Detta protokoll beskriver tillämpningar av prov immobilisering med fibrin blodproppar, begränsa drifting och tillåta tillägg och washout av reagenser under levande imaging. Prover överförs till en droppe Fibrinogen som innehåller odlingsmedium på ytan av ett täckglas, varefter polymerisation induceras genom tillsats av trombin.
Drosophila är ett viktigt modellsystem för att studera ett brett spektrum av biologiska frågor. Olika organ och vävnader från olika utvecklingsstadier i flugan såsom imaginala skivor, larvhjärnan eller äggkamrarna hos vuxna honor eller den vuxna tarmen kan extraheras och hållas i kultur för avbildning med timelapsemikroskopi, vilket ger värdefulla insikter i cell- och utvecklingsbiologi. Här beskriver vi i detalj vårt nuvarande protokoll för dissekering av Drosophila larv hjärnor, och sedan presentera vår nuvarande strategi för immobilisering och orientering larv hjärnor och andra vävnader på ett glaslock med Fibrin blodproppar. Denna immobiliseringsmetod kräver endast tillsats av Fibrinogen och trombin till odlingsmediet. Den är lämplig för högupplöst tidsfördröjningsavbildning på inverterade mikroskop av flera prover i samma odlingsskål, minimerar sidodriften som ofta orsakas av rörelser i mikroskopstadiet i flerpunktsbesökande mikroskopi och möjliggör tillsats och avlägsnande av reagenser under avbildningen. Vi presenterar också skräddarsydda makron som vi rutinmässigt använder för att korrigera för drifting och för att extrahera och bearbeta specifik kvantitativ information från timelapse-analys.
Drosophila fortsätter att vara ett viktigt modellsystem för att studera ett brett spektrum av biologiska frågor och har utmärkt sig för att främja kunskap inom många discipliner i årtionden. En funktion som gör att den sticker ut är att den är särskilt väl lämpad för live-avbildning. Förmågan att övervaka subcellulära processer eller beteendet hos celler och vävnader i realtid fortsätter att bidra till att generera nyckelbegrepp som är relevanta för cell- och utvecklingsbiologi. Många framgångsrika protokoll har utvecklats av olika grupper för att upprätthålla sådana Drosophila-prover levande och friska för att studera beteendet hos provet och fluorescerande molekyler lever. Organ och vävnader från flugan som imaginala skivor1,2,larvhjärnan3,4,5,6eller äggkammare av vuxna kvinnor7,8,9, eller den vuxnatarmen 10 till exempel kan extraheras och hållas i kultur för avbildning med time-lapse mikroskopi. En viktig utmaning för levande avbildning är att säkerställa att provet hålls nära bildytan för optimal upplösning och orörlig utan att äventyra provintegriteten som kan vara känslig för mekaniska stötar. Att studera neurala stamceller, så kallade neuroblaster eller nervceller i Drosophila larvhjärnan, till exempel, att hålla prover nära avbildningsytan kan uppnås genom att täcka dem med odlingsmedia i förseglade bildkammare11,12,13. Detta tillvägagångssätt tillåter dock inte lätt medieutbyte, vilket begränsar experimentellt manöverutrymme. Alternativt kan prover beredas och placeras på täckglas som behandlas för att öka vidhäftningen av celler och tillåta flerpunktsbesökande mikroskopi och utökad livecellavbildning i öppna odlingsrätter, som potentiellt möjliggör medieutbyte, men inte ger enkla medel för att förhindra provdrift eller förlust under medieutbyte14,15.
Fibrin clot-metoden som ursprungligen utvecklades för att studera meios i levande kranfluga spermatocyter16 är speciellt lämpad för att övervinna dessa problem. Fibrinogen löses upp i relevant odlingsmedium, proverna placeras och orienteras i en droppe av denna lösning på en tillräcklig glasyta avbildningskammare innan trombin tillsätts, vilket resulterar i snabb bildning av en olöslig Fibrin blodpropp, ett klibbigt fibröst nät som klibbar på glasytan och proverna samtidigt som provets tillgång till odlingsmediet säkerställs. Mediet kan sedan bytas ut utan att proppen eller provpositionen störs. Kulturmediumutbyte vid avbildning är till exempel önskvärt när inhibitorer ska tillsättas som i den ursprungliga metoden eller för att tvätta ut eller pulsera jaktförsök eller när fluorescerande färgämnen ska tillsättas under levande cellavbildning samtidigt som celler och vävnader finns på plats. Fibrin blodproppar är lämpliga för avbildning av Drosophila vävnader samt enskilda celler13,17. Fibrinproppar kan vidare användas för att hjälpa orientera prover, att på grund av deras form eller andra egenskaper normalt inte skulle vara orienterade på önskat sätt genom att modulera provpositionen inom Fibrin-proppen och formen på själva proppen.
