यह प्रोटोकॉल फिब्रिन क्लॉट्स का उपयोग करके नमूना स्थिरीकरण के अनुप्रयोगों का वर्णन करता है, बहती को सीमित करता है, और लाइव इमेजिंग के दौरान रीएजेंट्स के अलावा और वॉशआउट की अनुमति देता है। नमूनों को एक कवरस्लिप की सतह पर संस्कृति माध्यम युक्त फिब्रिनोजेन की एक बूंद में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिसके बाद थ्रोम्बिन जोड़कर पॉलीमराइजेशन को प्रेरित किया जाता है।
ड्रोसोफिला जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है। फ्लाई के विभिन्न विकासात्मक चरणों जैसे कल्पनीय डिस्क, वयस्क महिलाओं या वयस्क आंत के लार्वा मस्तिष्क या अंडे के कक्षों से विभिन्न अंगों और ऊतकों को निकाला जा सकता है और समय-चूक माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है, जो कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यहां, हम ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग के विच्छेदन के लिए अपने वर्तमान प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं, और फिर फिब्रिन थक्के का उपयोग करके ग्लास कवरलिप पर लार्वा दिमाग और अन्य ऊतकों को स्थिर और उन्मुख करने के लिए हमारे वर्तमान दृष्टिकोण को पेश करते हैं। इस स्थिरीकरण विधि को केवल संस्कृति माध्यम में फिब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन के अलावा की आवश्यकता होती है। यह एक ही संस्कृति पकवान में कई नमूनों के उल्टे माइक्रोस्कोप पर उच्च संकल्प समय चूक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, बहु बिंदु पर जाकर माइक्रोस्कोपी में माइक्रोस्कोप चरण के आंदोलनों के कारण अक्सर पार्श्व बहती को कम करता है और इमेजिंग के दौरान रिएजेंट्स के अलावा और हटाने के लिए अनुमति देता है। हम कस्टम-निर्मित मैक्रो भी पेश करते हैं जिनका उपयोग हम नियमित रूप से बहती के लिए सही करने और समय-चूक विश्लेषण से विशिष्ट मात्रात्मक जानकारी निकालने और संसाधित करने के लिए करते हैं।
ड्रोसोफिला जैविक प्रश्नों की एक विशाल श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली बनी हुई है और दशकों से कई विषयों में ज्ञान को आगे बढ़ाने में उत्कृष्ट प्रदर्शन किया है । एक विशेषता जो इसे विशेष रूप से खड़ा करती है वह यह है कि यह लाइव इमेजिंग के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है। उपकोशिकीय प्रक्रियाओं या वास्तविक समय में कोशिकाओं और ऊतकों के व्यवहार की निगरानी करने की क्षमता कोशिका और विकासात्मक जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक प्रमुख अवधारणाओं को उत्पन्न करने में योगदान देती रहती है। नमूने और फ्लोरोसेंट अणुओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस तरह के ड्रोसोफिला नमूनों को जीवित और स्वस्थ बनाए रखने के लिए विभिन्न समूहों द्वारा कई सफल प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। मक्खी से अंग और ऊतक जैसे कल्पनात्मक डिस्क1,2,लार्वा मस्तिष्क3,4,5,6,या वयस्क महिलाओं के अंडे के कक्ष7,8,9,या वयस्क आंत10 उदाहरण के लिए निकाला जा सकता है और समय-चूक माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है। लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रमुख चुनौती यह सुनिश्चित करना है कि नमूना को नमूना अखंडता से समझौता किए बिना इष्टतम संकल्प और स्थिर के लिए इमेजिंग सतह के करीब रखा जाए जो यांत्रिक प्रभावों के प्रति संवेदनशील हो सकता है। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क में न्यूरोब्लास्ट या न्यूरॉन्स नामक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, नमूनों को इमेजिंग सतह के करीब रखने से उन्हें सीलकिए गए इमेजिंग कक्षों11, 12,13में संस्कृति मीडिया के साथ कवर करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण आसानी से मीडिया एक्सचेंज की अनुमति नहीं देता है इस प्रकार पैंतरेबाज़ी के लिए प्रयोगात्मक कमरे को सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को तैयार किया जा सकता है और कोशिकाओं के आसंजन को बढ़ाने के लिए इलाज किए गए कवरस्लिप पर रखा जा सकता है और खुले संस्कृति व्यंजनों में बहु-बिंदु पर जाकर माइक्रोस्कोपी और विस्तारित लाइव-सेल इमेजिंग की अनुमति देता है, जो संभावित रूप से मीडिया एक्सचेंज की अनुमति देता है, लेकिन मीडिया एक्सचेंज14,15के दौरान नमूना बहाव या नुकसान को रोकने के लिए आसान साधन प्रदान नहीं करता है।
फिब्रिन क्लॉट विधि मूल रूप से जीवित क्रेन-फ्लाई शुक्राणुओं16 में मेयोसिस का अध्ययन करने के लिए विकसित की गई है जो इन समस्याओं को दूर करने के लिए विशेष रूप से अनुकूल है। फिब्रिनोजेन को प्रासंगिक संस्कृति माध्यम में भंग कर दिया जाता है, थ्रोम्बिन को जोड़ने से पहले पर्याप्त ग्लास-सतह इमेजिंग कक्ष पर इस समाधान की एक बूंद में रखे गए और उन्मुख नमूने, जिसके परिणामस्वरूप एक अघुलनशील फिब्रिन क्लॉट का तेजी से गठन होता है, एक चिपचिपा रेशेदार जाल जो संस्कृति माध्यम तक नमूने की पहुंच सुनिश्चित करते हुए कांच की सतह और नमूनों का पालन करता है। इसके बाद क्लॉट या सैंपल पोजिशन को परेशान किए बिना मीडियम का आदान-प्रदान किया जा सकता है । इमेजिंग के दौरान संस्कृति मध्यम विनिमय, उदाहरण के लिए, वांछनीय है जब अवरोधकों को मूल विधि के रूप में या धोने या पल्स चेस प्रयोगों के लिए जोड़ा जाना है या जब कोशिकाओं और ऊतकों को रखते हुए लाइव सेल इमेजिंग के दौरान फ्लोरोसेंट रंगों को जोड़ा जाना है। फिब्रिन के थक्के ड्रोसोफिला ऊतकों के साथ – साथ13,17की अलग – अलग कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं । फिब्रिन के थक्के का उपयोग नमूनों को उन्मुख करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है, कि उनके आकार या अन्य गुणों के कारण आम तौर पर फिब्रिन क्लॉट के भीतर नमूना स्थिति और थक्के के आकार को जोड़कर वांछित तरीके से उन्मुख नहीं किया जाएगा।
यहां हम अपने वर्तमान फिब्रिन क्लॉट-आधारित इमेजिंग विधियों पर एक अपडेट प्रदान करते हैं और विभाजन-आधारित छवि विश्लेषण के लिए उपकरण प्रदान करते हैं और विकासशील फ्लाई मस्तिष्क में न्यूरोब्लास्ट डिवीजनों का अध्ययन करने के लिए इस विधि के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हम नियमित रूप से एक ही संस्कृति पकवान में विभिन्न थक्के में कई नमूनों का पालन करने के लिए Fibrin थक्का विधि का उपयोग करें। यह मैं) सेंट्रोसोम व्यवहार या एमआरएनए स्थानीयकरण लाइव18,19,ii जैसे उपकोशिकीय घटनाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है) बहु-बिंदु यात्रा का उपयोग करके एक ही इमेजिंग सेटिंग्स के तहत विभिन्न जीनोटाइप के औषधीय उपचार पर नमूनों के व्यवहार की निगरानी करता है माइक्रोस्कोपी 20 , iii) एंजाइमों21और iv के तीव्र अवरोध के प्रभावों का अध्ययन) लक्षित लेजर-एब्लेशन22 पर अपने शारीरिक वातावरण के भीतर कोशिकाओं के कोशिका विभाजन के अभिविन्यास में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए बहती को कम करने . जबकि थ्रोम्बिन और फिब्रिनोजेन और फिब्रिन क्लॉट के अवांछित प्रभावों को प्रत्येक नमूने के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण करने की आवश्यकता है, यह विधि किसी भी प्रकार के नमूने को स्थिर करने के लिए उपयुक्त है जिसका विश्लेषण लाइव सेल इमेजिंग द्वारा किया जाना है और ड्रोसोफिला में न्यूरोब्लास्ट जीव विज्ञान5,19, 2के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गयाहै।0, लेकिन यह भी महिला रोगाणु रेखा स्टेम सेल23 के साइटोसेन्सर अनुमानों की गतिशीलता और ड्रोसोफिला महिला अंडे कक्षों की कूप कोशिकाओं के तीव्र aPKC निषेध पर ध्रुवता में परिवर्तन21.
समय-चूक फ्लोरोसेंट इमेजिंग के परिणामस्वरूप जटिल समय-हल किए गए 3डी डेटा सेट की पीढ़ी में परिणाम होता है जिसके लिए इस मात्रात्मक जानकारी को निकालने के तरीकों की आवश्यकता होती है। यहां हम ImageJ-आधारित24 मैक्रो के हमारे आगे के विकास का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग हाइपरस्टैक और कस्टम-निर्मित इमेजजे मैक्रो में बहती के लिए सही करने के लिए किया जा सकता है जो ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग या प्राथमिक सेल संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरोब्लास्ट के न्यूरोब्लास्ट में कॉर्टिकल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित सेल कॉर्टेक्स में बहु-चैनल फ्लोरेसेंस के अर्ध-स्वचालित मात्राकरण की अनुमति देता है।
पूरे माउंट डी मेलनोगास्टर लार्वा दिमाग की लाइव इमेजिंग एक शारीरिक संदर्भ के करीब स्थितियों में असममित तंत्रिका स्टेम सेल डिवीजनों का निरीक्षण करने का अवसर प्रदान करता है। हमारे प्रोटोकॉल का पहला हिस्सा लार्वा दिमाग के विच्छेदन पर हमारे दृष्टिकोण का परिचय देता है। जैसा कि पहले ही13कहा गया है, तैयारी का एक महत्वपूर्ण पहलू मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने से बचना है। इसका सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू मस्तिष्क पर जरूरत से ज्यादा खींचने के बिना पड़ोसी कल्पनाशील डिस्क से मस्तिष्क को अलग करना है। “पुलिंग के बिना काटने” के लिए हमारा दृष्टिकोण या तो संदंश की एक जोड़ी के सुझावों के साथ एक पीसने आंदोलन प्रदर्शन करने के लिए है, या दो अंय संदंश ऊतकों के बीच संबंध पकड़े सुझावों के साथ एक संदंश युक्तियां स्लाइड करने के लिए है(चित्रा 1A)जबकि Lerit एट अल वर्णन एक विच्छेदन पिन के साथ देखा की तरह आंदोलनों की तरह । हम प्रयोगकर्ता को सभी दृष्टिकोणों को आजमाने और अपने लिए सबसे उपयुक्त व्यक्ति को अपनाने की सलाह देते हैं। हम अलग दिमाग को स्थानांतरित करने के लिए विच्छेदन उपकरणों के बजाय बीएसए-या एफसीएस-लेपित पिपेट युक्तियों का उपयोग करने का भी सुझाव देते हैं। कोटिंग ऊतकों को प्लास्टिक से चिपके रहने से रोकता है और ऊतकों के सुरक्षित हस्तांतरण की अनुमति देता है, जबकि उन्हें हमेशा पूरी तरह से डुबोया जाता है, उन्हें संभावित क्षणिक विकृति के अधीन किए बिना क्योंकि वे हस्तांतरण के दौरान विच्छेदन उपकरण से चिपके रहते हैं। लेपित युक्तियों में एक बार में कई दिमाग के हस्तांतरण की अनुमति देने के लिए अन्य फायदे होते हैं, जो विशेष रूप से उपयोगी होता है जब यह किसी विशेष माध्यम के भीतर नमूनों के निवास समय को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण होता है; वे अन्य ऊतकों के हस्तांतरण के लिए उपयुक्त हैं, यहां तक कि नाजुक लोगों के रूप में, उदाहरण के लिए, वसा शरीर; वे बड़े सुझावों का उपयोग करके या टिप के चरम को काटकर विभिन्न नमूना आकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को समायोजित कर सकते हैं।
इसके बाद, यह प्रोटोकॉल एक संस्कृति पकवान के कवरस्लिप पर लार्वा दिमाग को स्थिर करने के लिए फिब्रिनोजेन क्लॉटिंग के उपयोग का वर्णन करता है। एक मस्तिष्क संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजेन की एक बूंद के भीतर उन्मुख होता है, जिसके बाद क्लॉटिंग थ्रोम्बिन के अलावा प्रेरित होता है। फिब्रिन गठन क्रमिक है, एक समय खिड़की प्रदान करता है जिसके दौरान नमूने के अभिविन्यास को ठीक-ठाक किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो(चित्रा 2 सी)। यदि नमूने के एक मामूली संपीड़न की आवश्यकता है – जिसे हम लार्वा दिमाग के मामले में सलाह देते हैं – इसे चरण 3.4.4 और 3.5.2 के दौरान नमूने के अधिक या कम बंद थक्के को दबाकर भी बारीक समायोजित किया जा सकता है। Lerit et al., जिसमें दिमाग एक गैस पारगम्य झिल्ली और एक कवरस्लिप के बीच मुहिम शुरू कर रहे हैं में वर्णित प्रोटोकॉल पर इस Fibrinogen थक्के का मुख्य लाभ, लाइव इमेजिंग के दौरान संस्कृति माध्यम को बदलने की क्षमता है । हमारे प्रोटोकॉल पर गैस पारमने योग्य झिल्ली का उपयोग करने का एक संभावित लाभ यह हो सकता है कि यह नमूनों का इष्टतम ऑक्सीजन प्रदान करता है, जो हमारे दृष्टिकोण के साथ अधिक सीमित हो सकता है क्योंकि दिमाग को थक्के और कुछ माध्यमों से हवा से अलग किया जाता है। इस कारण से, हालांकि हम संस्कृति पकवान के भीतर संस्कृति माध्यम की मात्रा के प्रभाव का आकलन नहीं किया, हम थक्के के शीर्ष पर संस्कृति माध्यम की मात्रा सीमित सुझाव है, जबकि थक्के पूरी तरह से डूबे रखते हुए ।
चूंकि थक्के का हेरफेर प्रयोगात्मक रूप से कठिन और समय लेने वाला हो सकता है, इसलिए हम अनुशंसा करते हैं कि प्रयोगकर्ता पहले नमूनों के बिना थक्के में हेरफेर करने का अभ्यास करे। कवर्लिक पर संस्कृति माध्यम + फिब्रिनोजन की बूंद की मात्रा को मॉडुलन करना, फिब्रिनोजेन की एकाग्रता या थ्रोम्बिन की मात्रा और एकाग्रता तैयारी को आसान बनाने में मदद कर सकती है और प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के ऊतकों में अनुकूल बनाते समय महत्वपूर्ण हो सकती है। थक्के में हेरफेर करने के पर्याप्त अनुभव के साथ, यदि आवश्यक हो तो एक थक्के में कई दिमाग को स्थिर किया जा सकता है, हालांकि यह अभिविन्यास की ठीक ट्यूनिंग को जटिल बनाता है। कई थक्के कवरस्लिप पर बनाए जा सकते हैं, उदाहरण के लिए, विभिन्न जीनोटाइप के नमूनों की छवि के लिए अनुमति देते हैं। विभिन्न संस्कृति मीडिया के लिए एक ही कवर्लिप पर विभिन्न थक्के का पर्दाफाश करना भी संभव है, हालांकि विभिन्न थक्के को कवर करने वाले संस्कृति माध्यम की बूंदों को मिलाने के लिए कभी भी देखभाल नहीं की जानी चाहिए। एक बार लार्वा दिमाग स्थिर और लाइव इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं, हम अत्यधिक फोटोडैमेज से बचने के लिए Lerit एट अल की सिफारिशों का पालनकरने की सलाह देते हैं । हम केवल इन सिफारिशों को जोड़ने के लिए न केवल एक मंच इनक्यूबेटर के साथ लाइव इमेजिंग के दौरान 25 डिग्री सेल्सियस पर दिमाग को बनाए रखने के लिए, लेकिन यह भी इमेजिंग की शुरुआत से पहले कम से 30 मिनट के लिए इस चरण को पहले से गरम करने के लिए । हमारे हाथ में, ऐसा करने में नाकाम रहने के लिए व्यवस्थित रूप से एक मजबूत ध्यान बहाव में परिणाम है ।
लाइव इमेजिंग के बाद सहसंबद्ध माइक्रोस्कोपी और फिक्स और इम्यूनोदाता को एक नमूना करने में सक्षम होने के लिए कुछ संदर्भों में यह लाभप्रद हो सकता है। हालांकि, फिब्रिन थक्के का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि मस्तिष्क को हानिकारक हुए बिना मस्तिष्क को थक्के से अलग करना लगभग असंभव है। इस सीमा को दूर करने का एक संभावित तरीका प्लास्मिन के साथ फिब्रिन के थक्के को नीचा दिखाने के तरीकों को विकसित करना या फाइब्रिन बहुलीकरण28की अनुमति देने वाले घुंडी की नकल करने वाले पेप्टाइड के अलावा थक्का अलग करने के तरीकों को विकसित करना हो सकता है। हम आम तौर पर एकल कोशिकाओं से लेकर 200 माइक्रोन लंबे ऊतकों तक के नमूनों पर फिब्रिन के थक्के का उपयोग करते हैं, लेकिन हम 3 मिमी से अधिक वयस्क बम्बेबी से थक्के और छवि दिमाग में भी सफलतापूर्वक स्थिर कर सकते हैं। नमूने के आकार की ऊपरी सीमा जिसे थक्के में स्थिर किया जा सकता है, निर्धारित किया जाना बाकी है। इसी तरह, यद्यपि हम आमतौर पर 4 से 5 घंटे के लिए स्थिर नमूनों की छवि रखते हैं, हमने प्राथमिक संस्कृति में न्यूरोब्लास्ट को 3 दिनों तक सफलतापूर्वक इमेज किया, यह दर्शाता है कि थक्का कम से कम दीर्घकालिक व्यवहार्यता में हस्तक्षेप नहीं करता है। इसके विपरीत, थक्के इस उद्देश्य के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप जैसे उपकरणों की आवश्यकता के बिना माध्यम के नियमित प्रतिस्थापन, लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए एक आवश्यकता की सुविधा दे सकते हैं। जबकि हमने फाइब्रिन थक्के के पारमेबिलिटी मापदंडों को मापा नहीं है, थक्के की रेशेदार जेल जैसी प्रकृति कोशिका पारमग्न अणुओं द्वारा पेनेट्रेबल प्रतीत होती है। हमने पाया कि लैटरुकुलिन ए, कोलसेमिड या 1-एनएपी1, हेलो-टैग लिगांड और सेल बायोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले अन्य मानक रंग बिना किसी समस्या के फाइब्रिन क्लॉट में कोशिकाओं तक पहुंचते हैं और अब तक उन अणुओं का सामना नहीं करते हैं जिन्हें थक्के द्वारा बनाए रखा जाएगा, जो हालांकि, एक संभावना है कि अनुभवजन्य परीक्षण की आवश्यकता है।
अंत में, फिब्रिन थक्के का उपयोग करके लाइव इमेजिंग के लिए जीवित ऊतकों को स्थिर करने का एक तरीका लागू करने के लिए एक विश्वसनीय और अपेक्षाकृत आसान प्रदान करते हैं। पार्श्व बहती सीमित करने में अपनी उपयोगिता से परे, लाइव इमेजिंग के दौरान संस्कृति माध्यम को बदलने की क्षमता डी मेलनोगोस्टर न्यूरोब्लास्ट्स21के असममित कोशिका विभाजन का अध्ययन करने के लिए हमारे रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण के लिए अमूल्य साबित हुई है। हम आशा करते हैं कि यह तकनीक विभिन्न ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में अध्ययन के लिए फायदेमंद होगी, खासकर यदि वे रासायनिक आनुवंशिकी को शामिल करते हैं या उदाहरण के लिए, प्रोटीन सेल्फ लेबलिंग29।
हमारा मल्टीहाइपरस्टैकरेग मैक्रो टर्बोरेग इमेजजे प्लगइन पर निर्भर करता है, जो स्टैक के लगातार फ्रेम या स्लाइस को संरेखित करता है, और मल्टीस्टैकरेग इमेजजे प्लगइन, जो अन्य स्टैक पर परिवर्तनों को लागू करने की अनुमति देता है। मल्टीहाइपरस्टैकरेग बस इन परिवर्तनों को हाइपरस्टैक (कम से कम चार आयामों के साथ ढेर) पर लागू करने की अनुमति देता है। जैसा कि हम इसका वर्णन करते हैं, मल्टीहाइपर्सस्टक्रेग के उपयोग के लिए बहुत सारे कार्यों की आवश्यकता होती है और काफी समय लगता है, हमने ऑटोहाइपर्सस्टैकरेग मैक्रो भी लिखा, जो स्वचालित रूप से चरण 6.2 और 6.3 में वर्णित सभी चरणों को करता है। हालांकि, मल्टीहाइपरस्कैक्रेग के विपरीत, ऑटोहाइपरस्कैकरीग में वर्तमान में इस स्टैक के उपक्षेत्र के आधार पर स्टैक के संरेखण की गणना करने की संभावना का अभाव है, एक विकल्प जो हमने पाया है वह कभी-कभी एक संतोषजनक संरेखण के लिए महत्वपूर्ण होता है। ऑटोहाइपर्सस्टक्रेग की एक और सीमा यह है कि इसका उपयोग अनुवादों तक सीमित है न कि टर्बोरेग और मल्टीस्टैकरीग द्वारा प्रस्तावित अन्य परिवर्तनों, जबकि मल्टीहाइपरस्टैक रेग किसी भी परिवर्तन प्रकार पर लागू हो सकता है उपयोगकर्ता को इसकी आवश्यकता होनी चाहिए। भविष्य की रिलीज इन कार्यों को लागू करेगी और गिटहब30पर उपलब्ध होगी। अंत में, हमारे घूर्णन लाइनस्कैन मैक्रो समय चूक में कॉर्टिकल संकेतों को जल्दी से मापने का एक आसान तरीका प्रदान करता है, भले ही कॉर्टेक्स समय के साथ अपनी स्थिति या अभिविन्यास को बदलता है। चाहे इसका ट्रैकिंग मोड या इसका गैर-ट्रैकिंग मोड विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त है, कॉर्टिकल सिग्नल की गुणवत्ता और स्थिरता पर निर्भर करता है। ट्रैकिंग मोड का उपयोग करना आसान है क्योंकि उपयोगकर्ता को इस बात पर विचार करने की आवश्यकता नहीं है कि कॉर्टेक्स हर समय बिंदु के लिए कहां होगा और समय के साथ स्थिति और अभिविन्यास के बड़े बदलावों को समायोजित कर सकता है। हालांकि, यह केवल उपयुक्त है अगर कॉर्टिकल सिग्नल पूरी फिल्म के दौरान पता लगाने के लिए काफी मजबूत रहता है: कॉर्टेक्स (उदाहरण के लिए, कॉर्टेक्स के करीब एक उज्ज्वल साइटोप्लाज्मिक डिब्बे) से कुछ और का पता लगाने में विफलता हर निम्नलिखित टाइमपॉइंट के लिए पता लगाने से समझौता कर सकती है (उदाहरण के लिए, साइटोप्लाज्मिक डिब्बे कॉर्टेक्स से दूर चले जाते हैं और कॉर्टिकल लाइन्स बाकी समय चूक के लिए इसका पालन करते हैं)। गैर-ट्रैकिंग मोड में यह नुकसान नहीं होता है क्योंकि पता लगाने की मूल रूप से उपयोगकर्ता द्वारा खींची गई रेखा तक सीमित है (उदाहरण के लिए, एक उज्ज्वल साइटोप्लाज्मिक डिब्बे का पता लगाने के लिए कुछ समय बिंदुओं के लिए विफल हो सकता है, लेकिन जैसे साइटोप्लाज्मिक डिब्बा डिटेक्शन जोन से दूर चला जाता है, कॉर्टेक्स का उचित पता लगाना शुरू होता है), लेकिन अगर कॉर्टेक्स स्थिति या अभिविन्यास समय के साथ बहुत कुछ बदलता है तो अच्छा व्यवहार नहीं करता है। ट्रैकिंग मोड के लिए विकसित की जाने वाली अगली सुविधा (जो गिटहब30पर उपलब्ध होगी) केवल निर्दिष्ट टाइमपॉइंट का विश्लेषण करने और पहले समय बिंदु के बजाय एक संदर्भ समय बिंदु को परिभाषित करने का विकल्प होगा, जिसके बाद पता लगाया जाएगा, जो उपयोगकर्ता को कम से कम समस्याग्रस्त टाइमपॉइंट से बचने की अनुमति देगा।
The authors have nothing to disclose.
Januschke प्रयोगशाला में काम वेलकम ट्रस्ट अनुदान 100031/Z/12/A और 1000032/Z/12/A द्वारा समर्थित है । टिश्यू इमेजिंग सुविधा वेलकम से अनुदान WT101468 द्वारा समर्थित है।
Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |