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Developmental Biology

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61954
Automatic Translation
1, 1
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

Summary

Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Abstract

Drosophila es un sistema modelo importante para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas. Varios órganos y tejidos de diferentes etapas de desarrollo de la mosca como discos imaginales, las cámaras larvarias del cerebro o del óvulo de las hembras adultas o el intestino adulto se pueden extraer y mantener en cultivo para la toma de imágenes con microscopía de lapso de tiempo, proporcionando información valiosa sobre la biología celular y del desarrollo. Aquí, describimos en detalle nuestro protocolo actual para la disección de los cerebros larvarios de Drosophila, y luego presentamos nuestro enfoque actual para inmovilizar y orientar cerebros larvarios y otros tejidos en un tubo de cubierta de vidrio usando coágulos de Fibrin. Este método de inmovilización sólo requiere la adición de Fibrinógeno y Trombina al medio de cultivo. Es adecuado para imágenes de lapso de tiempo de alta resolución en microscopios invertidos de múltiples muestras en el mismo plato de cultivo, minimiza la deriva lateral con frecuencia causada por los movimientos de la etapa del microscopio en microscopía visitante multipuntos y permite la adición y eliminación de reactivos durante el transcurso de la toma de imágenes. También presentamos macros hechas a medida que usamos rutinariamente para corregir la deriva y extraer y procesar información cuantitativa específica del análisis de lapso de tiempo.

Introduction

Drosophila sigue siendo un importante sistema modelo para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas y ha destacado en el avance del conocimiento en muchas disciplinas durante décadas. Una característica que lo hace particularmente destacado es que es especialmente adecuado para imágenes en vivo. La capacidad de monitorear los procesos subcelulares o el comportamiento de las células y los tejidos en tiempo real sigue contribuyendo a generar conceptos clave relevantes para la biología celular y del desarrollo. Muchos protocolos exitosos han sido desarrollados por diferentes grupos para mantener vivas y saludables estas muestras de Drosophila para estudiar el comportamiento de la muestra y las moléculas fluorescentes. Órganos y tejidos de la mosca como discos imaginales1,2,el cerebro larvario3,4,5,6,o cámaras de huevos de hembras adultas7,8,9,o el intestino adulto10 por ejemplo pueden ser extraídos y mantenidos en cultivo para imágenes con microscopía de lapso de tiempo. Un desafío clave para la toma de imágenes en vivo es asegurar que la muestra se mantenga cerca de la superficie de imágenes para una resolución óptima e inmóvil sin comprometer la integridad de la muestra que puede ser sensible a los impactos mecánicos. Para estudiar las células madre neuronales, llamadas neuroblastos o neuronas en el cerebro larvario de Drosophila, por ejemplo, mantener muestras cerca de la superficie de imágenes se puede lograr cubriéndolas con medios de cultivo en cámaras de imágenes selladas11,12,13. Sin embargo, este enfoque no permite fácilmente el intercambio de medios, lo que limita el margen de maniobra experimental. Alternativamente, las muestras se pueden preparar y colocar en coverslips tratados para aumentar la adherencia de las células y permitir la microscopía de visita multipunto y imágenes extendidas de células vivas en platos de cultivo abierto, que potencialmente permiten el intercambio de medios, pero no proporcionan medios fáciles para prevenir la deriva o pérdida de la muestra durante el intercambio de medios14,15.

El método de coágulo de Fibrin desarrollado originalmente para estudiar la meiosis en espermatozoides vivos de mosca de la grulla16 es específicamente adecuado para superar estos problemas. Fibringen se disuelve en un medio de cultivo relevante, las muestras colocadas y orientadas en una gota de esta solución en una cámara de imágenes de superficie de vidrio adecuada antes de que se agregue trombina, lo que resulta en la rápida formación de un coágulo de fibrina insoluble, una malla fibrosa pegajosa que se adhiere a la superficie de vidrio y las muestras al tiempo que garantiza el acceso de la muestra al medio de cultivo. A continuación, el medio se puede intercambiar sin perturbar el coágulo o la posición de la muestra. El intercambio medio de cultivo durante la toma de imágenes es, por ejemplo, deseable cuando se deben agregar inhibidores como en el método original o para experimentos de lavado o persecución de pulsos o cuando se añadirán colorantes fluorescentes durante las imágenes celulares vivas mientras se mantienen las células y los tejidos en su lugar. Los coágulos de fibrina son adecuados para la toma de imágenes de tejidos de Drosophila, así como células individuales13,17. Los coágulos de fibrina se pueden utilizar aún más para ayudar a orientar las muestras, que debido a su forma u otras propiedades normalmente no estarían orientados de la manera deseada mediante la modulación de la posición de la muestra dentro del coágulo de Fibrin y la forma del coágulo en sí.

Aquí proporcionamos una actualización sobre nuestros métodos actuales de imágenes basadas en coágulos de Fibrin y proporcionamos herramientas para el análisis de imágenes basado en segmentación y nos centramos en el uso de este método para estudiar las divisiones de neuroblastos en el cerebro mosca en desarrollo. Utilizamos rutinariamente el método de coágulo de Fibrin para seguir múltiples muestras en diferentes coágulos en el mismo plato de cultivo. Esto permite i) imágenes de eventos subcelulares como el comportamiento centroscósmico o la localización de ARNm en vivo18,19, ii) monitoreando el comportamiento de las muestras tras el tratamiento farmacológico de diferentes genotipos bajo la misma configuración de imágenes utilizando visitas multipunto microscopía20, iii) estudiar los efectos de la inhibición aguda de las enzimas21 y iv) minimizando la deriva para estudiar los cambios en la orientación de la división celular de las células dentro de su entorno fisiológico sobre la ablación láser dirigida22. Mientras que los efectos no deseados de trombina y fibrinógeno y el coágulo de Fibrin necesitan ser probados empíricamente para cada muestra, este método es en principio adecuado para inmovilizar cualquier tipo de muestra que deba ser analizada por imágenes de células vivas y en Drosophila se ha utilizado con éxito para estudiar múltiples aspectos de la biología de neuroblastos5,19,20,pero también la dinámica de las proyecciones de citosensores de las células madre de la línea germinal femenina23 y los cambios en la polaridad tras la inhibición aguda de las células folículos de las cámaras de huevos femeninos Drosophila 21.

Las imágenes fluorescentes de lapso de tiempo se traducen en la generación de conjuntos de datos 3D resueltos en el tiempo complejos que requieren métodos para extraer esta información cuantitativa. Aquí describimos nuestro desarrollo adicional de24 macros basadas en ImageJ que se pueden utilizar para corregir la deriva en hiperstacks y macros ImageJ hechas a medida que permiten la cuantificación semiautomática de fluorescencia multicanal en la corteza celular desarrollada para cuantificar proteínas corticales en neuroblastos de cerebros larvarios de Drosophila o de neuroblastos individuales en el cultivo celular primario.

Protocol

1. Preparación de reactivos

NOTA: Todos los pasos de este protocolo a menos que se indique lo contrario se llevan a cabo a temperatura ambiente.

  1. Para preparar una solución de 1x PBS-BSA (0,1% w/v), disolver 1 mg de albúmina sérica bovina (BSA) en 1 ml de PBS. Para preparar una solución de stock de Thrombin 1.000 unidades·mL-1,disolver 1.000 unidades de Trombón en 1 ml de PBS-BSA (0,1% p/v). Hacer coácuotas de 10 μL y almacenar a -20 °C durante un tiempo de hasta 4 meses.
  2. Para preparar el medio de cultivo para los cerebros de Drosophila, disolver 1 g de glucosa en 1 L del medio de Schneider en condiciones estériles. Filtre y almacene a 4 °C durante un tiempo de hasta 3 meses.
  3. Para preparar la solución Fibringen, disolver 10 mg de Fibrinógeno en 1 ml de medio de cultivo durante 20 min a temperatura ambiente o 5 min a 37 °C.
    NOTA: Si se utiliza un medio de cultivo diferente al preparado en el paso 1.2 y ya se forman coágulos de fibrina a este paso, el medio de cultivo probablemente contiene trombina activa, que necesita ser inactivada de antemano. Una fuente probable de trombo es suero bovino fetal, que se puede desactivar calentando el suero a 56 °C durante 30 min.
  4. Para preparar una solución de recubrimiento de PBS-BSA (5% w/v), disolver 50 mg de albúmina sérica bovina (BSA) en 1 ml de 1x PBS.
  5. Para el reactivo de ejemplo utilizado en el paso 4, prepare una solución de stock de 10 mM NAPP1 disolviendo 1 mg de NAPP1 en 315 μL de sulfóxido de dimetil.

2. Disección de cerebros larvarios de Drosophila

NOTA: Realice este paso bajo un binocular de disección.

  1. Utilice un cepillo para transferir larvas L3 a una platillo de vidrio 9-well borosilicate que contenga PBS. Revuelva para separar la mayor parte de los alimentos de mosca de las larvas y transfiéralo a otro medio de cultivo que contenga pozos.
  2. Utilice fórceps (por ejemplo, Dumont #55) para agarrar una larva a través de todo su diámetro, en el medio de su longitud corporal (ver Figura 1A,B). Mientras sostiene la larva, transfiérala a otro pozo de la placa de borosilicato que contiene 200 μL de medio de cultivo fresco.
  3. No libere la larva. Para cortar la larva por la mitad a lo largo de todo su diámetro(Figura 1B),moler el área agarrada con movimiento lateral de las puntas de los fórceps(Figura 1A,panel superior) o deslizar una punta de otro par de fórceps entre las dos puntas de la cep que sostienen la larva(Figura 1A,panel inferior). No corte la larva por la mitad tirando de una de sus extremidades, ya que podría dañar el cerebro tirando de ella a través de los nervios cruzando la longitud del cuerpo (líneas rojas en la Figura 1B).
  4. Utilice fórceps para sujetar la larva por su cutícula y otro par de fórceps para separar la cutícula sin tirar del cerebro(Figura 1C). Repita hasta que los nervios originarios del cerebro sean visibles y se pueda acceder a los órganos que conectan el cerebro con las partes de la boca, como se muestra en la Figura 1D.
  5. Usa fórceps para contener los nervios que se originan en el cerebro. Con el otro par de fórceps, utilice cualquiera de las técnicas mostradas en la Figura 1A para cortar la conexión entre el cerebro a las partes de la boca, separando el cerebro del resto de la cutícula(Figura 1D).
  6. Utilice fórceps para sujetar el cerebro por los axones que salen del cordón nervioso ventral. Arranca los órganos representados en gris en la Figura 1E al alejarlos suavemente del cerebro.
    NOTA: No tire de los discos imaginales del ojo/antena (amarillo oscuro) para separarlos del cerebro. La conexión entre estos tejidos es demasiado robusta para romperse tirando sin dañar el cerebro.
  7. Mientras sigue agarrando los nervios para sostener y orientar el cerebro, agarre la conexión entre los discos imaginales de ojo/antena (amarillo oscuro) y el cerebro con el otro par de fórceps(Figura 1F). Utilice cualquiera de las técnicas que se muestran en la Figura 1A para cortar esta conexión sin tirar del cerebro. Compruebe si el cerebro está adecuadamente despejado de otros tejidos(Figura 1G)y no dañado(Figura 1H). Deseche el cerebro si muestra signos de daño.
  8. Pipetear la solución de recubrimiento con un P20 dentro y fuera para recubrir la punta de la pipeta. Pipetear el cerebro con la punta recubierta junto con 3 μL de medio(Figura 2A, izquierda)y pipetearlo en otro pozo que contiene 200 μL de medio de cultivo limpio.
  9. Repita los pasos 2.2–2.8 hasta que se diseccionen suficientes cerebros, reemplazando ocasionalmente el medio de cultivo del pozo en el que se realizan las disecciones.

Figure 1
Figura 1: Disección de los cerebros larvarios de D. melanogaster.  (A) Técnica para cortar sin tirar usando fórceps. La muestra (verde pálido) se puede cortar siendo molida entre las puntas de los fórceps (panel superior) o ejecutando una punta de un par de fórceps a lo largo de las puntas de un par de fórceps que sostienen la muestra (panel inferior). (B–F) Pasos para aislar el cerebro larvario sin dañarlo (ver texto). Rojo: cerebro. Amarillo oscuro: discos de ojo/antena. Texto azul: acciones a realizar con las fórceps correspondientes. (G) Apariencia de un cerebro aislado sin daño visible. D es el lado dorsal y V es el lado ventral en la vista lateral. (H) Daños comunes causados por tirar excesivamente del cerebro durante la disección. Panel superior: desprendimiento del cordón nervioso ventral. Panel inferior: deformación de un lóbulo. El posterior es izquierdo y anterior está justo en todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Inmovilización en portada con coágulos de Fibrina

NOTA: Realice este paso bajo un binocular de disección.

  1. Utilice una pipeta P20 con una punta recubierta como en el paso 2.8 para transferir los cerebros diseccionados a otro pozo de la placa de borosilicato que contiene 200 μL de medio de cultivo + Fibrinogen (Figura 2A).
  2. Pipeta en un cerebro junto con 9 μL de medio de cultivo + Fibrinógeno. Con el extremo de la punta casi tocando el fondo de vidrio de la cubierta de un plato de cultivo celular de 35 mm, pipetear el contenido (el medio de cultivo y el cerebro) haciendo que el medio de cultivo toque el tubo inmediatamente después de salir de la punta de la pipeta para que el cerebro y el medio no se deslicen a los lados de la punta, potencialmente dañando el cerebro(Figura 2A).
  3. Utilice una punta de un par de fórceps o un par cerrado de fórceps para empujar suavemente y colocar el cerebro dentro del medio de cultivo + Caída de Fibrinógeno.
    NOTA: Tocar la gota con un par de fórceps abiertos puede provocar que el medio de cultivo se aleje por la capilaridad entre las puntas de los fórceps (Figura 2B).
  4. Si la parte ventral del cerebro tiene que ser imagen, induzca la coagulación de Fibrinogen de la siguiente manera para orientar adecuadamente el cerebro dentro del coágulo (Figura 2C).
    1. Empuja el cerebro a un lado de la caída. Con una pipeta P1 equipada con una punta P1, pipeta 1 μL de solución de trombina, toque el borde de la gota en el lado opuesto del cerebro con la punta de la pipeta, y pipetee el trombón(Figura 2C,primer dibujo).
    2. Espere 1-2 min para que el Fibrinogen comience a polimerizar, lo que resulta en la formación de un precipitado nublado en un lado de la caída(Figura 2C,segundo dibujo). Empuje suavemente y "meta" el cerebro en el coágulo de Fibrin, asegurándose de que la parte a la imagen (por ejemplo, el lado ventral) esté lo más cerca posible del deslizamiento de cubierta sin deformar el cerebro(Figura 2C,tercer dibujo).
    3. Pipeta fuera 1 μL de solución de trombina cerca del lado del cerebro no metido en el coágulo de Fibrin. (Figura2C,cuarto dibujo).
    4. Espere 2-3 minutos para que se establezca el segundo coágulo de Fibrin(Figura 2C,quinto dibujo). Pulse en los bordes del coágulo para que se adhiera más fuertemente a la mancha, teniendo cuidado de no deformar el cerebro(Figura 2C,sexto y séptimo dibujo). Si el cerebro parece estar demasiado lejos de la mancha, acérquelo presionando el coágulo de Fibrin cerca del cerebro.
  5. Si la parte dorsal del cerebro debe ser imagen, induzca la coagulación de fibrina de la siguiente manera (Figura 2D).
    1. Coloque el cerebro en el centro de la gota, parte dorsal frente a la cubierta. Con una pipeta P10 equipada con una punta delgada, pipeta 1 μL de solución de trombina, toque el borde de la gota en el lado opuesto del cerebro con la punta de la pipeta, y pipetear el trombón(Figura 2D,primer dibujo).
    2. Espere 2-3 minutos para que el Fibrinogen comience a polimerizar, lo que resulta en la formación de un precipitado nublado y fibroso(Figura 2D,segundo dibujo). Presione los bordes del coágulo para que se adhiera más fuertemente a la mancha, teniendo cuidado de no deformar el cerebro(Figura 2D,tercer y cuarto dibujo).
  6. Repita los pasos 3.1–3.5 si varias muestras de coágulos tienen que ser inmovilizadas en la cubierta.
  7. Con el extremo de la punta situado a unos 0,5 cm por encima de los coágulos, pipeta suavemente 390 μL de medio de cultivo sin Fibrinógeno en la parte superior de los coágulos(Figura 2B,plato derecho de Petri). No agregue el medio de cultivo en los lados del coágulo, ya que puede separarlo de la cubierta.
  8. Para lavar el trombo restante, utilice una pipeta para eliminar 300 μl del medio de cultivo y añadir 300 μl de medio de cultivo limpio, asegurándose de que los coágulos permanezcan completamente sumergidos. Repita dos veces para lavar el exceso de trombo.

Figure 2
Figura 2: Inmovilización de un cerebro larvario de Drosophila usando coágulos de fibrina. (A) Utilizando una punta de pipeta recubierta de BSA, los cerebros se transfieren del medio de cultivo (amarillo) a un medio de cultivo + solución de fibrinógeno (naranja), luego pipeteados en el tubo (azul claro) de un plato de cultivo junto con 3,5 μL de medio de cultivo + Fibrinógeno. La coagulación de fibrinógenos es inducida por la adición de trombina para inmovilizar cerebros en posición dorsal o ventral (ver D y E). Los cerebros asegurados en los coágulos se cubren posteriormente en medio de cultivo sin Fibrinógeno y el exceso de trombina se elimina añadiendo y eliminando el medio de cultivo tres veces. (B) La posición del cerebro dentro de la gota de medio de cultivo + Fibrinógeno (naranja) en el deslizamiento de cubierta sólo debe ajustarse empujando suavemente con la punta de un par cerrado de fórceps, o sólo una punta de fórceps. Tocar la gota con un par de fórceps abiertos puede provocar que el medio de cultivo se aleje por la capilaridad entre las puntas de los fórceps. (C) Pasos para colocar el cerebro larvario para tomar imágenes del lado ventral (ver texto). (D) Pasos para posicionar el cerebro larvario para tomar imágenes del lado dorsal (ver texto). En (D) y (E), verde: Trombo. Naranja oscuro: Coágulo de fibrina. Azul pálido: manchas de cubierta. Flechas azules: bordes del coágulo que se empujarán contra la cubierta para estabilizar el coágulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Adición de reactivos durante imágenes en vivo

  1. Para evitar cambios de temperatura que causen cambios de enfoque, mantenga la solución con los reactivos que se añadirán al plato de cultivo a la misma temperatura que el propio plato de cultivo para llevarlo a la misma temperatura antes de agregarlo. Si se está utilizando una cámara ambiental, deje la solución dentro de la cámara.
  2. Retire la tapa del plato de cultivo sin desplazar el plato de cultivo en sí. Para facilitar la extracción, coloque la tapa del plato de 35 mm boca abajo en la parte superior del plato antes de tomar imágenes.
  3. Con una pipeta P1000, coloque la punta de la pipeta cerca de la superficie del medio de cultivo dentro del plato de cultivo y libere suavemente el volumen adecuado de solución de reactivo sobre ella para alcanzar la concentración de reactivo deseada (por ejemplo, 400 μL de una solución de 20 μM NAPP1 a 400 μL de medio de cultivo para una concentración final de 10 μM NAPP1) , sin generar fundentes fuertes que pudieran separar los coágulos.
  4. Para homogeneizar la solución dentro del plato de cultivo, utilice una pipeta P200 para canalizar lentamente una pequeña cantidad de la solución dentro y fuera cinco veces (por ejemplo, 150 μL para un volumen de 800 μL dentro del plato).
  5. Reemplace la tapa en la parte superior del plato de cultivo sin desplazar el plato de cultivo en sí y reanudar las imágenes.

5. Lavado de reactivos durante imágenes en vivo

  1. Antes del lavado, mantenga la solución de lavado a la misma temperatura que el plato de cultivo.
  2. Retire la tapa del plato de cultivo sin desplazar el plato de cultivo en sí.
  3. Con una pipeta P200 o P1000, retire lentamente algún medio de cultivo del plato de cultivo sin exponer la parte superior del coágulo (por ejemplo, retire 600 μL de 800 μL de medio de cultivo dentro del plato).
  4. Para diluir el reactivo, con una pipeta P1000, coloque la punta de la pipeta cerca de la superficie del medio de cultivo dentro del plato de cultivo y libere lentamente la solución de lavado (por ejemplo, añadir 1 ml de solución de lavado al medio de cultivo de 200 μL que queda dentro del plato para un factor de dilución de 6).
  5. Repita los pasos 5.3 y 5.4 hasta que el reactivo se diluya según sea necesario (por ejemplo, otras tres rondas similares darán lugar a un factor de dilución de 1296, reduciendo la concentración inicial de 10 μM NAPP1 a 7,7 nM).
  6. Reemplace la tapa en la parte superior del plato de cultivo sin desplazar el plato de cultivo en sí y reanudar las imágenes.

6. Corrección del xyz a la deriva en lapsos de tiempo tridimensionales y/o multicanal

  1. preparación
    1. Descargar e instalar ImageJ24. Descarga los plugins TurboReg25 y MultiStackReg26 y colócalos dentro de la carpeta plugins de ImageJ.
    2. Descargue las macros MultiHyperStackReg (Archivo de codificación suplementaria 1) y AutoHyperStackReg ImageJ (Archivo de codificación suplementario 2). Para instalar una macro, coloque el archivo .ijm dentro de la carpeta plugins de ImageJ o agregue el contenido del archivo .ijm al archivo ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
    3. En ImageJ, abra una película de lapso de tiempo que incluya varios sectores y/o varios canales (en adelante denominado "hyperstack", Figura 3A,4A). Si el lapso de tiempo solo incluye un sector y un canal, la alineación se puede realizar directamente mediante MultiStackReg.
  2. Corrección de la deriva lateral usando MultiHyperStackReg
    1. Decida qué canal y/o sector de la hiperstack debe utilizarse como referencia para la alineación. Para generar una pila de referencia de un canal y un sector (en adelante, "pila de referencia"), haga clic en Imagen | Duplicar..., marque la casilla Duplicar hiperstack, escriba el número de canal relevante en Canales (c): (por ejemplo, reemplace 1-2 por 1)y/o el número de canal relevante en Slices (z): (por ejemplo, reemplace 1–15 por 8),y asegúrese de que Frames: (t) incluya todos los fotogramas (por ejemplo, 1-50)antes de hacer clic en OK (Figura 3B).
    2. Alternativamente al paso 6.2.1, si se prefiere una proyección de varios sectores para la pila de referencia de un canal y un sector, haga clic en Imagen | Pilas | Proyecto Z..., seleccione el primer y último sector y tipo de proyección, asegúrese de que todos los marcos de tiempo estén marcados y haga clic en Aceptar. Si el lapso de tiempo tiene varios canales, elimine los canales irrelevantes (Image | Pilas | Eliminar sector) de la proyección resultante o duplicar el canal de referencia elegido (Imagen | Duplicado) (Figura 3B).
    3. Opcionalmente, recorte la pila de referencia para usar solo una pieza como referencia seleccionando la herramienta rectángulo en la barra de herramientas, trazando un rectángulo sobre la región de interés y haciendo clic en Imagen | Recortar.
    4. Para iniciar MultiStackReg, haga clic en Plugins | Inscripción | MultiStackReg. En el menú emergente Pila 1:, seleccione el nombre de la pila de un canal y un sector generada en los pasos anteriores. En el menú emergente Transformación:, seleccione Traducción; marque la casilla guardar archivo de transformación e ignore todos los demás campos.
      NOTA: Otros tipos de transformación (véase25).
    5. Haga clic en Aceptar. Seleccione una ubicación y un nombre para guardar el archivo de alineación y haga clic en Guardar. En la ventana de pila de referencia, espere a que las tramas dejen de moverse automáticamente, lo que indica que el registro ha terminado (Figura 3B).
    6. Compruebe la pila de referencia para ver si la alineación es satisfactoria. Si no es así, repita los pasos 6.2.1–6.2.5 con un sector de referencia diferente, canal y/o recorte. Cierre la pila de referencia.
    7. Seleccione la ventana de hiperstack y ejecute la macro MultiHyperStackReg. Seleccione el archivo de transformación creado en el paso 6.2.5 y haga clic en Abrir. Espere a que la alineación se aplique a cada canal y/o sector del hiperstack, momento en el que se abrirá una nueva ventana con el sufijo "_aligned" (Figura 3C).
  3. Corrección de la deriva de enfoque usando MultiHyperStackReg
    1. Haga clic en Image | Propiedades..., copie el valor que se muestra en Anchura de píxel. Para volver a licenciar ortogonalmente el hiperstack de un canal con un espaciado de un píxel, haga clic en Image | Pilas | Reslice [/]..., pegue el valor de ancho de píxel en el campo Espaciado de salida: numérico; seleccione Superior en el menú emergente Inicio en: , marque Evitar interpolación y haga clic en Aceptar.
      NOTA: En caso de que la memoria tenga que liberarse en ImageJ, el hiperstack se puede cerrar después del reslice.
    2. Seleccione la nueva ventana generada por la reliquia (en adelante, "hiperstack resliced", Figura 4B). Si la hiperstack reslicada tiene varios canales, seleccione un canal de referencia para realizar la alineación y eliminar los demás canales seleccionándolos en la barra de desplazamiento del canal; clic En image | Pilas | Eliminar sector, seleccione Canal en el menú emergente Eliminar corriente y haga clic en Aceptar.
    3. Genere una hiperstack revendeda de un solo sector (en adelante, "pila de referencia revendecida"), ya sea duplicando un solo sector de la hiperstack revendecida (véase el paso 6.2.1) o proyectando varios sectores del hiperstack revendecido (véase el paso 6.2.2) (Figura 4C).
    4. Opcionalmente, recorte la pila de referencia resliced para utilizar solo una pieza como referencia (véase el paso 6.2.3).
    5. Realice el registro de imágenes en la pila de referencia resliced con MutiStackReg (ver pasos 6.2.4–6.2.6) (Figura 4C).
    6. Seleccione la ventana de hiperstack resliced y ejecute la macro MultiHyperStackReg. Seleccione el archivo de transformación creado en el paso 6.3.5, haga clic en Abrir y espere a que la alineación se aplique a todos los canales y/o sectores del hiperstack, momento en el que se abrirá una nueva ventana con el sufijo "_aligned" (en adelante denominado "pila de referencia revendecida", Figura 4D). Cierre la hiperstack reliced original.
    7. Para convertir la hiperstack alineada resliced a la vista xy de la hiperstack original, haga clic en Pilas | Reslice [/]..., seleccione Superior en el menú emergente Inicio: , marque Evitar interpolación y haga clic en Aceptar. Una vez que se abra una nueva ventana con el hiperstack alineado con el enfoque final(Figura 4E),cierre la hiperstack alineada reliced.
  4. Para corregir automáticamente la deriva lateral y la deriva de enfoque, ejecute la macro AutoHyperStackReg. Seleccione el canal de referencia, si corresponde, y si desea corregir la deriva lateral y/o de enfoque. Haga clic en Aceptar.

Figure 3
Figura 3: Canalización para la corrección de deriva lateral con MultiHyperstackReg. (A) Las derivas laterales y de enfoque se pueden observar en un hiperstack que contiene varias rebanadas y puntos de tiempo. (B) Se genera un único sector, pila de referencia de un solo canal a partir del hiperstack, ya sea por duplicación o proyección Z. La pila de referencia está alineada por el plugin MultiStackReg, generando un archivo de alineación. (C) La macro MultiHyperstackReg se utiliza para aplicar el archivo de alineación al hiperstack, lo que resulta en una hiperstack alineada para la que se corrige la deriva lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Canalización para la corrección de la deriva de enfoque con MultiHyperstackReg. (A) Las derivas de enfoque se pueden observar en un hiperstack que contiene varias rebanadas y puntos de tiempo. (B) La hiperstack se resecha ortogonalmente desde la parte superior, a lo largo de cada línea de píxeles a lo largo del eje Y, sin interpolación. Esto da como resultado una hiperstack reslicada que contiene la misma información que el hiperstack, con sus coordenadas y y z cambiadas. La deriva de enfoque (en z) del hiperstack original se produce como una deriva en y en la hiperstack reliced. (C) Se genera una pila de referencia resliced de un solo canal a partir de la hiperstack resliced, ya sea por duplicación o proyección Z. La pila de referencia resliced está alineada por el complemento MultiStackReg, generando un archivo de alineación. (D) La macro MultiHyperstackReg se utiliza para aplicar el archivo de alineación a la hiperstack resliced, lo que resulta en una hiperstack reliced alineada para la que se corrige la deriva de enfoque (en y). (E) Un segundo reslice ortogonal restaura las coordenadas originales del hiperstack, que ahora ya no presenta una deriva de enfoque (en z). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Medición de señal cortical con canales de líneas giratorios

  1. Descargue la macro Rotating Linescans ImageJ(archivo de codificación suplementario 3).
  2. Abra un lapso de tiempo en ImageJ. Coloque la barra de desplazamiento de fotogramas en el primer fotograma y, en caso de que el lapso de tiempo contenga varios sectores, coloque la barra de desplazamiento de los sectores en el sector en el que se medirá la señal.
  3. Modo de seguimiento
    1. Seleccione la herramienta de línea recta en la barra de herramientas. Trace una línea a través de la zona cortical a medir(Figura 5A),asegurándose de que la línea es aproximadamente perpendicular a la corteza y que la línea es lo suficientemente larga como para cruzar la corteza en cada punto de tiempo siguiente(Figura 5B, primer y segundo panel).
    2. Haga doble clic en el icono de la herramienta de línea de la barra de herramientas para abrir la ventana Ancho de línea. Aumente el ancho de la línea tanto como sea necesario manteniendo la intersección entre la línea y la corteza una línea recta (Figura 5B, tercer panel).
    3. Inicie la macro Líneas giratorias. Establezca el rango de rotación(Figura 5E)en un valor bajo (aproximadamente 10°) si la orientación de la zona cortical a medir no cambia mucho de un punto de tiempo al siguiente. Establezca el valor Medir alrededor en 0 píxeles para medir únicamente la señal en la línea donde se detecta la intensidad máxima de la señal, o en valores más altos para medir también la señal alrededor de esta línea.
      NOTA: El valor Medir alrededor solo afectará a la medición de la señal después de la detección de la corteza y no afectará a la detección en sí.
    4. En el menú emergente Buscar cortex en canal: seleccione el canal en el que se realizará la detección. Para visualizar dónde se ha detectado la corteza en cada punto de tiempo, mantenga la casilla De visualización... marcada (recomendado). Mantenga la casilla de verificación Más reciente y reorientar... marcada. Haga clic en Aceptar.
    5. Una vez hecho, los resultados copiados en el estado del Portapapeles se muestran en el estado de la ventana ImageJ, desplácese por el lapso de tiempo para comprobar si las posiciones de corteza detectadas (superposición amarilla) y el área medida (superposición de cian) son satisfactorias. Si no es así, repita los pasos 7.3.1–7.3.4 con una posición de línea, longitud o anchura diferentes y diferentes configuraciones en la ventana de opciones Líneas giratorias.
    6. Pegue las mediciones en un software de hoja de cálculo.
      NOTA: Las columnas corresponden a canales en el orden de su apariencia en el lapso de tiempo y las líneas corresponden a fotogramas.
  4. Modo de no seguimiento
    1. Seleccione la herramienta de línea recta en la barra de herramientas. Trace una línea (indicada en cian, Figura 5A)a través de la zona cortical a medir, asegurándose de que la línea es aproximadamente perpendicular a la corteza y que la línea es lo suficientemente larga como para cruzar la corteza en cada punto de tiempo (Figura 5C, primer y segundo panel).
    2. Haga doble clic en el icono de la herramienta de línea de la barra de herramientas para abrir la ventana Ancho de línea. Aumente la anchura de la línea tanto como sea necesario manteniendo la intersección entre la línea y la corteza una línea recta (Figura 5C, tercer panel).
    3. Inicie la macro Líneas giratorias. Establezca el rango de rotación (Figura 5E) en consecuencia a los cambios de orientación de la zona cortical que se medirán a lo largo de todo el lapso de tiempo. Establezca el valor Medir alrededor en 0 píxeles para medir únicamente la señal en la línea donde se detecta la intensidad máxima de la señal, o en valores más altos para medir también la señal alrededor de esta línea.
      NOTA: El valor Medir alrededor solo afectará a la medición de la señal después de la detección de la corteza y no afectará a la detección en sí.
    4. En el menú emergente Buscar cortex en canal: seleccione el canal en el que se realizará la detección. Para visualizar dónde se ha detectado la corteza en cada punto de tiempo, mantenga la casilla Mostrar posiciones... marcada (recomendado). Desenfunda la casilla de verificación Más reciente y Reorientar.... Haga clic en Aceptar.
  5. Una vez hechos, los resultados copiados en el Portapapeles se muestran en el estado de la ventana ImageJ, desplácese por el lapso de tiempo para comprobar si las posiciones de corteza detectadas (superposición amarilla) y el área medida (superposición de cian) son satisfactorias. Si no es así, repita los pasos anteriores con una posición de línea, longitud o anchura diferentes y diferentes configuraciones en la ventana de opciones Líneas giratorias.
  6. Pegue las mediciones en un software de hoja de cálculo.
    NOTA: Las columnas corresponden a canales en el orden de su apariencia en el lapso de tiempo y las líneas corresponden a fotogramas.

Figure 5
Figura 5: Medición de la señal cortical con líneas giratoriascan. (A) Una línea (cian) se traza perpendicularmente hasta la corteza (negro) donde se medirá la señal. Diferentes tonos de gris muestran la posición de la celda cambiando en tres puntos de tiempo (t1, t2, t3). (B) Izquierda: posicionamiento correcto de la línea en modo de seguimiento. Medio: posicionamiento incorrecto de la línea en modo de seguimiento, ya que no hay superposición con la corteza en el siguiente punto de tiempo. Derecha: línea demasiado ancha que resulta en la intersección (línea naranja) entre la corteza y la línea no siendo recta. (C) Izquierda: posicionamiento correcto de la línea en modo de no seguimiento. Medio: posicionamiento incorrecto de la línea en modo que no es de seguimiento, ya que no hay superposición con la corteza en cada punto de tiempo. Derecha: línea demasiado ancha que resulta en la intersección (línea naranja) entre la corteza y la línea no siendo recta. (D) Longitud y anchura de la línea de escaneo. (E) Los linescans se realizan dentro de un rango de orientaciones alrededor de la orientación original que se muestra en (D) definida por el parámetro "rango de rotación", en un intervalo definido por el parámetro "paso de rotación". (F) Orientación no óptima de la línea de escaneo en relación con la corteza, lo que resulta en una señal baja medida a lo largo de la línea. (G) La orientación óptima de la línea se define como la que resulta en el pico más alto de intensidad de señal medido a lo largo de la línea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Inmovilización de los tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina e intercambio medio de cultivo durante las imágenes en vivo.
Después de ser diseccionados siguiendo el procedimiento presentado en el paso 2(Figura 1)e inmovilizados en coágulos de Fibrin en el mismo control de cubiertas después del procedimiento presentado en el paso 3(Figura 2),cerebros larvarios que expresan Bazooka etiquetado por GFP (Baz::GFP), el ortolog mosca de la proteína de polaridad Par-3, fueron imaginados durante 30 minutos en imágenes confocales de lapso de tiempo. Baz::GFP se combina con apkcas4,un alelo que permite la inhibición aguda de la proteína atípica quinasa C (aPKC) a través de la adición del pequeño analógico ATP 1-NAPP120. 1-NAPP1 se añadió al medio de cultivo después del procedimiento presentado en el paso 4 y se reanudaron las imágenes en vivo para las 2,5 h. Los cerebros de control que llevaban una versión de tipo salvaje de la quinasa aPKC no reaccionaron al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores además de una mutación analógica sensible de aPKC(apkcas4) mostraron una contracción del neuroepithelium y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie(Figura 6, Video 1). Los neuroblastos siguen dividiéndose a lo largo del lapso de tiempo, lo que indica que el tejido permanece sano, y los cerebros muestran poca deriva a pesar del cambio medio del cultivo, lo que indica que están bien inmovilizados. Del mismo modo, tras ser diseccionados tras el procedimiento presentado enel año 27,se inmovilizaron los coágulos de Fibrin en el mismo control de portadas e imágenes durante 8 minutos, tras lo cual la aplicación de 1-NAPP1 indujo la contracción de apkccomo4 células foliculares mutantes pero no de controles(Figura 7, Vídeo 2).

Corrección de deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperstackReg.
Un hiperstack que muestra la deriva lateral y de enfoque(Video 3,panel izquierdo) se corrigió primero para la deriva lateral (paso 6.2, Figura 3, Video 3,panel central), luego deriva de enfoque (paso 6.3, Figura 4, Video 3,panel derecho) utilizando el plugin MultiStackReg y la macro MultiHyperstackReg, lo que resulta en una reducción sustancial de los movimientos observados en el hiperstack original.

Medición de señal cortical utilizando líneas giratorias
Un neuroblasto que expresa Baz::GFP (verde) y la proteína transmembrana CD4 etiquetada con una proteína fluorescente infrarroja (CD4::mIFP, rojo) se imaginaron durante una mitosis. La señal CD4::mIFP se utilizó como referencia para detectar la corteza en varias partes del neuroblasto con linescans (paso 7, Figura 5, Figura 8A-C)y la señal Baz::GFP se midió en las posiciones detectadas Figura 8D). Durante su división, los neuroblastos se polarizaron transitoriamente estableciendo dominios corticales distintos y opuestos: el polo apical y el polo basal. Baz define el polo apical y, consistentemente, la señal Baz::GFP aumentó en el polo apical del neuroblasto y disminuyó en el polo basal durante la división(Figura 8C,D). La posición de la corteza fue rastreada satisfactoriamente durante todo el lapso de tiempo (Figura 8C, Video 4). Se hace referencia a las líneas y genotipos de Drosophila en la Tabla suplementaria 1–2.

Figure 6
Figura 6: Aplicación de un análogo ATP en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo. (A) Imágenes en vivo de dos cerebros larvarios que expresan Baz::GFP inmovilizado en la misma portada. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Los cerebros de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores de una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del neuroepithelium (puntas de flecha) y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliación del neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Aplicación de un análogo ATP en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo. Imagen en vivo de dos ovarioles que expresan Baz::GFP inmovilizado en el mismo coverslip. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Las cámaras de huevos de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que las cámaras de huevos que llevan una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del epitelio (puntas de flecha) que eventualmente conduce a la aparente descomposición de las uniones de adherentes. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 27 μM. Escala bar: 20 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Medición de la señal cortical utilizando linescans giratorios. (A) Neuroblast D. melanogaster en vivo que expresa Baz::GFP (verde) y CD4::mIFP (rojo). Líneas de cian: líneas de escaneo inicial trazadas perpendicularmente a varias zonas corticales a medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificación de la corteza (línea azul oscuro) utilizando linescans corticales y CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Línea de cian: área definida por el parámetro "Medir alrededor" (aquí, 2 píxeles), donde la señal se mide después de la detección de la corteza. Barra de escala: 2 μm. (C) Cian: áreas corticales identificadas durante una división de neuroblasto por el método de linescans giratorios a partir de las líneas de escaneo iniciales mostradas en (A), utilizando CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Barra de escala: 5 μM. Flecha: polo apical. Punta de flecha: polo basal. (D) Medición de la intensidad de la señal Baz::GFP a lo largo del tiempo en las dos zonas correspondientes identificadas por las líneas giratorias en las que se muestran (C). Durante la mitosis, Baz::GFP se enriquece transitoriamente en el polo apical del neuroblasto y se agota desde el polo basal opuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Aplicación del intercambio de medios en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 6,barra de escala: 20 μm. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Aplicación del intercambio de medios en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 7,barra de escala: 20 μm. Por favor haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 3: Corrección de la deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperStackReg. Imágenes en vivo de un neuroblasto que expresa la sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Izquierda: antes de la corrección de la deriva. Medio: después de la corrección de la deriva lateral. Derecha: después de la corrección de la deriva lateral y de enfoque, barra de escala: 10 μm. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Video 4: Detección de la corteza utilizando linescans giratorios, presentados en la Figura 8,escala de barra: 5 μm. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Tabla suplementaria 1: Genotipos de tejidos Drosophila en imágenes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria 2: Origen de los transgéneos utilizados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo de codificación suplementario 1: Origen de los transgéneos utilizados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 2: Origen de los transgéneos utilizados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 3: Origen de los transgéneos utilizados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las imágenes en vivo de cerebros larvarios enteros del monte D. melanogaster proporcionan la oportunidad de observar divisiones asimétricas de células madre neuronales en condiciones cercanas a un contexto fisiológico. La primera parte de nuestro protocolo introduce nuestro enfoque sobre la disección de cerebros larvarios. Como ya se ha dicho13,un aspecto crítico de la preparación es evitar dañar el cerebro. El aspecto más desafiante de esto es separar el cerebro de los discos imaginales vecinos sin tirar excesivamente sobre el cerebro. Nuestro enfoque para "cortar sin tirar" es realizar un movimiento de molienda con las puntas de un par de fórceps, o deslizar una punta de fórceps a lo largo de otras dos puntas de fórceps que sostienen la conexión entre los tejidos(Figura 1A),mientras que Lerit et al. describen los movimientos similares a las sierras con un pasador diseccionador. Aconsejamos al experimentador que pruebe todos los enfoques y adopte el más adecuado para sí mismos. También sugerimos el uso de puntas de pipeta recubiertas de BSA o FCS en lugar de herramientas de disección para transferir cerebros aislados. El revestimiento evita que los tejidos se peguen al plástico y permite la transferencia segura de los tejidos manteniendo siempre completamente sumergidos, sin someterlos a una posible deformación transitoria, ya que se adhieren a la herramienta de disección durante la transferencia. Las puntas recubiertas tienen otras ventajas para permitir la transferencia de varios cerebros a la vez, lo que es particularmente útil cuando es fundamental controlar el tiempo de residencia de las muestras dentro de un medio en particular; son adecuados para la transferencia de otros tejidos, incluso frágiles como, por ejemplo, cuerpos gordos; pueden acomodar una amplia gama de diferentes tamaños de muestra mediante el uso de puntas más grandes o el corte de la extremidad de la punta.

A continuación, este protocolo describe el uso de la coagulación de Fibrinogen para inmovilizar cerebros larvarios en la portada de un plato de cultivo. Un cerebro está orientado dentro de una gota de medio de cultivo + Fibrinógeno, después de lo cual la coagulación es inducida por la adición de trombina. La formación de fibrina es gradual, proporcionando una ventana de tiempo durante la cual la orientación de la muestra se puede ajustar, si es necesario (Figura 2C). Si se requiere una ligera compresión de la muestra - que aconsejamos en el caso de los cerebros larvarios - también se puede ajustar finamente presionando el coágulo más o menos cerca de la muestra durante los pasos 3.4.4 y 3.5.2. La principal ventaja de esta coagulación de Fibrinogen sobre el protocolo descrito en Lerit et al., en el que los cerebros se montan entre una membrana permeable al gas y un tubo de cubierta, es la capacidad de reemplazar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Una posible ventaja de utilizar una membrana permeable al gas sobre nuestro protocolo podría ser que proporciona una oxigenación óptima de las muestras, que podría ser más limitada con nuestro enfoque a medida que los cerebros están separados del aire por el coágulo y algún medio. Por esta razón, aunque no evaluamos el efecto de la cantidad de medio de cultivo dentro del plato de cultivo, sugerimos limitar la cantidad de medio de cultivo encima de los coágulos manteniendo los coágulos completamente sumergidos.

Como la manipulación de los coágulos puede ser experimentalmente difícil y lenta, recomendamos que el experimentador primero practica manipular coágulos sin muestras. Modular el volumen de la gota de medio de cultivo + Fibrinógeno en el deslizamiento de cubierta, la concentración de Fibrinógeno o el volumen y concentración de trombina podría ayudar a facilitar la preparación y podría ser importante a la hora de adaptar el protocolo a otros tipos de tejidos. Con suficiente experiencia manipulando los coágulos, varios cerebros pueden ser inmovilizados en un coágulo si es necesario, aunque complica el ajuste de la orientación. Se pueden formar varios coágulos en el deslizamiento de cubierta, lo que permite, por ejemplo, tomar muestras de imágenes de diferentes genotipos. También es posible exponer diferentes coágulos en las mismas portadas a diferentes medios de cultivo, aunque hay que tener cuidado de no mezclar nunca las gotas de medio de cultivo que cubren los diferentes coágulos. Una vez que los cerebros larvarios están inmovilizados y listos para la toma de imágenes en vivo, aconsejamos seguir las recomendaciones de Lerit et al.13 para evitar el fotodamage excesivo. Sólo a estas recomendaciones nos sumamos no sólo para mantener los cerebros a 25 °C durante las imágenes en vivo con una incubadora de etapas, sino también para precalentar esta etapa durante al menos 30 minutos antes del inicio de la toma de imágenes. En nuestras manos, no hacerlo sistemáticamente resulta en una fuerte deriva de enfoque.

Puede ser ventajoso en algunos contextos poder realizar microscopía correlacionada y fijar e inmunodeprimar una muestra después de la toma de imágenes en vivo. Sin embargo, una limitación del uso de coágulos de Fibrin es que es casi imposible aislar mecánicamente un cerebro de un coágulo sin dañarlo. Una posible manera de superar esta limitación podría ser desarrollar métodos para degradar coágulos de Fibrina con Plasmin o para inducir el desmontaje del coágulo mediante la adición de un péptido imitando las perillas permitiendo la polimerización fibrina28. Normalmente usamos coágulos de fibrina en muestras que van desde células individuales hasta tejidos largos de 200 μM, pero también podríamos inmovilizarnos con éxito en coágulos y cerebros de imágenes de abejorros adultos de más de 3 mm de ancho. Queda por determinar el límite superior del tamaño de la muestra que se puede inmovilizar en coágulos. Del mismo modo, aunque normalmente tomamos muestras inmovilizadas de imagen durante 4 a 5 h, realizamos imágenes exitosas de neuroblastos en cultivo primario durante un período de hasta 3 días, lo que indica que el coágulo al menos no interfiere con la viabilidad a largo plazo. Por el contrario, los coágulos pueden facilitar la sustitución regular del medio, un requisito para la toma de imágenes a largo plazo, sin necesidad de dispositivos como bombas peristálticas para este fin. Si bien no hemos medido los parámetros de permeabilidad de los coágulos de fibrina, la naturaleza fibrosa similar al gel de los coágulos parece ser penetrable por moléculas permeables celulares. Encontramos que latrunculina A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandos de etiqueta HALO y otros tintes estándar utilizados en la biología celular llegan a las células en el coágulo de fibrina sin ningún problema y hasta ahora no han encontrado moléculas que serían retenidas por el coágulo, que, sin embargo, es una posibilidad que necesita ser probada empíricamente.

En conclusión, el uso de coágulos de Fibrin proporciona una forma fiable y relativamente fácil de implementar una forma de inmovilizar los tejidos vivos para obtener imágenes en vivo. Más allá de su utilidad para limitar la deriva lateral, la capacidad de cambiar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo ha demostrado ser invaluable para nuestro enfoque de genética química para estudiar la división celular asimétrica de los neuroblastos D. melanogaster 21. Anticipamos que esta técnica será beneficiosa para los estudios en una amplia gama de tejidos diferentes, particularmente si implican genética química o, por ejemplo, autoetiquetamiento de proteínas29.

Nuestra macro MultiHyperStackReg se basa en el plugin TurboReg ImageJ, que alinea fotogramas o sectores sucesivos de una pila, y el plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar las transformaciones a otras pilas. MultiHyperStackReg simplemente permite aplicar estas transformaciones a hiperstacks (pilas con al menos cuatro dimensiones). Como el uso de MultiHyperStackReg, como lo describimos, requiere muchas acciones y puede llevar bastante tiempo, también escribimos la macro AutoHyperStackReg, que realiza automáticamente todos los pasos descritos en los pasos 6.2 y 6.3. Sin embargo, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg actualmente carece de la posibilidad de calcular la alineación de una pila basada en una subregión de esta pila, una opción que encontramos a veces es crucial para una alineación satisfactoria. Otra limitación de AutoHyperStackReg es que su uso está restringido a traducciones y no a las otras transformaciones propuestas por TurboReg y MultiStackReg, mientras que MultiHyperStackReg puede aplicar a un hiperstack cualquier tipo de transformación en caso de que el usuario lo necesite. Las versiones futuras implementarán estas funciones y estarán disponibles en GitHub30. Por último, nuestra macro de líneas giratorias puede ser una forma fácil de medir rápidamente las señales corticales en lapsos de tiempo, incluso si la corteza cambia su posición u orientación con el tiempo. Si su modo de seguimiento o su modo de no seguimiento es el más adecuado para el análisis depende de la calidad y consistencia de la señal cortical. El modo de seguimiento es más fácil de usar, ya que el usuario no necesita considerar dónde estará la corteza para cada punto de tiempo y puede acomodar grandes cambios de posición y orientación con el tiempo. Sin embargo, sólo es adecuado si la señal cortical sigue siendo lo suficientemente fuerte para su detección durante toda la película: una falla en la detección de cualquier otra cosa que no sea la corteza (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante cerca de la corteza) puede comprometer la detección para cada punto de tiempo siguiente (por ejemplo, el compartimento citoplasmático se aleja de la corteza y las líneas corticales pueden seguirlo durante el resto del lapso de tiempo). El modo de no seguimiento no tiene este escollo, ya que la detección se limita a la línea dibujada originalmente por el usuario (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante puede hacer que la detección falle durante unos pocos puntos de tiempo, pero a medida que el compartimento citoplasmático se aleja de la zona de detección, se reanuda la detección adecuada de la corteza), pero no se comporta bien si la posición o orientación de la corteza cambia mucho con el tiempo. La siguiente característica (que estará disponible en GitHub30)que se desarrollará para el modo de seguimiento será la opción de analizar solo los puntos de tiempo especificados y definir un punto de tiempo de referencia (en lugar del primer punto de tiempo) antes del cual y después de lo cual se realizará la detección, lo que permitirá al usuario al menos evitar puntos de tiempo problemáticos.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo en el laboratorio Januschke está respaldado por las subvenciones fiduciarios Wellcome 100031/Z/12/A y 1000032/Z/12/A. La instalación de imágenes tisulares está respaldada por la subvención WT101468 de Wellcome.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin bovine serum, BSA Merck 5470
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture Sigma F7524
Fibrinogen from human plasma Sigma F3879
FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well World Precision Instruments FD35-100
PP1 Analog (1NA-PP1) Merck Millipore 529579
Pyrex spot plate with nine depressions Sigma CLS722085-18EA
Schneider's Insect Medium Sigma S0146
Thrombin from bovine plasma Merck T4648

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References

  1. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
  2. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  4. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
  5. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  6. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  7. Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
  8. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
  9. Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
  10. Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
  11. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  12. Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  13. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  14. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  15. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588 (2013).
  16. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
  17. Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
  18. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  19. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166 (2018).
  21. Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
  22. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
  23. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
  24. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
  27. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
  28. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
  29. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
  30. Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).

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Januschke, J., Loyer, N. Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61954, doi:10.3791/61954 (2020).

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