Här ger vi en uppdatering om våra nuvarande Fibrin proppbaserade bildmetoder och tillhandahåller verktyg för segmenteringsbaserad bildanalys och fokuserar på användningen av denna metod för att studera neuroblastavdelningar i den utvecklande flughjärnan. Vi använder rutinmässigt Fibrin clot-metoden för att följa flera prover i olika blodproppar i samma odlingsfat. Detta möjliggör i) avbildning av subcellulära händelser som centrrosombeteende eller mRNA-lokalisering live18,19, ii) övervakning av beteendet hos prover vid farmakologisk behandling av olika genotyper under samma avbildningsinställningar med hjälp av flerpunktsbesök mikroskopi20, iii) studera effekterna av akut hämning avenzymer 21 och iv) minimera drifting för att studera förändringar i orienteringen av celldelning av celler i deras fysiologiska miljö vid riktad laserablation22. Medan oönskade effekter av trombin och fibrinogen och fibrinproppen måste testas empiriskt för varje prov, Denna metod är i princip lämplig för att immobilisera alla typer av prov som ska analyseras genom levande cellavbildning och i Drosophila har framgångsrikt använts för att studera flera aspekter av neuroblastbiologi5,19,20, men också dynamiken i cytosensorprojektioner av kvinnliga könslinjestamceller23 och förändringar i polaritet vid akut aPKC-hämning av follikelceller i Drosophila kvinnliga äggkammare21.
Tidsfördröjning fluorescerande avbildning resulterar i generering av komplexa tids lösta 3D-data uppsättningar som kräver metoder för att extrahera denna kvantitativa information. Här beskriver vi vår vidareutveckling av ImageJ-baserade24 makron som kan användas för att korrigera för drifting i hyperstacks och skräddarsydda ImageJ-makron som möjliggör halvautomatisk kvantifiering av flerkanals fluorescens vid cellbarken utvecklad för att kvantifiera närproteiner i neuroblaster i Drosophila larvhjärnor eller av enskilda neuroblaster i primärcellskulturen.
Levande avbildning av hela berget D. melanogaster larval hjärnor ger möjlighet att observera asymmetriska neurala stamcellsdelningar under förhållanden nära ett fysiologiskt sammanhang. Den första delen av vårt protokoll introducerar vår strategi för dissekering av larvhjärnor. Som redan sagt13, en kritisk aspekt av preparatet är att undvika att skada hjärnan. Den mest utmanande aspekten av detta är att separera hjärnan från de närliggande imaginala skivorna utan att dra överdrivet på hjärnan. Vårt tillvägagångssätt för att “skära utan att dra” är att utföra antingen en sliprörelse med spetsarna på ett par tångar, eller att skjuta en tångspets längs två andra tångspetsar som håller anslutningen mellanvävnader ( Figur 1A) medan Lerit et al. beskriver sågliknande rörelser med en dissekeringsstift. Vi råder experimenteraren att prova alla tillvägagångssätt och att anta den bäst lämpade för sig själva. Vi föreslår också att du använder BSA- eller FCS-belagda pipettspetsar snarare än dissekeringsverktyg för att överföra isolerade hjärnor. Beläggningen förhindrar att vävnader fastnar på plasten och möjliggör säker överföring av vävnader samtidigt som de alltid håller dem helt nedsänkta, utan att utsätta dem för en eventuell övergående deformation när de håller sig till dissekeringsverktyget under överföringen. Belagda spetsar har andra fördelar för att möjliggöra överföring av flera hjärnor samtidigt, vilket är särskilt användbart när det är viktigt att kontrollera provernas vistelsetid inom ett visst medium; De är lämpliga för överföring av andra vävnader, även bräckliga sådana som till exempel feta kroppar; De kan rymma ett brett utbud av olika provstorlekar genom att använda större spetsar eller skära spetsens extremitet.
Därefter beskriver detta protokoll användningen av Fibrinogen koagulering för att immobilisera larv hjärnor på täcket av en kulturrätt. En hjärna är orienterad inom en droppe kulturmedium + Fibrinogen, varefter koagulering induceras av tillsats av trombin. Fibrinbildningen är gradvis, vilket ger ett tidsfönster under vilket provets orientering vid behov kan finjusteras (figur 2C). Om en liten komprimering av provet krävs – vilket vi avråder från när det gäller larvhjärnor – kan det också finjusteras genom att trycka proppen mer eller mindre nära provet under steg 3.4.4 och 3.5.2. Den största fördelen med denna Fibrinogen koagulering över protokollet som beskrivs i Lerit et al., där hjärnor är monterade mellan ett gasgenomsläppligt membran och ett täckglas, är förmågan att ersätta odlingsmediet under levande avbildning. En möjlig fördel med att använda ett gaspermeabelt membran över vårt protokoll kan vara att det ger en optimal syresättning av proverna, vilket kan vara mer begränsat med vårt tillvägagångssätt eftersom hjärnor separeras från luften av proppen och något medium. Av denna anledning, även om vi inte bedömde effekten av mängden kulturmedium i kulturrätten, föreslår vi att man begränsar mängden odlingsmedium ovanpå blodpropparna samtidigt som blodpropparna är helt nedsänkta.
Eftersom manipuleringen av blodpropparna kan vara experimentellt svår och tidskrävande rekommenderar vi att experimenteraren först övar på att manipulera blodproppar utan prover. Modulering av volymen av droppen av odlingsmedium + Fibrinogen på täckglaset, koncentrationen av Fibrinogen eller volymen och koncentrationen av trombin kan bidra till att göra preparatet enklare och kan vara viktigt när protokollet anpassas till andra typer av vävnader. Med tillräckligt med erfarenhet av att manipulera blodpropparna kan flera hjärnor immobiliseras i en blodpropp om det behövs, även om det komplicerar finjusteringen av orienteringen. Flera blodproppar kan bildas på täckglaset, vilket till exempel gör det möjligt att avbilda prover av olika genotyper. Det är också möjligt att exponera olika blodproppar på samma omslagslip till olika kulturmedier, även om man måste vara försiktig så att man aldrig blandar dropparna av odlingsmedium som täcker de olika blodpropparna. När larv hjärnor är immobiliserade och redo för levande bildbehandling, rekommenderar vi att följa rekommendationerna i Lerit et al.13 för att undvika överdriven fotodamage. Vi lägger bara till dessa rekommendationer för att inte bara upprätthålla hjärnan vid 25 °C under levande avbildning med en sceninkubator, men också för att förvärma detta steg i minst 30 minuter före avbildningens början. I våra händer resulterar underlåtenhet att göra det systematiskt i en stark fokusdrift.
Det kan vara fördelaktigt i vissa sammanhang att kunna utföra korrelerad mikroskopi och fixa och immunostain ett prov efter live imaging. En begränsning av att använda Fibrin blodproppar är dock att det är nästan omöjligt att mekaniskt isolera en hjärna från en blodpropp utan att skada den. Ett möjligt sätt att övervinna denna begränsning kan vara att utveckla metoder för att bryta ner Fibrin blodproppar med Plasmin eller att inducera blodpropp demontering genom att tillsats av en peptid som efterliknar rattarna tillåter Fibrin polymerisation28. Vi använder vanligtvis Fibrin blodproppar på prover som sträcker sig från enstaka celler till 200 μM långa vävnader, men vi kan också framgångsrikt immobilisera i blodproppar och bildhjärnor från vuxna humlebitar över 3 mm breda. Den övre gränsen för provstorleken som kan immobiliseras i blodproppar återstår att bestämma. På samma sätt, även om vi vanligtvis avbildar immobiliserade prover i 4 till 5 h, avbildade vi framgångsrikt neuroblaster i primärkulturen i upp till 3 dagar, vilket indikerar att proppen åtminstone inte stör långsiktig livskraft. Tvärtom kan blodproppar underlätta regelbunden ersättning av mediet, ett krav på långsiktig avbildning, utan behov av enheter som peristaltiska pumpar för detta ändamål. Även om vi inte har mätt permeabilitetsparametrarna för fibrinpropparager, verkar blodproppens fibrösa gelliknande natur vara genomtränglig av cellgenomsläppliga molekyler. Vi fann att Latrunculin A, Colcemid eller 1-NAPP1, HALO-tag ligands och andra standardfärgämnen som används i cellbiologi når cellerna i fibrinproppen utan problem och har hittills inte stött på molekyler som skulle behållas av proppen, vilket dock är en möjlighet som måste empiriskt testas.
Sammanfattningsvis ger användning av Fibrin-blodproppar ett tillförlitligt och relativt enkelt sätt att implementera ett sätt att immobilisera levande vävnader för levande avbildning. Utöver dess användbarhet för att begränsa lateral drifting, har förmågan att ändra kulturmediet under levande avbildning visat sig ovärderlig för vår kemiska genetik strategi för att studera den asymmetriska celldelningen av D. melanogaster neuroblaster21. Vi förväntar oss att denna teknik kommer att vara fördelaktig för studier i ett brett spektrum av olika vävnader, särskilt om de involverar kemisk genetik eller till exempel protein självmärkning29.
Vårt MultiHyperStackReg-makro förlitar sig på TurboReg ImageJ-plugin, som justerar på varandra följande ramar eller segment av en stack, och MultiStackReg ImageJ-plugin, vilket gör det möjligt att tillämpa omvandlingarna på andra staplar. MultiHyperStackReg tillåter helt enkelt att tillämpa dessa omvandlingar på hyperstacks (staplar med minst fyra dimensioner). Eftersom användningen av MultiHyperStackReg, som vi beskriver det, kräver många åtgärder och kan bli ganska tidskrävande, skrev vi också AutoHyperStackReg-makrot, som automatiskt utför alla steg som beskrivs i steg 6.2 och 6.3. Men i motsats till MultiHyperStackReg saknar AutoHyperStackReg för närvarande möjligheten att beräkna justeringen av en stack baserat på en underregion i denna stack, ett alternativ som vi hittade är ibland avgörande för en tillfredsställande justering. En annan begränsning av AutoHyperStackReg är att dess användning är begränsad till översättningar och inte de andra omvandlingar som föreslagits av TurboReg och MultiStackReg, medan MultiHyperStackReg kan tillämpas på en hyperstack vilken omvandlingstyp som helst om användaren behöver det. Framtida utgåvor implementerar dessa funktioner och kommer att finnas tillgängliga på GitHub30. Slutligen ger vårt roterande linescan-makro ett enkelt sätt att snabbt mäta kortikala signaler i tidsförfall, även om cortex ändrar sin position eller orientering över tid. Om dess spårningsläge eller dess icke-spårningsläge är bäst lämpat för analys beror på kvaliteten och konsekvensen hos den kortikala signalen. Spårningsläget är lättare att använda eftersom användaren inte behöver överväga var cortex kommer att vara för varje tidspunkt och kan rymma stora positions- och orienteringsförändringar över tid. Det är dock bara lämpligt om den kortikala signalen förblir tillräckligt stark för detektion under hela filmen: ett misslyckande med att upptäcka något annat än cortex (t.ex. ett ljust cytoplasmiskt fack nära cortex) kan äventyra upptäckten för varje följande tidspunkt (t.ex. rör sig det cytoplasmiska facket bort från cortex och de kortikala linjerna kan följa den under resten av tidsfördröjningen). Icke-spårningsläget har inte denna fallgrop eftersom detektion är begränsat till den linje som ursprungligen drogs av användaren (t.ex. ett ljust cytoplasmiskt fack kan orsaka att detektion misslyckas under några tidspunkter, men när cytoplasmicfacket rör sig bort från detektionszonen återupptas korrekt detektion av cortex), men beter sig inte bra om cortexpositionen eller orienteringen ändras mycket över tiden. Nästa funktion (som kommer att vara tillgänglig på GitHub30) som ska utvecklas för spårningsläget är alternativet att endast analysera angivna tidspunkter och definiera en referenstidpunkt (i stället för den första tidspunkten) innan och varefter identifieringen kommer att utföras, vilket gör det möjligt för användaren att åtminstone undvika problematiska tidspunkter.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i Januschke-laboratoriet stöds av Wellcome trust grants 100031/Z/12/A och 1000032/Z/12/A. Mjukpappersavbildningsanläggningen stöds av bidraget WT101468 från Wellcome.
Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |