하고 폐기합니다.
      참고: 최적의 결과를 얻으려면 곡선 된 집게를 확산하고 PDMS 흐름 셀의 벽에 부드러운 압력을 가하십시오. 유동 셀의 긴 축 방향으로 힘을 적용합니다.

8. CMO로 셀의 성공적인 라벨링 확인(선택 사항, 문제 해결)

  1. 실험에서 사용되는 어댑터 스트랜드의 표면 접착 서열에 상보적인 형광 변형(FAM 또는 AF647) 올리고뉴클레오티드를 주문한다.
  2. CMO DNA를 가진 세포에 레이블을 지정하고 5 단계에서 설명된 바와 같이 과잉 DNA를 씻어냅니다. 얼음 차가운 PBS의 200 μL에서 다시 중단.
  3. PBS에서 형광표지상보성 올리고뉴클레오티드의 4 μM 용액을 구성한다. 이 용액의 200 μL을 셀 서스펜션에 추가합니다. 얼음에 5분 동안 배양하십시오.
  4. 얼음차가운 PBS 1mL를 추가합니다. 혼합. 원심 분리는 그들을 펠릿 세포를. 상부체를 제거합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하여 혼성화되지 않은 DNA를 씻어내도록 합니다.
  5. 세포 표면에 DNA의 존재를 정량화하기 위해 분석 흐름 사이토메트리를 수행합니다.
    1. 유동 세포계에서 DNA로 표지되지 않은 제어 세포를 분석합니다. 이 인구에 따라 게이트를 설정합니다.
    2. 형광으로 표지된 상형 올리고뉴클레오티드로 치료된 CMO 표지 세포를 분석한다.
    3. 평균 형광 강도를 계산합니다.

Representative Results

이 프로토콜을 사용하면 사용자 지정 시약 또는 고가의 클린룸 장비를 사용하지 않고도 2D 및 3D로 셀을 패턴화할 수 있습니다. 그림 1은 프로토콜에 대한 개요를 보여 주습니다. 첫째, DNA 기능성 슬라이드는 포토리소그래피를 통해 만들어집니다. 다음으로 셀은 CMO로 레이블이 지정됩니다. 그 때 세포는 슬라이드를 통해 흐르고, 슬라이드의 DNA 기능화 영역에만 부착됩니다. 과잉 세포가 씻겨 나면 원하는 세포 패턴이 드러난다. 이러한 세포는 슬라이드상에서 배양되거나 DNase를 함유하는 하이드로겔에 내장되어 3D 세포 배양을 위한 슬라이드에서 이송될 수 있다.

CMO를 가진 세포의 라벨은 DNA 패턴 슬라이드에 그들의 부착을 허용합니다(그림 2). 첫째, 콜레스테롤 변형 유니버설 앵커 스트랜드는 어댑터 스트랜드와 미리 혼성화된다. 다음으로 유니버설 앵커 + 어댑터 용액은 셀 서스펜션과 함께 1:1을 혼합합니다. 유니버설 앵커 + 어댑터 복합체의 콜레스테롤이 세포막에 삽입됩니다. 유니버설 앵커 스트랜드와 혼성화되는 콜레스테롤 변형 유니버설 코 앵커 스트랜드를 첨가하여복합체(26)의순 소수성을 증가시킴으로써 세포막내CMO 복합체의 안정성을 향상시킨다. 세포 현탁액에서 과도한 DNA를 씻어 낸 후, 세포는 슬라이드 를 통해 흐르게된다. 어댑터 스트랜드와 표면 DNA 스트랜드 사이의 혼성화는 슬라이드의 DNA 패턴 영역에 세포의 부착을 초래한다.

세포의 패턴은 포토리소그래피를 사용하여 알데히드 변형 유리슬라이드(29)의 특정 부위에 아민 변형 DNA 올리고의 부착을 제한함으로써 생성된다(도3A). 포지티브 포토레지스트는 알데히드 기능슬라이드에 스핀 코팅을 합니다. 투명 포토마스크는 슬라이드 위에 배치되고 슬라이드가 UV 라이트에 노출됩니다. 개발 후, UV 빛에 노출된 슬라이드의 영역은 더 이상 포토레지스트로 코팅되지 않으므로 알데히드 군을 노출시켰다. 아민 변형 DNA 올리고스의 20 μM 용액은 슬라이드에 떨어지고 패턴 영역을 덮기 위해 확산됩니다. 베이킹다음에 환원 아미네이션이 이어지며 아민 변형 DNA와 슬라이드 사이의 공유 결합이 발생합니다. 놀랍게도, 이 과정은 이전에 패턴된올리고(도 3B)의기능 상실 없이 여러 올리고를 패턴화할 수 있다. 그러나, 주의는 중복 패턴을 피하기 위해 취해야한다, 이는 감소 농도에서 두 올리고의 존재 결과(보충 도 3). 모듈형 도메인(3엔드에 가장 가까운 20개의 베이스)에서 다른 어댑터 스트랜드를 사용하여 여러 셀 모집단을 순차적으로 패턴화할 수 있습니다.

이 포토패싱 프로토콜은 클린 룸의 맥락에서 Scheideler 등에서 개발되었지만 화학 연기 후드 내에 쉽게 맞는 저렴한 "홈 브루"포토 리소그래피 설정으로 유사한 결과를 얻을 수 있음을 입증했습니다. 설정에는 DC 모터, 디지털 컨트롤러 및 CD 케이크 상자로 만든 $ 400 스핀 코터와 개별 구성 요소에서 조립되어 용도가 변경 된 날카로운 용기(보충 도 1)에보관 된 UV 램프가 포함됩니다. 홈 브루 포토리소그래피 설정의 주요 장점은 단일 셀 크기의 기능을 만들 수 있는 동시에 매우 저렴하다는 것입니다 (모든 장비에 대해 < $ 1000). 그러나, 저렴한 장비의 사용은 한계가 있다 - 예를 들어, 마스크 정렬기를 사용하지 않고 여러 DNA 올리고를 패턴에 fiducial 마커를 정확하게 정렬하는 것이 더 도전적이다. 클린룸에 편리하게 접근할 수 없거나 대규모 투자 없이 이 방법을 시도하려는 실험실에 이 저렴한 포토리소그래피 설정을 사용하는 것이 좋습니다.

DNA 프로그래밍 된 세포 접착을위한 최적의 조건을 확인하기 위해, 우리는 체계적으로 세포 표면에 DNA 가닥의 농도를 변화시키고 DNA 변형 유리 표면에 세포 접착의 효율을 측정했다. 라벨링 솔루션의 유니버설 앵커 + 어댑터 스트랜드 및 유니버설 공동 앵커의 농도는 여러 수의 크기(도 4A,B)에따라 다양하여 세포당104-10 6 DNA 복합체(보충 도4)를초래하였다. 세포 접착력은 세포가 0.05 μM 이하의 농도로 CMO로 표시되었을 때 DNA 패턴에 대한 세포 접착력이 최소화되고 2.5 μM 이상의 농도로 높은 점유율을 가지며 용량의존성이었습니다. 따라서 유니버설 앵커 + 어댑터 스트랜드의 2 μM 솔루션과 대부분의 실험에서 유니버설 코 앵커의 2 μM 솔루션을 사용했습니다. 또한 유리 표면에 사용된 DNA의 양이29개 감소하거나 어댑터 스트랜드와 표면 가닥 간의 불일치가 증가하면 세포 접착도 감소할 것으로 예상됩니다. 어댑터 스트랜드 시퀀스 디자인에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2에서제공됩니다. CpG 반복 없이 어댑터 스트랜드를 이용한 CMO 라벨링은 마우스 TLR9(보충 도 5)를발현하는 HEK 세포에서 TLR9를 자극하지 않았다.

우리는 개정 된 프로토콜이 재현 가능하고 효율적인 DNA 프로그래밍 세포 접착력을 제공한다는 몇 가지 데모를 제공합니다. 예를 들면, CCM로 표지된 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVECs)는 고효율을 가진 DNA 패턴에 부착됩니다. CMO 라벨이 부착된 HUVEC뿐만 아니라 LMO 라벨이 부착된 HUVEC(그림5A). CMO-DPAC를 사용하여 패턴화된 셀은 생존력과 기능을 유지했습니다. CMO로 표지된 세포는 칼세인 AM과 에디듐 호모이머에 의해 염색되어 생존가능성을평가하였다(보충도 6). 표지되지 않은 대조군 세포에 비해 생존력의 차이는 작았다(94% 대 97%). CMO-DPAC를 통해 패턴화되어 5일간의문화(그림 5B)를거쳐 올바르게 배분및 편광을 할 수 있었다. DPAC는 또한 제 3 차원(도 5C)으로세포의 패턴을 정교화하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 다층, 다세포 응집체는 보완적인 CmOs(그림5C)로표지된 세포의 층을 번갈아 하여 생성될 수 있다. 이러한 실험은 프로토콜이 재현가능하고, 세포 생존 가능성 또는 기능에 부정적인 영향을 미치지 않으며, 3D ECM에서 단일 이미징 평면 내에서 성공적으로 배양될 수 있는 셀룰러 패턴을 산출한다는 것을 보여줍니다.

DPAC는 세포 접착을 직접하기 위해 직교 DNA 서열을 제공함으로써 단일 표면에 여러 세포 유형을 패킹하는 방법을 제공합니다. DPAC의 이 기능을 구현하려면 포토리소그래피에 의해 생성된 DNA 패턴이 서로 일치해야 합니다. 슬라이드에 증착된 금속 수탁 마커는 여러 광마스크의 정렬을 허용하고 따라서 한 번에 여러 셀 유형의 패터닝을 허용하였다. MCF10은 다양한 독특한 염료로 염색된 직교 CMO로 표시되고 UC 버클리 및 UCSF 로고(그림6)의시각화를 만들기 위해 패턴화되었습니다. 이 실험은 여러 고유 세포 집단이 고정밀 및 교차 오염 없이 함께 패턴화될 수 있음을 보여줍니다.

CMO-DPAC를 사용하여 세포의 성공적인 패터닝은 고품질 포토리소그래피, 세포 표면에 올리고의 충분한 농도, 패턴을 통해 세포의 고밀도 및 충분한 세척을 필요로한다. 이러한 단계 중 하나의 실패는 최종 결과에 영향을 줍니다. 보조도 2에는 정확하고 잘못된 광석촬영(보충도2A)의예상 이미지가 포함되어 있으며, 패턴에 대한 바람직한 세포 밀도는 DPAC(보충도2C)의후속 단계에서 지나치게 격렬한 배관으로 인한 패턴 세포의 손실(보충도 2C), 및 원치 않는 세포덩어리(보충도 2D)를포함한다. 표 1에는 일반적인 오류 지점 목록과 제안된 문제 해결이 포함됩니다. 형광 상보 올리고의 사용은 슬라이드에 패턴 DNA의 존재와 흐름 세포 측정에 의해 세포 표면에 CmOs의 존재를 확인하기 위한 문제 해결을위한 도구로 권장됩니다 (프로토콜의 8 단계 참조).

Figure 1
그림 1: CMO-DPAC 프로토콜 개요입니다. 첫째, DNA 패턴 슬라이드는 알데히드 기능성 유리 슬라이드를 긍정적 인 포토 레지스트로 코팅하고 원하는 패턴의 투명 도면으로 덮고 UV 빛에 노출시킴으로써 만들어집니다. UV 노출 된 포토 레지스트는 알데히드 슬라이드의 노출 된 영역을 떠나 표면에 아민 기능 DNA의 결합을 허용, 개발자와 함께 멀리 세척된다. 그런 다음 셀은 CMO로 레이블을 지정하고 표면 위로 흐르게 됩니다. 세포막의 DNA는 표면의 DNA에 혼성화되어 유착을 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 셀은 단계별 프로세스에서 CMO로 레이블이 지정됩니다. 첫째, 콜레스테롤 변형 유니버설 앵커 스트랜드는 어댑터 스트랜드와 미리 혼성화된다. 다음으로 유니버설 앵커 + 어댑터 용액이 셀 서스펜션과 혼합됩니다. 유니버설 앵커 + 어댑터 복합체의 콜레스테롤이 세포막에 삽입됩니다. 인큐베이션 후, 콜레스테롤 변형 유니버설 코 앵커 스트랜드는 세포 현탁액에 추가되어 유니버설 앵커 스트랜드와 혼성화되어 세포막에 삽입합니다. 제2 콜레스테롤 분자의 첨가는 DNA 복합체의 순 소수성을 증가시키고멤브레인(26)내에서 안정화된다. 과잉 DNA를 세척한 후, 세포는 집중되어 패턴 표면 위에 PDMS 유동 세포에 첨가된다. 어댑터 스트랜드의 3'끝은 유리 슬라이드의 표면 DNA 스트랜드와 혼성화되어 보완 DNA로 기능화 된 영역에서 특히 슬라이드에 접착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 포토리스소그래피는 궁극적으로 세포의 배치를 지시하는 DNA 패턴 슬라이드를 만드는 데 사용됩니다. (A)포토리소그래피 프로세스개요. 알데히드 기능슬라이드는 양수 포토레지스트로 스핀 코팅처리되어 있습니다. UV 광은 셀 접착이 원하는 투명투명 포토마스크를 통해 슬라이드에 빛납니다. 슬라이드가 개발된 후 이전에 UV 광에 노출된 영역이 알데히드 그룹에 노출되었습니다. 아민 기능성 DNA 올리고의 20 μM 용액을 슬라이드에 떨어뜨리고 패턴 영역위로 확산됩니다. 슬라이드는 아민과 알데히드 그룹, 가역 적 공유결합(29)사이의 Schiff 결합(C=N)의 형성을 유도하기 위해 구워낸다. PBS에서 0.25%의 나트륨 보로하이드라이드를 가진 후속 환원 아미네이션은 환원 아미네이션에 의한 이차 아민으로 Schiff 기지를 변환하여 DNA와 슬라이드 사이의 돌이킬 수없는 결합을 초래합니다. 나머지 포토레지스트는 아세톤으로 헹도으로써 제거할 수 있습니다. (b)이러한 과정은 다중 성분 DNA 패턴을 생성하고 따라서 다중 세포 집단을 가진 실험을 수행하기 위해 반복될 수 있다. (i) 첫 번째 올리고가 패턴화된 후 슬라이드는 다시 포토레지스트로 코팅되고 프로토콜은 이전과 같이 진행됩니다. 여러 DNA 가닥을 패터닝하기 위해서는 수탁 마커를 사용하는 포토마스크의 정렬이 필요합니다. (ii) 패턴이 있는 각 셀 유형은 어댑터 스트랜드의 20기 모듈형 도메인과 다릅니다. 보완적인 올리고의 직교 세트를 사용하여, 다중 세포 모형은 교차 접착없이 패턴화될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: CMO 표지 된 세포의 DNA 패턴에 부착된 세포는 라벨링 중에 CMO 농도의 함수로서 증가합니다. 이 실험에서는 유니버설 앵커 + 어댑터 스트랜드(사전 혼성화) 및 유니버설 공동 앵커가 동일한 농도로 사용되었습니다. 농도는 세포의 CMO 라벨링 중 세포 현탁액에서 CMO의 농도를 지칭한다. (A)세포 라벨링 중 CMO 농도의 함수로서 CMO 표지 MCF10A 세포에 의해 점유된 15 μm 직경 DNA 반점의 백분율을 정량화한다. 세 가지 실험에서 표준 편차가 ± 평균으로 표현되는 데이터입니다. (B)CMO의 상이한 농도에서 DNA 패턴(마젠타)과 부착된 MCF10A(시안)의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: CMO-DPAC를 사용하여 배양 및/또는 계층화를 위한 3차원 하이드로겔에 삽입될 수 있는 2차원 세포 패턴을 생성하여 다층 구조를 생성할 수 있다. (A)CMO 표지된 인간 배빌릭 정맥 내피 세포(HUVECs)와 LMO 표지 된 HUVECs 사이의 직접 비교는 선형 DNA 패턴을 부착한다. 세포 라벨링의 두 가지 방법은 DNA 패턴의 거의 100 % 점유를 초래합니다. (B)단일 Madin-Darby 개 신장 세포(MDCKs)를 발현하는 H2B-RFP는 15 μm 직경 반점에 200 μm 간격을 두어 이후 트리겔에 내장하였다. 문화의 120 h 후, 결과 상피 낭종 고정 및 E-cadherin에 대 한 얼룩, 액틴, 그리고 콜라겐 IV. 흰색 상자에 스페로이드는 자세히 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm.(C)다층 세포 구조는 상호 보완어댑터 가닥과 패턴화로 별도의 세포 집단을 라벨링하여 생성될 수 있으므로 세포의 각각새로 추가된 세포가 세포 층에 부착되도록 한다. (i)다층 구조를 생성하기 위해 세포 집단의 순차적 패터닝의 회로도. (ii) 이 프로세스를 사용하여 MCF10A의 3층 셀 집계(염료를 사용하여 시각화)가 만들어졌습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 여러 세포 유형은 교차 오염 또는 접착 손실 없이 패턴화될 수 있다. 여러 아민 변형 DNA 올리고는 알데히드 슬라이드에 순차적으로 패턴화되고 금속 신탁 마커를 사용하여 정렬하였다. MCF10A의 세 인구 (시안, 마젠타, 노란색)는 보완 CMO로 표시 된 독특한 염료로 얼룩져, 그리고 슬라이드에 패턴, UC 버클리와 UCSF 로고의 이미지의 결과로. 배율 막대 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: 벤치탑 포토리소그래피 설정의 예 이미지입니다. (A)스핀 코팅 전에 양수 포토레지스트로 덮인 스핀 코터에 슬라이드. (B)투명 포토마스크 의 그림. (C)노출 시 포토마스크는 포토레지스트 코팅 슬라이드와 유리 디스크 사이에 끼워져 있습니다.(D)UV 램프용 하우징은 용도가 재사용된 날카로운 용기로 만들어졌다. (E)개발자 솔루션에 몰입 슬라이드. (F)슬라이드를 개발했습니다. (G)아민 변형 DNA 용액이 슬라이드의 패턴 영역에 확산된다. (H)PDMS 유동 셀은 슬라이드의   패턴 영역 위에 배치. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 이 프로토콜의 일반적인 실패의 몇 가지 예입니다. (a)(i)UV 노출 또는 과다 개발 기능 전에 언더 베이킹은 가장자리가 들쭉날쭉하고 크기가 불규칙할 수 있는 기능을 초래할 수 있다. (ii)기능, 균일한 특징 크기, 패턴에 명백한 균열이 없는 정확한 포토패턴 슬라이드의 예. 스케일 바 = 50 μm.(B)세포 밀도는 패터닝 효율에 매우 중요합니다. 현미경의 밑에 패턴의 상단에 세포를 관찰할 때, 왼쪽에 있는 예제 심상에 의해 입증된 바와 같이, 세포 사이 몇몇 간격이 존재해야 합니다. 스케일 바 = 50 μm.(C)패턴 셀은 패턴 세포를 손상시키고 빠질 수있는 지나치게 격렬한 파이펫팅에서 발생하는 유체 력에 민감 할 수 있습니다. 다층 셀 응집체는 바닥에 있는 한 세포가 다중 세포의 구조를 지원하기 때문에 특히 취약합니다. (i)성공적으로 Matrigel에 내장 된 세포 집계의 배열. (ii)점성 마트리겔을 너무 적극적으로 피펫팅의 결과로 제거된 세포 응집체의 격자. (D)세포의 응집은 특히 상피 세포와 함께 발생할 수 있습니다. 이 덩어리는 일반적으로 동종이지만 세포가 특히 끈적거리는 경우 이종화 (다른 유형의 이미 패턴 된 세포에 응고하는 세포)일 수 있습니다. 이미지는 MCF10A의 세 가지 상이한 인구가 3개의 다른 단세포 크기의 DNA 반점(15 μm)으로 구성된 어레이에 패턴화되었다는 것을 보여준다. 대부분의 DNA 반점은 2-4 세포가 붙어 있습니다. 응집은 EDTA 처리에 의해 또는 패터닝 전에 덩어리를 필터링해서 해결될 수 있습니다. 스케일 바 = 100 μm.   이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 3: 겹치는 포토패턴은 농도가 감소된 두 올리고의 존재를 초래합니다. 두 개의 직교 아민 변형 올리고는 순차적으로 포토 패턴, 먼저 수직 선 (스트랜드 1), 겹치는 수평 선 (스트랜드 2). 올리고는 형광 보완 올리고와 혼성화에 의해 시각화되었다. (A)스트랜드 1의 형광 이미지. (b)겹침에 걸친 100 μm 수직 선 에 걸쳐 스트랜드 1의 형광 프로파일의 정량화. (C)스트랜드 2의 형광 이미지. (D)겹침에 걸친 100 μm 수평선을 통해 스트랜드 2의 형광 프로파일을 정량화한다. 스케일 바 = 50 μm.   이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 4: CMO 라벨 농도의 함수로서 세포 표면에 DNA 복합체의 정량화. HUVECs는 CMO 용액의 다른 농도로 표시되었다, 세척, 다음 형광 보완 가닥으로 배양. MESF(동등한 수용성 플루오로크롬의 분자) 마이크로스피어 키트는 정량적 흐름 세포측정을 수행하였으며 라벨링 중 CMO 농도의 함수로서 세포 표면에 DNA 복합체의 수를 추정하는 데 사용되었습니다.   이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 도 5: CMO 라벨링은 TLR9 응답을 자극하지 않습니다. CMO 라벨링이 TLR9의 DNA 검출 메커니즘을 유발할지 여부와 어댑터 스트랜드 서열에서 CpGs에 의해 영향을 받을지 여부를 확인하기 위한 실험이 수행되었습니다. 마우스 TLR9를 발현하는 HEK 세포는 ODN 1826(CpG 함유 TLR9 작용제), CMO 유니버설 앵커 + 유니버설 코 앵커 + 어댑터 스트랜드의 0.2 μM으로 하룻밤 사이에 배양되었습니다. ODN 1826(CMO-CpG) 또는 CMO 유니버설 앵커 + 유니버설 코 앵커 + 어댑터 스트랜드와 동일한 서열을 포함하되 GpC(CMO-GpC)를 대체하는 유사한 시퀀스를 함유하고 있습니다. TLR9 자극은 SEAP (분비 된 배아 알칼리성 인산염)의 생산을 초래할 것이다. SEAP 분비는 색소 분석법(흡광도)에 의해 정량화되었다. 치료 조건은 PBS로만 취급된 휴식 세포에 비교되었습니다. CMO-GPC를 통한 배큐베이션은 TLR9 발현을 자극하지 않았다. CMO-CpG를 가진 잠복식은 휴식 세포 보다는 약간 높았습니다 그러나 ODN-1826 보다는 훨씬 더 낮습니다.   이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 6: CMO 라벨링 프로세스 후 셀의 생존가능성. 프로토콜이 생존에 미치는 영향을 평가하기 위해 HUVEC는 4명으로 나뉘었으며, 하나는 1h의 얼음 위에 남아 있었고, 하나는 PBS로 모의 라벨이 붙었지만, 그렇지 않으면 모든 원심분리기및 세척 단계를 통해 촬영되었으며, 하나는 CMO로 표시되고, 하나는 CMO로 표시되고 40 μm 필터를 통해 필터링하여 덩어리를 제거했습니다. 세포는 살아있는 죽은 세포의 수를 평가하기 위하여 칼신 AM 및 에티듐 homodimer로 염색되었습니다. 모든 처리는 얼음 통제 (Tukey 포스트 혹 분석을 가진 단방향 ANOVA)보다는 현저하게 감소된 생존귀 귀착되었습니다, 그러나 CMO 라벨링에 대한 평균 생존율은 대략 94%이었습니다. 세 가지 독립적인 실험에서 수집된 데이터입니다. * = p < 0.05. = p < 0.0001   이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

결과 가능한 원인 제안된 수정 사항
포토리소그래피 – 특징이 금이 간 일관성이 없거나 부적절한 소프트 베이크 소프트 베이킹 시간을 최대 3분까지 늘립니다. 핫플레이트의 실제 온도를 확인하고 필요에 따라 온도 상승
포토리소그래피 – 특징은 날카롭지 않거나 포토레지스트가 그 안에 남아 있습니다. 개발 중 슬라이드가 개발자 솔루션에 소요되는 시간을 늘리십시오. 부드러운 동요를 통합
포토리소그래피 – 슬라이드 전반에 걸쳐 일관성이 없는 기능 자외선이 중앙에 집중되지 않거나 제대로 집중되지 않을 수 있습니다. 균일한 강도의 정렬된 빛을 보장하기 위해 UV 조명 설정을 조정
셀은 고효율패턴 반점을 준수하지 않습니다. 표면에 충분한 DNA DNA가 형광 상보 올리고와 슬라이드를 혼성화한 다음 현미경으로 이미징하여 표면에 존재하는지 확인합니다.
세포는 CMO로 부적절하게 표시됩니다. 세포 현탁액에 형광 상보 올리고를 추가하고 유동 세포 측정을 통해 형광을 확인합니다.
패턴 에 대한 충분한 세포 PDMS 유동셀, 원심분리기에서 세척하여 세포를 수집하고, 세포를 농축하기 위해 더 낮은 부피로 다시 일시 중단
셀 서스펜션에 너무 많은 남아 있는 CMO, 슬라이드에 DNA와 혼성화 또 다른 세척 단계를 추가합니다. 매 세척시 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.
시간과 온도로 인해 CMO의 내재화가 너무 많이 CMO로 셀에 레이블을 지정한 후 신속하게 작업합니다. 세포를 유지하고 얼음에 밀어 얼음 차가운 시약을 사용
세포 덩어리 세포는 트립시화 중에 적절히 분리되지 않았습니다. 셀 세차 하는 동안 PBS + 0.04% EDTA를 사용; 최종 세척 전에 35 μm 필터를 통해 셀 서스펜션을 통과
셀은 특별히 부착되지 않습니다. 한 특정 영역에서 슬라이드에 긁힌 자국, PDMS 흐름 세포의 정렬 불량 또는 패턴 영역 외부의 DNA 유출로 인해 될 수 있습니다. 스크래치를 피하고 PDMS 흐름 셀을 패턴 영역에 정렬하십시오.
세포가 사방에 준수하는 경우 – 부적절한 차단 또는 세척 세포를 패턴화 한 후 더 많은 세서히를 추가하십시오. 세차하는 동안 더 적극적으로 파이펫; 세포 패터닝을 시작하기 전에 1% BSA를 더 길게 블록; 실란화 슬라이드(선택 단계 3) 또는 물방울의 접촉 각을 측정하여 사일라화가 성공했습니다.
흐름 셀 내의 거품 형태 플라즈마 산화 중에 생성된 파이프 팅 오류, 고르지 않은 친수성 표면 거품이 작은 경우, 흐름 셀의 입구에 PBS를 추가하고 씻을 수 있습니다. 거품이 큰 경우 PDMS 흐름 셀에 부드러운 압력을 가하여 거품을 입구 또는 콘센트쪽으로 밀어 놓습니다.
세포는 처음에 패턴을 고수하지만 세차 하는 동안 제거, 다른 세포 유형의 패턴, 또는 하이드로겔 전구체를 추가 너무 적극적으로 파이펫팅에서 전단 힘은 세포가 표면에서 분리될 수 있습니다. 후속 세차, 셀 패터닝 라운드 또는 하이드로겔 전구체 를 추가하는 동안 더 부드럽게 파이펫합니다. 하이드로겔 전구체는 점성이 있기 때문에 패턴이 꺼질 가능성이 높기 때문에 주의하십시오. 다층 구조는 최고 무거운 경향이 있고 빠지는 것에 더 취약합니다.
3D 전송 중 조직 변형 하이드로겔 스틱 접촉 각 측정을 사용하여 슬라이드의 소수성 확인
면도날을 사용하여 양쪽 가장자리에 PDMS를 완전히 들어 올려 PBS가 조직 아래에 떠있습니다.
이것은 순수한 콜라겐 하이드로겔로 일어날 수 있습니다 – 하이드로겔의 단백질 농도 또는 조성을 조정하는 것을 고려하십시오
셀은 하이드로겔로 전송되지 않고 슬라이드에 남아 있습니다. 터보 DNAse 농도 증가 또는 인큐베이션 시간 증가
하이드로겔은 충분히 단단하지 않습니다. 문제의 하이드로겔에 대한 배양 시간 및/또는 겔화 메커니즘증가(예: 콜라겐의 경우 pH가 올바른지 확인하십시오).
PDMS를 제거하면 하이드로겔이 눈물을 흘리고 있습니다. 실험을 시작하기 전에 플라즈마 산화를 사용하여 PDMS 유동 세포를 친성적으로 만들어 미디어를 추가하면 쉽게 분리하십시오. PDMS를 분리하기 위해 매우 부드럽게 집게를 사용합니다.

표 1: 이 프로토콜에서 발생할 수 있는 잠재적 오류를 식별하고 해결하기 위한 문제 해결 가이드입니다. 특히, 패턴에 대한 세포의 가난한 접착은 많은 근본 원인을 가질 수 있으며이 가이드는 이러한 문제의 식별 및 해결에 도움이되어야합니다.

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Discussion

본 문서에서는 체외 세포 배양 실험을 위해 2D 및 3D의 세포 고해상도 패터닝을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 이전에 게시 된 버전과는 달리, 여기에 제시 된 프로토콜은 유용성에 초점을 맞추고 : 그것은 고도로 전문화된 장비를 필요로하지 않으며 모든 시약은 사용자 정의 합성을 필요로하는 대신 공급 업체에서 구입할 수 있습니다. 다른 세포 마이크로패턴 방법과 달리, 이 방법은 급속하고 세포형 불가지론이다: 세포외 매트릭스단백질(15)에대한 특정 접착이 필요하지 않다. CMO-DPAC에 의해 패턴화된 세포는 마트리겔 또는 콜라겐과 같은 세포외 매트릭스 내에 내장될 수 있으며, 그 결과 압출 인쇄 기반방법(22)을통해 현재 가능한 것보다 훨씬 더 높은 공간 해상도를 가진 3D 배양의 결과이다. CMO-DPAC를 사용하여 슬라이드당 수백~수천 개의 미세한 피처를 만들 수 있으므로 많은 복제가 동시에 수행될 수 있습니다.

이 프로토콜의 성공에서 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 패턴 슬라이드 위에 있는 유량 셀에 추가된 셀의 밀도입니다. 이상적으로, 밀도는 적어도 2,500만 개의 세포/mL이어야 합니다. 유동 세포에 로드될 때, 세포의 이 조밀도는 패턴(보충 도2B)위에거의 가까운 단층세포의 결과를 낳습니다. 이 높은 세포 밀도는 세포가 DNA 반점의 위에 직접 정착하고 고수할 확률을 최대화합니다. 세포 밀도를 줄이면 전체 패터닝 효율이 저하됩니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 CMO 솔루션을 추가하기 전에 PBS 또는 혈청이 없는 매체의 세포를 철저히 다시 일시 중단하는 것입니다. CMO는 세포막으로 매우 빠르게 분할하고 세포 펠릿에 직접 CMO 용액을 추가하면 세포의 이기종 라벨링이 발생합니다. 세포 현탁액에 CMO 용액을 추가한 후, 세포가 CmOs로 균일하게 표지되도록 파이펫팅을 통해 철저히 혼합하는 것이 중요합니다. 인큐베이션 후, 여러 원심 분리 및 세척 단계를 통해 초과 CMO를 철저히 씻어낼 필요가 있습니다. 세포 현탁액에 존재하는 과도한 자유 CMO는 유리 슬라이드에 패턴아민 변형 DNA에 결합하여 서스펜션에서 CMO 변형 세포의 혼성화 및 접착을 차단합니다. 시간은 또한이 프로토콜에 대 한 주요 고려 사항. CMO를 사용할 때 가능한 한 빨리 작동하고 CMO의 내재화를 최소화하고 세포 생존가능성을 극대화하기 위해 세포를 얼음에 유지하는 것이 중요합니다. 유동 세포측정 실험에 따르면 CMO는 LMO로서 세포 표면에 오래 지속되지 않으며, 2시간 동안얼음(36)에잠입하여 CMO 복합체가 25% 손실되는 것으로 나타났다. 또한 세포 처리 시간이 증가함에 따라 세포의 생존가능성이 감소합니다. 신속하게 작업하고, 얼음에 세포를 유지하고, 얼음차가운 시약을 사용하고, 세럼이 없는 미디어를 사용하여 몇 가지 영양소를 제공함으로써 생존력을 극대화할 수 있습니다.

CMO-DPAC는 높은 정밀도로 세포를 패터닝하여 세포 생물학을 공부하는 강력한 방법이 될 수 있지만, 그 한계가 있습니다. CMO-DPAC 실험은 특히 다중 세포 유형, 층 또는 3D 세포 배양(보충파일 1)으로실험 복잡성이 추가되기 때문에 어려울 수 있다. 표 1에설명된 대로 이 프로토콜을 시작할 때 실험 실패가 일반적일 수 있습니다. 따라서, 우리는 사용자가 품질 관리 검사를 연구소 (DNA가 슬라이드에 존재하는 것을 확인, 세포가 DNA로 충분히 표시되어 있음을 확인 (단계 8), 과잉 세포가 철저하게 세척 된 것을 확인, 등) 실험이 성공하고 추가 최적화를 필요로 할 수있는 단계를 식별하기 위해. 이 원고와 보충 파일에 제공된 정보가 필요한 문제 해결을 용이하게 하는 데 도움이 되기를 바랍니다.

콜레스테롤은 내재화가 세포 대사, 유전자 발현 및 막유동성(37,38)에영향을 미칠 수 있는 생리활성 분자이다. 이전 연구는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 사용하여 CMO 및 LMO 표지 된 세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 비교했습니다. CMO 표지HEK 세포는 표지되지 않은 세포 및 LMO 표지세포(36)에비해 유전자 발현을 변경하였다. CMO를 가진 세포 표지는 콜레스테롤과 스핑크고립드 수송 (GeneCard)에 연결된 AP2B1을 포함하여 표피되지 않은 통제에 상대하는 8개의 유전자의 차분 발현 (> 1.5 배)의 결과및 MALAT1, 콜레스테롤 축적을 조절하는 긴 비코딩 RNA39. 사소한 동안, 이러한 전사 반응은 그럼에도 불구하고 문제의 실험이 물질 대사를 공부하는 경우 우려 될 수 있습니다, 막 역학, 또는 세포에 다른 콜레스테롤 관련 경로.

이 프로토콜은 유연하며 각 실험의 요구를 충족하도록 조정할 수 있습니다. CMO는 어떤 특정 수용체를 사용하는 대신 지질 막내로 삽입하기 때문에, 방법은 세포 형 불가지론 (HUVEC, MCF10A, HEKs 및 MDCKs는 여기에서 입증되었습니다). 콜레스테롤은 이전에 발표된 LMO와 는 다른 소수성 앵커이지만, 우리는 지금까지 유사하게 행동한다는 것을 발견했습니다. 따라서, 우리는 CMO가 이전에 LMO와 함께 간행한 광범위한 세포 모형중 어느 것과도 함께 작동하기를 기대합니다, 신경 줄기 세포, 섬유아세포, 말초 혈액 단핵세포, 종양 세포 및 1 차적인 유방 상피 세포, 및 1 차적인 유방 상피 세포를 포함하 되 이에 국한되지않음,6,23,27,29,36 . CMO 라벨링은 TLR9를 자극하지 않으며, 프로토콜이 면역 세포와 호환된다는 것을 시사합니다. CMO의 멤브레인 편입은 총 세포 크기와 세포글리코릭스(35)의음전하 정도의 기능이다. 따라서, 우리는 신속한 최적화에 적합한 멤브레인 통합의 정도를 테스트하기위한 프로토콜 (8 단계)을 포함했다. 각 셀 패턴의 특정 기능은 필연적으로 실험 설계에 따라 달라집니다 (자세한 지침은 보충 파일 1 참조). DNA를 패터닝하기 위해 위에서 설명한 포토패싱 프로토콜이 권장되지만, 아민-DNA 용액의 액적 물방울을 공간적으로 제한하는 모든 방법이 고해상도 물방울 프린터의 사용과 같이 작동해야 합니다. 패턴 해상도 및 최소 피쳐 간격은 사용되는 방법에 따라 달라집니다. 또한 이론적으로는 이 프로토콜의 DNA-광패판 섹션을 DNA로 표지하는 데 사용되어 온 다른 방법과 결합하여 막 발현 아연손가락(40)에혼성화된 DNA와 같은 DNA와 결합하고, NHS-컨쥬게이트DNA(41)를사용하여, 세포 표면의 아지도 시알산 잔류물을 인색-컨쥬게이트 DNA42로 반응시키는 것이 가능하다. . CMO-DPAC는 세포 사이의 상호 작용에 대한 연구, "발신자"세포에서 "수신기"세포로의 신호 전달을 보는 공동 배양 실험, 줄기 세포 분화에 대한 인근 세포 외 큐의 효과에 대한 조사를 포함하여 세포 간격에 대한 엄격한 제어를 필요로하는 다양한 실험에 적용 될 수 있습니다6,29 . 이 방법은 또한 세포 이동을 3차원으로 연구하는 데 사용할 수 있는 마이크로조직을 만드는 데 사용될 수 있으며, 세포의 자가조직(23,27)및 세포와 ECM(27) 간의 동적 상호작용을 생성할 수있다. 우리는 이 프로토콜이 연구원들에게 자신의 실험실에서 고해상도 DNA 기반 세포 패터닝의 새로운 응용 프로그램을 탐구할 수 있는 접근 가능한 플랫폼을 제공할 수 있기를 바랍니다.

Disclosures

Z.J.G.는 프로방스 바이오사이언스의 고문이자 지분 보유자입니다.

Acknowledgments

저자는 UCSF 생물 의학 마이크로 및 나노 기술 코어에서 장비에 대한 교육을 제공 에 대한이 프로토콜과 부샨 하르비카르를 테스트 제레미 가르시아에게 감사드립니다. 이 연구는 국방부 유방암 연구 프로그램 (W81XWH-10-1-1-1023 및 W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A, NSF(MCB130864), UCSF 센터(DBI-154) 및 UCSF 센터(DBI-159) O.J.S는 NSF 대학원 연구 펠로우십, 시벨 장학금, P.E.O. 장학금의 지원을 받았습니다. Z.J.G와 A.R.A.는 찬 주커버그 바이오허브 조사관입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155379
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread ThorLabs SM3A1
Aldehyde Functionalized Slides Schott Nexterion Slide AL Store under dry conditions after opening.
All Plastic Syringes, 1 mL Fisher Scientific 14-817-25
Amine-Modified DNA Oligo IDT n/a See Supplemental File 1 for suggested sequences.
Aspheric Condenser Lens ThorLabs ACL7560 
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick  Chemglass CG-1906-23
Cell Culture Dishes 60x15 mm style Corning 353002
Cholesterol-Modified Oligo IDT n/a See Supplemental File 1 for suggested sequences.
Diamond Scribe Excelta 475B
DNA Oligonucleotide IDT n/a See Supplemental File 1 for suggested sequences.
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190250
Isopropyl Alcohol Sigma-Aldrich 278475
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) Fisher Scientific D37-4
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a
Microposit S1813 Positive Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel  ThorLabs SM3V10
Oven Thermo Scientific 51-028-112H
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System Plasma Etch PE-50
Photomask (custom) CAD/Art Services n/a Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns.
Razor Blades Fisher Scientific 12-640
RCT Basic Hot Plate IKA 3810001
Silicon Wafer (100 mm) University Wafer 590
Sodium Borohydride, 98%, granules Acros Organics 419471000
Spin Coater Kit Instras SCK-200 This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice.
SU-8 2075 Microchem Y111074 0500L1GL
SU-8 Developer Microchem Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow 2646340
Syringe Needles Sigma-Aldrich Z192341
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current ThorLabs LEDD1B
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane Gelest SIT8170.0
Triethylamine Sigma-Aldrich 90335
Turbo DNase Thermo Fisher Scientific AM2238
Tweezers Style N7 VWR 100488-324 The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues.
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) ThorLabs M365L2
Wafer Tweezers Agar Scientific T5063
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator Millipore Sigma W365885

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References

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