Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Studera kavitation förbättrad terapi

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/61989
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Det presenterade experimentella protokollet kan användas för att utföra realtidsmätningar av kavitationsaktivitet i en cellkulturell anordning i syfte att möjliggöra undersökning av de villkor som krävs för framgångsrik läkemedelsleverans och/eller andra bioverkningar.

Abstract

Intresset för terapeutiska tillämpningar av ultraljud är betydande och växande, med potentiella kliniska mål som sträcker sig från cancer till Alzheimers sjukdom. Kavitation - bildandet och efterföljande rörelse av bubblor inom ett ultraljudsfält - representerar ett nyckelfenomen som ligger till grund för många av dessa behandlingar. Det finns dock fortfarande en betydande osäkerhet om de detaljerade verkningsmekanismer genom vilka kavitation främjar terapeutiska effekter och det finns ett behov av att utveckla tillförlitliga övervakningsmetoder som kan genomföras kliniskt. Det finns framför allt betydande variationer mellan studier av de exponeringsparametrar som rapporterats framgångsrikt ge terapeutiska effekter och motsvarande akustiska utsläpp. Syftet med detta dokument är att tillhandahålla designriktlinjer och ett experimentellt protokoll med hjälp av allmänt tillgängliga komponenter för att utföra studier av kavitation-medierade bioverk och inkludera akustisk övervakning i realtid. Förhoppningen är att protokollet ska möjliggöra ett mer utbrett införlivande av akustisk övervakning i terapeutiska ultraljudsexperiment och underlätta enklare jämförelser mellan studier av exponeringsförhållanden och deras korrelation till relevanta bioeffekter.

Introduction

Ultraljud (USA) har använts i stor utsträckning som en diagnostisk bildteknik på grund av dess säkra och icke-invasiva natur, dess enkla genomförande vid en patients säng och desskostnadseffektivitet 1. Bredvid sin diagnostiska och övervakande kapacitet har USA stor potential för terapeutiska applikationer. Tidigt arbete utforskade dess användning i trombolys, DNA-transfektion och läkemedelsleverans2,3,4 och terapeutiska USA representerar nu ett mycket aktivt forskningsområde, med applikationer inklusive tumörbehandling5,6,7,immunterapi8,9,blod - hjärnbarriär (BBB)störning 10,11,12, trombolys13,14,15, och bakteriell infektionsbehandling16,17. Ett nyckelfenomen som ligger till grund för dessa tillämpningar är kavitation: kärnan, tillväxten och svängningen av gasformiga håligheter på grund av förändringar ivätsketrycket 18,19.

Det finns en rad mekanismer genom vilka kavitation ger biologiska effekter. Till exempel kan den mycket icke-linjära karaktären av bubbelsvängningar under påverkan av ett applicerat amerikanskt fält generera mikroströmning i den omgivande vätskan som både kan förbättra läkemedelskonvektion20 och utöva savspänningar på vävnaden i närheten av bubblorna. Detta är särskilt vanligt när bubblor är i närheten av en gräns, vilket orsakar bubblor att svänga icke-sfäriskt, och kan potentiellt främja läkemedelsupptag genom shear-inducerad permeabilisering21,22,23,24. Vid högre tryck observeras större amplitudsvängningar och snabb bubbelkollaps, vilket ger direkt mekanisk stress25 och ofta genererar chockvågor och därav följande stora tryckgradienter som kan störa och genomsyravävnader 26,27. Kollapsen av bubblor nära en yta kan också resultera i bildandet av flytande mikrojets med hög hastighet28,29,30. Dessa mikrojets kan tränga in i vävnad, potentiellt skapa porer eller inducera sekundärastressvågor 31,32. Permeabilisering av biologiska membran vid både vävnads- och cellnivåer kallas olika sonophoresis, som främst används i samband med USA-inducerad förbättring av hudens permeabilitet33,34, och sonoporation, som främst används för att beskriva reversibel permeabilisering av cellmembranet på grund av bildandet avmembranporer 35,36.

Viskös absorption i vätskan som omedelbart omger den oscillerande bubblan kan ge en betydande uppvärmningseffekt37. Dessutom producerar de mycket icke-linjära svängningarna akustisk strålning vid frekvenser högre än det drivande amerikanska fältet. Detta leder till ökad absorption i den omgivande vävnaden och ytterligare uppvärmning38. Bubbelkollaps kan också åtföljas av kemiska effekter på grund av de övergående höga temperaturerna och trycken i bubbelkärnan, såsom generering av mycket reaktiva arter och elektromagnetisk strålning, känd som sonoluminescens32. Dessa effekter har undersökts för att bedöma potentiella skador och/eller aktivering av relevanta cellulära vägar förleverans 39 och utnyttjas i lokal aktivering av ljuskänsliga läkemedel i ett tillvägagångssätt som kallas sonodynamisk terapi40,41,42,43.

Många USA-medierade bioverk kan initieras enbart genom kontroll av amerikanska fältparametrar (tryckamporud, frekvens, pulslängd och repetitionsfrekvens och exponeringstid), men tillförlitligt generera kavitation i biologisk vävnad kräver ofta hög ingångsenergi och medför därför en förhöjd risk för skador. Införandet av exogena eller konstgjorda kavitationkärnor kan avsevärt minska den ingångsenergi som krävs för att producera det breda spektrum av effekter som diskuteras ovan och ytterligare introducerar ytterligare effekter som kanske inte är möjliga enbart med USA. Kavitationskärnor inkluderargasbubblor 26,44,flytande droppar45,46,47 och fasta partiklar48,49,50, med nanoskala kavitationskärnor som ett framväxande undersökningsområde för sina fördelar när det gäller förlängd cirkulationstid, förbättrad extravasation och långvarig kavitationsaktivitet49,51,52,53.

De vanligaste kärnorna är gasmikrobubblor (MBs), som ursprungligen användes som kontrastmedel vid diagnostisk avbildning. De är vanligtvis 1-2 mikrometer i diameter och innehåller en kärna av en gas med hög molekylvikt med låg vattenlöslighet i det omgivande mediet. Kärnan är omgiven av ett skyddande lipid-, protein- eller polymerskal som oftast består av fosfolipider54. När de exponeras för ett amerikanskt fält gör MBs komprimerbarhet att de genomgår volymetriska svängningar, vilket ger en stark akustisk spridning, vilket är ansvarigt för MBs framgång som kontrastmedel. Som nämnts leder dessa svängningar också till ovannämnda mekaniska, termiska och kemiska effekter som kan utnyttjas i terapeutiska applikationer. MB-beläggningsprocessen erbjuder också en mekanism för att kapsla in läkemedel i MB-strukturen och för att fästa droger och/eller rikta arter på MB-ytan. Denna teknik underlättar den utlösta frisättningen av läkemedel för att minska systemisktoxicitet 55. Det har också nyligen visats att material från MB-ytan kan överföras till biologiska strukturer, vilket förbättrar läkemedelstillförseln genom så kallad "sonoprinting"56,57,58.

Övervakning av USA-medierad kavitationsaktivitet kan ge insikter om de resulterande biologiska effekterna både in vitro och in vivo och potentiellt möjliggör justering och optimering av dessa effekter. De två mest tillämpade metoderna för övervakning av kavitationsaktivitet är i) optiska, som använder ultrahöghastighetsvideomikroskopi och i allmänhet inte är genomförbara in vivo; och ii) akustiska, som registrerar de återstrålade ljudfälten som produceras av oscillerande och / eller kollapsande bubblor. Både amplitud- och frekvenskomponenterna i den akustiska signalen innehåller information om bubbelbeteende. Låga koncentrationer av bubblor vid låg incident Amerikanska amplituder har visat sig ge övervägande harmoniska utsläpp (heltals multipler av körfrekvensen)59. När körtrycket ökar kan bubbelutsläppsspektrumet också innehålla fraktionerade komponenter som kallas subharmoniker och ultraharmoniker60 som indikerar starkare icke-linjärt beteende, liksom bredbandsbuller, vilket tyder på inertial kavitation. Heltalsövertoner är en primär indikator på bubbelsvängning men kan också orsakas av icke-linjäriteter var som helst i ett experimentellt system, t.ex. på grund av icke-linjär spridning. Däremot är fraktionerade övertoner och bredbandsbuller mycket starkt korrelerade med bubbeldynamik.

Förhållandet mellan bubbelbeteende och de upptäckta akustiska utsläppen kan kompliceras av faktorer som incident USA-fältet, nukleationsmiljön och egenskaperna hos detektionsvägen60. Ändå kan viktig information om bubbelbeteende och deras interaktioner med celler vinnas genom att urskilja trender i frekvens och energi i det akustiska spektrumet. Dessa data kan också ge värdefull information som kan användas för att ligga till grund för kliniska behandlingsövervakningstekniker. För att fullt ut utnyttja denna information krävs utveckling av robusta, översättbara och reproducerbara experimentella metoder.

För närvarande finns det betydande variation i rapporterade protokoll för att utforma system och genomföra studier för att stödja utvecklingen av kavitation-assisterade terapier. När det gäller apparaten har en rad designmetoder genomförts. Flera grupper har utnyttjat parallellplåtskammare56,61,62,63, antingen specialbyggda eller kommersiellt tillgängliga (t.ex. OptiCell, ThermoFisher Scientific). (2013) utvecklade en cellkammare i kombination med en amerikansk ultraljudsbehandlingsmodul och konfokal avbildning i realtid64, Carugo et al. (2015) använde ett system som består av en kommersiellt tillgänglig cellkulturrätt med ett skräddarsytt PDMS-lock för att möjliggöra nedsänkning i ett vattenbad under exponering i USA65, och Pereno et al. (2018) använde en anordning bestående av skiktade akoustofluidiska resonatorer som möjliggör samtidig optisk och akustisk karakterisering av bubbeldynamik och bubbelcellsinteraktioner66. Användningen av specialtillverkade och applikationsspecifika konstruktioner komplicerar karakteriseringen av det amerikanska fältet och andra miljöexponeringsförhållanden, vilket gör jämförelser mellan studier utmanande. Till exempel finns det betydande variation i de amerikanska parametrar som identifierats för att uppnå framgångsrik sonoporation, som inkluderar centrumfrekvenser som sträcker sig från 0,02 till 15 MHz, arbetscykler som varierar från 1% till kontinuerlig våg och sällsynta blodtryck som sträcker sig från 0,1 till 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabell1). Det finns också en liknande stor variation i de spektralkomponenter (övertoner, undertoner osv.) som har identifierats som associerade med särskilda bioverkningar.

Syftet med detta arbete är därför att tillhandahålla en lätt reproducerbar systemdesign och implementeringsram för in vitro-studier av kavitation-inducerade cellulära bioverk med specifik inkludering av en kavitationsövervakningsförmåga.

Protocol

1. Principer för systemdesign

OBS: I det här avsnittet presenteras de designprinciper som används för att skapa system för övervakning av exponering och kavitation i USA. Dessa principer illustreras med två befintliga system för akustisk transfection (SAT) (se figur 1). Varje system består av ett cellexponeringsfack, en amerikansk källa och en enda elementgivare som fungerar som en passiv kavitationsdetektor (PCD), som alla är integrerade i en bänktestkammare. Dessa konstruktioner bygger på den tidigare systemutveckling som beskrivs i Carugo et al. (2015)65.

  1. Maximera användarvänligheten.
    1. Gör cellexponeringsutrymmet kompatibelt med befintliga odlingstekniker och bildsystem genom att använda befintliga kommersiella cellkulturenheter som sådd-/tillväxtsubstrat.
      1. För SAT2, använd en odlingsform (35 mm diameter, varav en 21 mm diameter yta är observerbar, se Materialförteckning ).
      2. För SAT3, använd en Transwell-insats (6,5 mm diameter, se Materialförteckning ). Transwells har ett genomsläppligt membran och måste därför placeras i cellmedia snarare än vatten.
  2. Möjliggör snabb lastning och tätning av cellexponeringsutrymmet.
    1. Forma SAT2-cellens exponeringsutrymme genom att trycka på montering av ett flexibelt polymerlock över odlingsskålen (Carugo et al. 201565). Som ses i figur 1Char locket ett par hål med diametern 1,2 mm som gör det möjligt att fylla facket med en 18 G trubbig nålspruta. Efter påfyllning, försegla dessa påfyllningsportar med korta plaststavar(Materialförteckning).
    2. Fyll SAT3-facket med spruta eller pipett och täta genom att trycka på montering av en gummipropp/bung.
    3. Möjliggör snabb lastning av det förseglade cellexponeringsutrymmet i provningskammaren. Hållare för cellexponeringsfacken var inbyggda i kammarens lock, där en lätt presspassning är tillräcklig för att säkerställa korrekt inriktning. Med de system som visas i figur 1kan tiden för provbyten vara så kort som 20 sekunder när flera cellexponeringsfack har förberetts i förväg.
    4. Minimera kammarens interna volym så att systemet är bärbart och mängden vatten/media som krävs kan minimeras. Detta påskyndar också återhämtningen från oavsiktliga spill eller läckage av kavitationsmedel ut ur cellexponeringsutrymmet.
      OBSERVERA: SAT2:s interna volym är cirka 0,8 L. SAT3 interna volym är ca 7,6 L – tillverkad större för att rymma enkel lastning och byte av källgivare eller dess konfiguration. En intern kammare på 0,3 L tillsattes för att minimera engångsvolymen och för att tillåta att andra biologiskt relevanta vätskor än tankfyllningsvattnet (t.ex. cellkulturmedel) används. Den inre kammarbotten är tillverkad av 30 μm tjock mylarplåt för att möjliggöra maximal akustisk överföring.
    5. Gör kammaren och de inre komponenterna av optiskt klara material när det är möjligt, så att eventuella problem (t.ex. läckor, instängda makrobubblor) snabbt kan observeras och åtgärdas.
  3. Maximera exponeringsutrymmets akustiska överförbarhet.
    1. Maximera överförbarheten genom val av fackväggsmaterial och tjocklekar. Under antagandet att vätskorna på vardera sidan av en vägg i huvudsak är desamma (t.ex. vatten) är storleken på den normala incidenstrycksöverföringskoefficienten71
      Equation 1, där λ är våglängden i väggen av tjocklek L, Equation 2 och z L och zo är de karakteristiska impedanserna (produkter med densitet och ljudhastighet) för väggmaterialet respektive vätskan. T = 1 indikerar perfekt överföring.
    2. För bred spektrumövervakning av kavitation (t.ex. 1-8 MHz) kommer de flesta laboratoriepolymerer (t.ex. PDMS, PTFE, polystyren) att ändra det överförda trycket med högst 10% om materialets tjocklek är mindre än 1/10av en våglängd i materialet. Detta tillstånd kan vara svårt att uppfylla med standardtillförsel vid höga frekvenser (t.ex. #1,5 täckslip vid 8 MHz), så det är god praxis att förutsäga eller direkt kalibrera överföringsfrekvenssvaret.
    3. För smalbandsöverföring av den amerikanska källsignalen till cellexponeringsutrymmet, tillåt ett tjockare lager om det är ungefär en heltalsmult flera av en halv våglängd i skiktmaterialet. Till exempel används PDMS-locket i SAT2 med en tjocklek av 2,0 mm (~ 2 våglängd vid 1 MHz, cPDMS ~ 1000 m /s).
  4. Maximera exponeringsregionen genom val av käll- och cellmiljö.
    1. För att maximera antalet exponerade celler, gör området för celltillbehör så brett som möjligt samtidigt som kompatibiliteten med tillgänglig odlings- och bildutrustning bibehålls.
    2. Använd en amerikansk källa med ett fält som sträcker sig över celltillbehörsområdet med minimal rumslig variation genom att använda den förfokuserade regionen för en stor fokuserad källa (SAT2) eller en fokuserad eller linsad källa med en huvudlobbredd som matchar diametern på celltillbehörsområdet (SAT3). Se strukturförteckningen för specifika källor.
    3. Minimera den fältkomplexitet som cellfackets hållare inför genom att mekaniskt stödja cellfacket långt bort från den starkaste delen av inst incidenten, minimera hållarens spridningskorssektion eller placera absorberande material på hållaren. Exempel visas i figur 1A och 1D.
  5. Säkerställ repeterbara exponeringsförhållanden.
    1. Avsluta det akustiska fältet i en fast gräns för att eliminera variationer som kan uppstå från luftvattengränssnitt i delvis fyllda kammare. I SAT2 och 3 åstadkoms detta genom att installera en akustisk absorbator (se Materialförteckningen)på kammarlocket med ytterligare en fördel av att minska fältkomplexiteten som kan uppstå vid gränsreflektioner.
    2. Övervaka och registrera källdriftspänningen vid förstärkarens utgång/källingång så att mindre variation eller större felfunktion kan upptäckas snabbt. Använd en spänningssond eller annan enhet som är säker att använda över det stora antalet driftspänningar. Kontrollera regelbundet kalibreringen av spänningssonden med hjälp av en välkänd källa, t.ex. en vågformsgenerator.
    3. Kontrollera, övervaka och registrera kammarens temperatur och dess innehåll. Svar från celler, givare och spridningsmedium kan alla vara temperaturkänsliga. I SAT2 utförs övervakning och kontroll med ett par cirkulationsportar anslutna till ett vattenkonditioneringssystem, medan SAT3 använder en akvarievärmare (visas inte). Ställ in vattentemperaturen efter behov för att efterlikna relevanta fysiologiska förhållanden för den terapeutiska appliceringen.
      OBS: De inre temperaturerna kan ändras både till följd av yttre faktorer och från USA-genererad uppvärmning av givaren och mediet.
    4. Avgasa försiktigt kammarens vätska/vätskor för att minimera sannolikheten för oavsiktlig kavitation och/eller spridning från befintliga bubblor i spridningsvägen.
      OBS: Om avgasning inte utförs, t.ex. på grund av den negativa påverkan på celler, kommer det att finnas en förbättrad bakgrundsnivå av bubbelaktivitet, för vilken lämplig.
  6. Kalibrera det helt monterade systemet.
    1. Inkludera ett sätt att mäta tryckfältsincidenten på de exponerade cellerna när alla systemkomponenter finns på plats, inklusive cellexponeringsutrymmet. I SAT2 och 3 åstadkoms detta med en öppning i kammarlocket genom vilken en nål eller fiberoptisk hydrofon kunde sättas in utan att störa fältet som ska mätas. Gör mätningarna så nära där cellerna finns som möjligt.
    2. Välj en hydrofon med en känslig radie(en rcv)är tillräckligt liten för att den inte ska felrapportera det tryckfält som mäts. Den acceptabla storleken är en funktion av källfrekvens (f) och radie (ensrc) samt avståndet mellan källan och fältskanningen (zrcv). Ett allmänt kriterium för val av hydrofonstorlek är: Equation 6 , vilket leder till: , där Equation 7 c är ljudhastigheten72.
    3. Se till att hydrofonen kalibreras under de förhållanden som används vid systemkaraktärisering, inklusive den temperatur som anges i avsnitt 1.6. Om hydrofonen hålls i en vinkel med avseende på skanningsplanet måste hydrofonen kalibreras i den vinkeln, eftersom direktitetseffekterna kan skilja sig avsevärt från de som förväntas enbart på grundval av geometrin. Tillverkaren bör ha ändrat hydrofonkänslighet i förhållande till temperaturen.
    4. Skanna hela regionen där celler kan exponeras. Om du vill fånga en lämplig nivå av fältdetaljer använder du ett skanningsavstånd som inte är grovare än1/5 av en våglängd vid den högsta frekvensen av intresse. Om oväntad fältkomplexitet observeras bör du överväga att använda korta sprängningssignaler (t.ex. 1–3 cykler) för att möjliggöra identifiering och kvantifiering av direkta och spridda fältbidrag.
  7. Införliva en kavitation övervakning kapacitet.
    1. Bestäm typ och placering av övervakningsgivare som en del av utformningen av det övergripande systemet, snarare än som en eftermontering. I praktiken leder detta till ett system som är maximalt kompakt utan att offra förmågan att på ett tillförlitligt sätt justera de kritiska systemkomponenterna.
    2. Placera en kavitationsövervakningsenhet i systemet på ett sådant sätt att den kan placeras upprepadere med minimal extra installationstid eller störning i arbetsflödet. I SAT2 uppnås detta med en enda element piezoelektrisk givare som fungerar som en PCD monterad i kammarlocket, medan SAT3 integrerar PCD i källbasen med en 90° reflektor.
    3. Välj PCD-formen enligt experimentens mål. I figur 2visar beräkningar av halvamplitudkonturer av ofokuserade (vänster) och fokuserade (höger) enheter de djupa skillnaderna i rumslig känslighet när det gäller frekvens. Den ofokuserade enheten är bättre lämpad för stor volymövervakning med blygsam rumslig variation med avseende på frekvens, medan den fokuserade enheten är bättre lämpad för mer radiellt kompakta mätningar vid frekvenserna av intresse.
    4. Välj PCD-centerfrekvens och bandbredd som passar experimentet. Centrumfrekvensen väljs vanligtvis för att vara minst fem gånger högre än för den amerikanska källan för att minimera känsligheten för direkta källutsläpp. Bandbredden maximeras vanligtvis för att observera ett brett spektrum av bubbelbeteenden (harmoniskt brus och bredbandsbuller).
    5. Välj konditionerings-, inspelnings- och bearbetningsmetoder för att tillåta analys av kavitationsdata, enligt beskrivningen i nästa avsnitt.

2. Instrumentering och bearbetning för kavitationsövervakning

OBS: I det här avsnittet presenteras de signalflödeskomponenter och funktioner som rekommenderas för insamling av kavitationsövervakningsdata och den databehandling som leder till kvalitativa och kvantitativa bedömningar av kavitationsaktivitet.

  1. Instrumentering (se även figur 3).
    1. Om inte programmet kräver en anpassad enhet väljer du ett PCD från det breda utbudet av kommersiellt tillgängliga enskilda element givare, vanligtvis marknadsförs för icke-destruktiv testning av nedsänkta mål. Dessa leverantörer har även kablar och tillbehör (t.ex. spegelreflektorn i SAT3).
    2. Minimera PCD-svar på den amerikanska källan. Detta kan göras både genom val av PCD (centrumfrekvens och bandbredd) och genom att använda ett hack- eller högpassfilter. Den senare kan implementeras antingen som en fristående modul eller som en del av en signalkonditioneringsenhet.
    3. Använd en digitizer med ett stort dynamiskt omfång (minst 12 bitar) för att fånga så mycket data som möjligt med minimal sannolikhet för hög signalurklippning och maximalt signal-till-brusförhållande (SNR) för de minsta signalerna. När du jämför enheter, granska specifikationerna för signal till buller och förvrängning och/eller effektivt antal bitar, eftersom dessa är mer fullständiga beskrivningar av uppnåeligt dynamiskt omfång. Fundera också på om minnesbuffertens storlek är tillräcklig för önskad längd och datainsamlingshastighet.
    4. Optimera användningen av digitizerns dynamiska omfång. PCD-signaler kan täcka flera storleksordningar, både på grund av en lång exponering (eftersom bubblor elimineras) och om experiment körs på olika amerikanska enhetsnivåer. Det är därför nödvändigt att kontrollera att signalkonditioneringskedjan skalar alla signaler så att de kan registreras korrekt.
    5. Inkludera en förförstärkare i signalkedjan så att de minsta förväntade signalerna kan fångas upp på lämpligt sätt. Enligt vår erfarenhet är PCD-självbuller långt under de flesta digitizers, så en blygsam grad av föramplification (t.ex. <100x) kan fortfarande förbättra SNR för slutresultatet.
    6. Filtrera den amerikanska källfrekvensen före förförstärkningen för att undvika att förstärkaren mättas.
    7. Om en amerikansk pulser/mottagare används för att tillhandahålla förstärknings- och/eller filtreringsfunktioner använder du den i pulserläge för att bekräfta banans längd/justering eller kontrollera oväntade spridare i spridningsbanan mellan PCD och cellexponeringsutrymmet.
    8. Aktivera realtidsströmning av data till lagring. SAT2- och SAT3-systemen använder båda 12-bitars strömmande USB-oscilloskop (se Table of Materials),som har bekvämligheten med bärbarhet och välbyggda användargränssnitt.
    9. Bekräfta korrekt impedansmatchning i signalkedjan för att undvika förstärknings- eller bandbreddsfel. PCD-enheter har vanligtvis utgångsimpedanser nära 50 ohm, så en lämplig process är att ersätta PCD med en känd signal från en vågformsgenerator (med 50 ohm utgång impedans) och bekräfta att signalstorleken som visas på digitizern matchar förväntningarna, skalar linjärt när den injicerade signalen ändras och ingen urklipp observeras för den största signalen av intresse.
  2. Förbehandling
    1. Korrigera råspänningssignalerna för alla kända vinster och känsligheter i signalbanan som avser bearbetning av data inom frekvensområdet av intresse.
    2. Om data registrerades med dc-ingångskoppling eller på annat sätt visar en DC-förskjutning, ta bort denna förskjutning genom direkt subtraktion eller med ett högt passfilter.
  3. Beräkna effektspektrumet P för varje inspelad signal.
    1. Ställ in Fourier-transformeringslängden Nft så att den grundläggande frekvensen för den amerikanska källan f0 är en stor heltals multipel av transformeringslagerplatsens bredd: Nft =   nfs/f0, där n är ett heltal och f s är exempelfrekvensen för de digitaliserade data. Ställ in ≥ 50 för tydlig fångst av spektralfunktioner. Till exempel ett 1 MHz-grundprov på 50 MHz är Nft 2500 och bin-bredden är 0,02 MHz.
    2. Eftersom transformeringslängden Nft vanligtvis är mindre än den registrerade signalens varaktighet, använd en effektspektrala densitetsuppskattning(PSD)som Welchs metod73. Effekt i ett frekvensband som sträcker sig över f1-f2 är Equation 13 , där dF är transformeringsfackets bredd.
    3. För att karakterisera bubbelaktivitet under varje exponering, uppskatta bidragen till effektspektrumet från heltals multiplar av f0 (övertoner), udda heltals multiplar av f0/2 (ultraharmoniker) och bredbandsbuller (inertial kavitation).
    4. Harmoniskt och ultraharmoniskt innehåll uppskattas helt enkelt genom att välja effektspektrumvärden vid specifika frekvenser. Stora amplitudtonisvar kan dock spridas till ett litet antal angränsande frekvensbehållare (t.ex. f0 ± 2-3), så dessa bör inkluderas i beräkningarna av smalbandseffekten och uteslutas från bredbandsberäkningarna.
    5. Uppskatta bredbandsband kavitationskraft genom subtraktion av de harmoniska och ultraharmoniska bidragen från det totala effektspektrumet. Alternativt kan dessa bidrag uppskattas med hjälp av mer sofistikerad förbehandling74.
    6. Uppskatta den kumulativa kavitationssignalenergin under exponeringens varaktighet, helst enligt spektrumfunktion / bubbelaktivitetstyp.
    7. Förutsatt att alla dataposter hade lika lång varaktighet Trär den kumulativa energin i de registrerade Equation 15 data , där M anger antalet poster.
    8. Om det finns luckor mellan inspelningarna, vilket kan inträffa när exponeringen är kontinuerlig, och de sparade filerna fångar en bråkdel av den totala exponeringstiden Te,kan den kumulativa energin uppskattas som Equation 16
    9. Uppskatta mätningen SNR i jämförelse med spektrumnivåer med de nivåer av bakgrundsbuller som registrerats i avsaknad av US.

3. Experimentellt protokoll

  1. SAT-förberedelse
    1. Minimera sannolikheten för kavitation i spridningsvägen genom att avgasa påfyllningsvätskan (vanligtvis filtrerat vatten) under ett tryck av -105 Pa i minst två timmar. Bekräftelse med en upplöst syresond att det partiella syretrycket är under 10 kPa rekommenderas.
    2. Fyll testkammaren långsamt för att minimera återinföring av luft i den avgasade vätskan. Fortsätt avgasa den fyllda kammaren om det behövs.
    3. Rensa alla restbubblor från givarens och mediebehållarens ytor omedelbart efter påfyllning och igen strax innan exponeringsexperiment påbörjas.
    4. Se till att temperaturen på kammaren och dess innehåll har stabiliserats innan exponeringsexperiment påbörjas.
    5. Låt den amerikanska källeffektförstärkaren värmas upp (enligt tillverkarens rekommendation) så att förstärkningen och utgången är stabil med avseende på tid.
  2. Förberedelse av exponeringsutrymme
    1. Kavitation agent suspension
      1. När kavitationsmedlet späds ut, rör försiktigt och kontinuerligt om för att göra en enhetlig suspension utan att fånga makrobubblor eller förstöra medlet (särskilt om de är skalade bubblor).
      2. Vid arbete med MBs, dra ut och dispensera långsamt med den största mätarnålen som finns tillgänglig för att minimera förstörelsen underlastningsprocessen 75. En 18 G trubbig fyllningsnål har använts regelbundet med SAT-systemen.
  3. SAT2 Förberedelse
    1. Sterilisera PDMS-locket före användning i experiment med levande celler.
    2. Forma cellexponeringsutrymmet genom att trycka på monteringen av PDMS-locket på odlingsskålen.
    3. Förbered en spruta med en 18 G trubbig nål och fyll med cirka 10 ml vätska (t.ex. MB suspension eller vattenkontroll).
    4. För in nålen genom ett av PDMS-fyllhålen och fyll långsamt kammaren, luta så att makrobubblor kan komma ut genom det öppna fyllningshålet. För bästa resultat, luta kammaren så att det öppna hålet är ovanför fyllningshålet.
    5. När det fylls, stäng det öppna hålet genom att sätta in en kort (4-5 mm) polymerstång. Ställ in enheten så att båda hålen är horisontella.
    6. Ta bort den trubbiga påfyllningsnålen medan du injicerar extra vätska så att luft inte dras in. Stäng hålet med en annan polymerstång. Denna process slutför tätningen av cellexponeringsutrymmet.
    7. Kontrollera visuellt utrymmet efter tecken på instängda makrobubblor, och om några hittas, upprepa 3.3.3.-3.3.6.
    8. Tryck på montera cellexponeringsfacket i fackhållaren. Montera kammarlocket på plats ovanpå kammaren. Om du sänker locket med en vinkel mot horisontellt avskräcks makrobubblor från att vila på de nedsänkta delarna (absorbator, hållare).
    9. Tänk på bärkraften hos partiklarna i suspension när du bestämmer orienteringen av cellexponeringsutrymmet (t.ex. flytande bubblor eller sjunkande nanopartiklar) och hur detta kommer att påverka deras kontakt med celler.
    10. I alla operationer, använd så lite kraft som möjligt för att minimera flexure av cell tillväxt ytan och avskildhet av celler.
  4. SAT3 Förberedelse
    1. Fyll Transwell med cirka 150 μL vätska (t.ex. MB-suspension eller vattenkontroll).
    2. Forma cellexponeringsutrymmet genom att försiktigt försegla flödet med en gummiplugg, ta bort eventuell spillvätska med en ren pappershandduk eller torka. Sterilisera gummipluggen före användning i experiment med levande celler.
    3. Kontrollera visuellt utrymmet efter tecken på inspädda makrobubblor, och om några hittas, ta bort kontakten, ta bort makrobubblorna och upprepa 4.4.2.
    4. Tryck på montera cellexponeringsfacket i fackhållaren. Montera kammarlocket på plats ovanpå kammaren. Om du sänker locket med en vinkel mot horisontellt avskräcks makrobubblor från att vila på de nedsänkta delarna (absorbator, hållare).
      OBSERVERA: Som nämnts ovan kan makrobubblor orsaka en mängd icke-repeterbara och potentiellt skadliga effekter på exponeringsexperiment i USA. Mest kritiskt kan makrobubblor som fångas i cellexponeringsutrymmet orsaka PCD-svar och lokala cellulära bioverkningar som inte är representativa för den avsedda behandlingen. Inspektera alltid visuellt alla systemkomponenter för att hitta och ta bort makrobubblor innan du initierar amerikanska experiment.

4. Insamling av uppgifter

  1. Fastställa pcd-svarsnivåer i bakgrunden genom att utföra inledande experiment med ett cellexponeringsutrymme fyllt med kontrollvätska (t.ex. avgasat vatten eller cellmedier).
  2. Registrera PCD-data utan att driva den amerikanska källan att fastställa elektroniska bullernivåer i bakgrunden.
  3. Registrera PCD-data medan du kör den amerikanska källan på alla planerade enhetsnivåer. Dessa data kommer att indikera vilka delar av det akustiska svaret som inte har något samband med de kavitationsmedel som ska testas senare.
    OBS: Vanliga laboratorievätskor (t.ex. PBS eller cellmedia) uppvisar kavitation vid måttligt tryck (t.ex. 0,5 MPa vid 0,5 MHz) om de inte avgasas.
  4. Innan mätningarna påbörjas, ge tid för suspensionen att termiskt jämvikta med kammarens temperatur. En fin nål termoelement kan vara användbar för detta ändamål.
  5. Övervaka experimenten i realtid i både tids- och frekvensdomäner.
    1. Tidsdomänövervakning av PCD visar om signalerna är lämpliga för de aktuella instrumenteringsinställningarna. Specifikt ska signalurklipp undvikas, eftersom det kommer att visas i frekvensdomänen som harmoniskt svar med flera toner.
    2. Tidsdomänövervakning av PCD visar också om kavitationssignaler ses tidigare än förväntat baserat på spridningstid från den amerikanska källan till exponeringsutrymmet för PCD. Om sådana signaler ses kan detta tyda på läckage av kavitationsmedel i provningskammaren.
    3. Frekvensdomänövervakning av PCD anger typen av bubbelbeteende och kan användas för att justera drivenhetsnivåerna efter behov för att uppnå önskad cellstimulans (t.ex. lägre enhetsnivåer för harmonisk excitation).
  6. För att säkerställa att de första exponeringarna inte missas startar du datainsamlingsprocessen innan du slår på den amerikanska källenhetssignalen.
  7. Övervaka förstärkarens utgångssignal som driver den amerikanska källan (i motsats till vågformsgeneratorns utgång) under hela experimentet för att säkerställa att exponeringen fortsätter som förväntat. Använd en högspänningssond för denna mätning och se till att oscilloskopet är inställt för att kompensera för sonddämpning.
  8. När du har exponerat ett prov, ta försiktigt bort det från testkammaren.
    1. Ta bort och rengör PDMS-locket (SAT2)/gummipluggen (SAT3) som förberedelse för senare användning.
    2. Överför kulturrätten (SAT2)/Transwell (SAT3) efter behov för efterföljande analys (t.ex. mikroskopi, fluorescensavbildning).
    3. Efter ett litet antal exponeringar (t.ex. 3-5) är det god praxis att åter förvärva baslinjekaviitationssignaler (i avsaknad av kavitationsmedel) och jämföra med den ursprungliga datauppsättningen för att se till att kammarmedierna inte har kontaminerats.

Representative Results

Figur 4 visar exempel på PCD-svar för tids- och frekvensdomäner, vilket illustrerar tre distinkta kavitationsbeteenden. Alla data samlades in på SAT3 med SonoVue MBs utspädd 5x i PBS, med en slutlig koncentration på ~2*107 MBs/ml. Temperaturen för alla exempel i detta avsnitt var 19 ± 1 °C. Den amerikanska källan kördes med en puls på 2,0 ms vid 0,5 MHz för att uppnå en högsta undertryck på 0,20 (figur 4A och 4B),0,30 (figur 4C och 4D) och 0,70 MPa (Figur 4E och 4F). Signalinspelningarna började 1,4 ms före t = 0 start av den amerikanska pulsen. De inset spåren visar signalen som inspelad (röd) och med ett 2 MHz högpassfilter (blå) för ett tidsfönster centrerat vid tidpunkten för flygningen från källa till cellexponeringsfack till PCD. Lågnivåsvaret före denna tid beror på direkt mottagen strålning från källan, vilket är vanligt i konfigurationer där PCD ligger bakom den amerikanska källan.

Vid det lägsta incidenttrycket består PCD-svaret helt av helt och hållet helt och hållet av heltals övertoner av den grundläggande amerikanska frekvensen på 0,5 MHz. Att öka från 0,20 till 0,30 MPa resulterar i uttalade ultraharmoniker i spektrumet förutom ytterligare förhöjda heltals övertoner. Tidsdomänens vågformer vid dessa två tryck ser lika ut, även om 0,30 MPa-resultaten visar mer variabilitet under pulsens varaktighet. Vid det högsta trycket har tidsdomänens vågformsamlitud vuxit olinant i förhållande till de lägre trycken till följd av tydligt förhöjt bredbandsbuller synligt i spektrumet. Detta buller anses allmänt vara ett resultat av inertial kavitation och i detta exempel motsvarar förstörelse av MBs.

För att se detta tydligare visas PCD-svar som en tidsfunktion i figur 5. I den vänstra panelen (figur 5A) visas hela spektrat under en 50 sekunders exponeringstid, under vilken källan avgav 2,0 ms pulser var 0,20 sekund. Motsvarande totala, harmoniska och bredbandskrafter visas i den högra panelen (figur 5B). USA var på aktiverat på t =3,0 s, då stora amplitud bredband svar sågs. Den första spiken tros motsvara förstörelsen av de största bubblorna i suspensionen (SonoVue är polydisperse) och är en vanlig observation i kavitationsexperiment med skalade bubblor och även med icke-avgasade medier (t.ex. PBS).

Efter några sekunder minskade bredbandsresponsen snabbt, uppenbarligen på grund av bubbelförstörelse, och signalen består huvudsakligen av övertoner. Detta tyder på att den frigjorda gasen och de återstående MBs vibrerar stabilt och icke-trögt. Vid t ~ 50-talet har bredbandskomponenten fallit till nivån för det ursprungliga bakgrundsljudet. Exponeringstester som detta är därför viktiga när man försöker förstå de tidsskalor under vilka olika bubbeleffekter kan fungera på cellerna i kammaren.

Bubblor kommer sannolikt att översättas som svar på strålningskrafter som genereras under amerikansk exponering och rörelse av MBs in och ut ur PCD-synfältet kan leda till ökad variation i den övervakade kavitationssignalen, särskilt när det gäller utspädda suspensioner. PcD:s känsliga region bör därför omfatta så mycket av cellexponeringsytan som möjligt. En jämförelse av svarsfokuserade och ofokuserade PCD med identiska mittfrekvenser (se figur 2)visas i figur 6, med en utspädning på 20:1 av MBs i normal PBS är SAT2. Tids- och provgenomsnittsspektrat i panel figur 6A visar att det ofokuserade pcd-programmet innehåller ett starkare bredbandssvar, åtföljt av minskad variabilitet mellan prov i både harmoniska (figur 6B) och ultraharmoniska krafter (figur 6C).

Det är viktigt att inse att media som används för in vitro-cellarbete inte avgasas och kan presentera en förbättrad bakgrundsnivå av bubbelaktivitet. Figur 7 visar svaret i SAT2 på PBS som används i leverantörstillhandahållna former och efter två timmars avgasning under vakuum, varefter luftmättnaden minskades från 92 % till 46 % enligt en optisk sensor (PreSens, Tyskland). Spektrat i figur 7A var genomsnittliga över exponeringstid och upprepningar med fem oberoende prover, och visar tydligt förhöjda ultraharmoniker i normala PBS. Befogenheter som summeras över tre övertoner (figur 7B) ligger väl inom standardavvikelsen för varje experimentell produktion. Däremot visar de ultraharmoniska summorna i figur 7C att normal PBS har nästan en storleksordning som är högre och betydligt högre variation mellan proverna. Dessa exempel tyder på att ett vanligt cellkompatibelt medium kan uppvisa beteenden som (felaktigt) kan tillskrivas förekomsten av MBs. Eftersom det vanligtvis är opraktiskt att avgasa odlingsmedium på grund av den negativa inverkan på celler och/eller kavitation agent stabilitet, är det viktigt att utföra lämpliga kontroller i alla kavitation-relaterade studier.

Figure 1
Figur 1: Illustrationer av två amerikanska exponeringssystem som innehåller kavitationsövervakning: SAT3 (D-F). (A) SAT2 kommenterad montering med sidovägg borttagen för tydlighetens skull. (B) SAT2 med sidoväggen intakt. C)SAT2-cellexponeringsutrymme, demonterat. (D) SAT3 kommenterad montering. (E) SAT3 i normala (vänster) och linsade (höger) konfigurationer för balkbreddsmatchning vid olika frekvenser. (F) SAT3 cellexponeringsfack, demonterat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Beräkningar av halv amplitudtrycksfältkonturer för 12,7 mm diameter ofokuserade (vänster) och sfäriskt fokuserade (höger) givare. Frekvenser på 2, 4 och 8 MHz visas som röda, blå respektive gröna konturer för ett PCD-element vid koordinatursprunget (0,0). De yttersta konturerna av den ofokuserade enheten är relativt okänsliga för frekvens, men den inre strukturen är frekvensberoende. Det sfäriskt fokuserade fältet kontrakterar när frekvensen ökar, men inuti konturerna varierar fälten smidigt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Instrumentering för kavitationssignalkonditionering och inspelning (blå pilar), upphetsning av amerikanska källor (röda linjer) och datainsamling utlöser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Tid (vänster) och frekvens (höger) domän PCD-svar inspelade med MBs utspädda 5x i PBS. Incidenttoppens undertryck var (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, alla vid 0,5 MHz. Signalinspelningar börjar 1,4 ms före t =0-starten av ultraljudspulsen på 2,0 ms varaktighet. (A, C, E) Tidsdomänsignaler (röda) visas på en fast vertikal skala, vilket anger hur svarsnivån ändras med incidenttryck. De inset spåren visar signalen som inspelad (röd) och med ett 2 MHz högpassfilter (blå) för ett tidsfönster centrerat vid tidpunkten för flygningen från källa till cellexponeringsfack till PCD. (B, D, F) Ljud- och signaleffektspektrala densiteter beräknas för t<0 respektive t>0. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Spektrumhistoria över en 50 sekunders exponering av en suspension av MBs utspädd 5x i PBS. A)Fullständiga spektra- och B-total-, harmoniska och bredbandssignalkrafter, allt som en funktion av tiden. Körförhållandena var 0,5 MHz, 0,7 MPa högsta undertryck, 2,0 ms pulsvaraktighet, 200 ms pulsrepetitionsperiod. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekt av PCD-fokuseringsgeometri inspelad med en utspädning på 20:1 av mikrobubblor i normal PBS. Körförhållandena var: 1,0 MHz, 0,50 MPa högsta undertryck, 3,0 ms pulsvaraktighet, 10 ms pulsrepetitionsperiod. A)Fullständigt spektra i genomsnitt över exponeringstiden och tre oberoende provrepetitioner. B)Effekt i 3, 4 och 5 MHz övertoner och(C)effekt i 2,5, 3,5 och 4,5 MHz ultraharmoniker. Tjocka linjer är provmedel, skuggade områden anger +/- 1 standardavvikelse. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Effekt av avgasade medier inspelade med PBS. A)Fullständigt spektra i genomsnitt över exponeringstid och fem oberoende provrepetitioner. B)Effekt i 3, 4 och 5 MHz övertoner och(C)effekt i 2,5, 3,5 och 4,5 MHz ultraharmoniker. Tjocka linjer är provmedel, skuggade områden anger +/- 1 standardavvikelse. Körförhållandena var 1,0 MHz, 0,50 MPa högsta undertryck, 1,0 ms pulsvaraktighet, 200 ms pulsrepetitionsperiod. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

parameter enhet minimum maximal
frekvens megahertz 0.02 15
tryck (toppnegativ) Mpa 0.1 20
pulslängd Cykler 1 Cw
tjänstecykel % 1 Cw
exponeringstid s 10 1000

Tabell 1: Sammanfattning av intervallet av rapporterade parametrar som underlättar sonoporation in vitro.

Discussion

De kritiska stegen för alla akustiska mätningar kapslades in av Apfel 198176 som "känn din vätska, känn ditt ljudfält, vet när något händer.". Inom ramen för detta protokoll omfattar dessa transduktorns kalibrering och inriktning samt stegen för vattenberedning och bubbelhantering. För det första är det viktigt att hydrofonen som används för att kalibrera körgivaren och/eller kretskortskortet själv är korrekt kalibrerad genom regelbunden extern service eller in-house jämförelse med en referensstandard. På samma sätt måste svaret från både körgivaren och PCD regelbundet karakteriseras för att kontrollera om utgången ändras och/eller att känsligheten går förlorad. Om körförhållandena och systemets känslighet är okända kommer det att vara omöjligt att härleda något meningsfullt samband mellan exponeringsförhållanden, bioverkningar och akustiska utsläpp. Direkt i samband med detta måste givarens anpassning till varandra och provkammaren kontrolleras noggrant för att säkerställa att exponeringsförhållandena i kammaren är som förväntat och att provtagningsvolymen för produktkontrollexemplarar motsvarar den region som är av intresse. Som nämnts kan temperaturen och gashalten i suspenderingsmediet påverka de slutliga resultaten avsevärt och konsistensen är extremt viktig i dettaavseende 77,78. På samma sätt kräver beredningen, karakteriseringen och hanteringen av kavitationsmedlet suspension mycket noggrann uppmärksamhet för att säkerställa att den förväntade storleksfördelningen och koncentrationen av partiklar finns i provet. Om koncentrationen av bubblor till exempel är för hög kommer det att finnas en effektiv avskärmning av provvolymen från det amerikanska incidentfältet. MB-agenter är särskilt mottagliga för förstörelse och sammanslagning och ytterligare vägledning om deras hantering kan hittas i Mulvana et. (2012)79.

Ett mycket vanligt problem med detektering av kavitationssignaler är att uppnå en adekvat SNR. Detta beror delvis på själva signalens art, som beskrivits, men kan också bero på källor till elektriskt brus inom den experimentella uppsättningen. Kontroll av anslutningarna mellan systemkomponenter, särskilt de som rör medaxiella kablar, kan bidra till att eliminera vissa av dessa. Byte eller reparation av medaxiella kablar kan vara nödvändigt. Att identifiera och ta bort eller inaktivera annan utrustning i laboratoriet, t.ex. pumpar som kan orsaka elektriskt brus, kan också hjälpa. Dålig elektrisk impedansmatchning mellan systemkomponenter kan vara ytterligare en orsak till dåligt signal-till-brusförhållande och även potentiellt skada på utrustningen och bör kontrolleras noggrant. De utlösande inställningarna på signalgeneratorn och oscilloskopet bör också kontrolleras för att bekräfta att de är konfigurerade på lämpligt sätt för experimentet och inte har återställts till tillverkarens standardinställningar. Om det finns betydande destruktion av bubblor under hanteringen, i händelse av SAT2, kan det vara bra att fästa en andra spruta på utloppsporten och använda denna för att försiktigt extrahera vätska från kammaren och därigenom dra in suspensionen. Detta kan också hjälpa till att eliminera makrobubblor eller möjliggöra flöde under amerikansk exponering, om så önskas.

Det är inte möjligt att helt eliminera akustiska reflektioner i provkammaren och därför kommer incidentfältet inte att vara helt enhetligt över hela provvolymen. Som nämns i steg 1.3.2 och 1.3.3 kommer överförbarheten av akustiska fönster att vara frekvensberoende och därför bör önskad bandbredd för akustiska utsläppsmätningar övervägas noggrant. I synnerhet kan det finnas betydande flera reflektioner av komponenter med högre frekvens. Detta är en annan anledning till att kalibreringen av fältet inom det helt monterade systemet är så viktig för att minimera osäkerheten i incidenttrycket. Lämplig gating av de inspelade signalerna bör också övervägas för att minimera effekterna av flera reflektioner. Användningen av kommersiella anordningar för bekvämlighet och behovet av akustisk öppenhet innebär att viss optisk transparens måste offras. Detta kan påverka kvaliteten på efterföljande avbildning, t.ex. för att bedöma cellens livskraft eller läkemedelsupptag. Några av de membran som används i kommersiella enheter är också porösa och därmed uppstår ofullkomlig isolering mellan provkammaren och det omgivande vattenbadet. Som ovan kan motsvarande risk för kontaminering minskas med hjälp av en mindre underkammare, vars innehåll regelbundet kan bytas ut. De cellkulturanordningar som anges i materialförteckningen är främst lämpliga för cellmonoskikt som kanske inte är representativa för vävnader i fråga om alla USA/kavitationsmedierade bioverk. Cellernas närhet till en fast yta kommer också att påverka MB-dynamiken på ett sätt som kanske inte återspeglar förhållandena in vivo, t.ex. Dessa begränsningar kan dock åtgärdas genom en enkel ersättning av alternativa vävnadsmodeller.

Syftet med att föreslå de högre säkerhetsmekanismerna är att tillhandahålla ett sätt att förbättra reproducerbarheten av akustiska exponeringsförhållanden och akustiska utsläpp mellan studier av usa-medierade bioverkningar, och på så sätt förhoppningsvis underlätta en bättre förståelse av de underliggande mekanismerna och utvecklingen av behandlingsövervakningsmetoder för att förbättra säkerheten och effektiviteten. Systemen är utformade för att vara kompatibla med kommersiellt tillgängliga cellkulturenheter, vilket gör det möjligt att utföra ett brett spektrum av biologiska analyser enligt intresse och möjliggöra prestanda för experiment med hög genomströmning, vilket tar bort behovet av tidskrävande anpassningsförfaranden mellan körningar. Genom att standardisera protokoll för karakterisering av exponeringsförhållanden och avskiljning av akustiska utsläpp kan den systemberoende variabiliteten förhoppningsvis minskas. Det intervall av parametrar som bör undersökas för ett visst experiment beror på tillämpningen (önskad bioeffekt, celltyp, målvävnadens djup om in vivo etc.) och arten av eventuella kavitationsmedel som används. Med tanke på det stora antalet variabler (AMERIKANSK frekvens, tryckamlitud, pulslängd, pulsrepetitionsfrekvens etc.) är det osannolikt att det är praktiskt genomförbart att utforska hela parameterutrymmet. En fördel med det föreslagna protokollet är att det gör det möjligt att snabbt upprätta vissa gränser för det här parameterutrymmet. Det gör det till exempel möjligt att fastställa det minsta tryck vid vilket en kavitationssignal genereras, det maximala tryck eller pulslängd som kan användas innan cellavlossning/död inträffar och det tryck vid vilket fraktionerade övertoner eller bredbandsbuller produceras. Det rekommenderas att en sådan uppsättning omfångsmätningar utförs som ett första steg i en studie.

Som presenterats är SAT utformad för realtidsövervakning av akustiska utsläpp, med biologiska analyser som utförs utanför experimentet. Det skulle dock vara relativt enkelt att ändra SAT för att möjliggöra direkt optisk observation av provkammaren via ett mikroskopmål. Detta kan i sin tur kopplas till ett fluorescens- och/eller höghastighetsmikroskopisystem för att möjliggöra observation av exempelvis läkemedelsupptag och bubbeldynamik. PCD-utgången som för närvarande presenteras när det gäller spänning indikerar: i) typerna av kavitationsbeteende och deras relativa proportioner; ii) hur länge dessa kavitationsbeteenden kvarstår; iii) Huruvida de observerade tids-kumulativa exponeringsegenskaperna är korrelerade med en viss bioeffekt. och iv) om de relativa nivåerna och tidsberoende beteenden överensstämmer med tidigare experiment i exponeringssystemet. Även om PCD:s känslighet för mottagning kan kvantifieras, krävs ytterligare rumslig information för att på ett tillförlitligt sätt karakterisera de akustiska utsläppen i form av absolut energi. Detta kan uppnås genom att ersätta PCD med en matrissond för att implementera passiv akustisk mappning (PAM)80. Detta skulle dock öka komplexiteten i signalbehandlingen och den beräkningstid och effekt som krävs.

Annan instrumentering för mätning av membranelektriell resistans eller tillämpning av fysiska inriktningsmetoder, till exempel magnetfält, skulle också kunna införlivas. Det skulle också vara möjligt att använda tredimensionella vävnadsstrukturer som tumörsfäroider, organoider eller till och med ex vivo-vävnadsprover på akustiskt "mjuka" gelsubstrat i stället för cellmonoskikten för att studera amerikanska och kavitationsmedierade effekter i mer realistiska vävnadsmiljöer.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Vetenskapsrådet för att ha stöttat detta arbete genom bidrag EP/L024012/1. VB stöds också av Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) och Medical Research Council (MRC) (grant EP/L016052/1). VB och AV tackar Clarendon Foundation för Post Graduate Scholarships. AV tackar också Exeter College för ett Santander-stipendium. Författarna står i skuld till James Fisk och David Salisbury för deras ovärderliga hjälp vid tillverkningen av apparaten. De erkänner också tacksamt dr Dario Carugos och Joshua Owens bidrag i utvecklingen av tidigare prototyp-SAT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems - An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , Springer. (2018).
  2. Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
  3. Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
  4. Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
  5. Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
  6. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  7. Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  8. Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
  9. Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326 (2019).
  10. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  11. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
  12. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321 (2019).
  13. Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365 (2017).
  14. de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
  15. Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  16. Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
  17. Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
  18. Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
  19. Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
  20. Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
  21. Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
  22. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  23. De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
  24. Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
  25. Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
  26. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
  27. Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
  28. Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
  29. Li, Z. G., Liu, aQ., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  30. Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104 (2014).
  31. Suslick, K. S. Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , VHC Publishers. New York. (1988).
  32. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
  33. Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
  34. Park, J., Lee,, et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96 (2019).
  35. Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
  36. Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation - the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
  37. Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
  38. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  39. Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
  40. Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
  41. You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200 (2016).
  42. Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
  43. Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
  44. Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  45. Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
  46. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  47. Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
  48. Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
  49. Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
  50. Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184 (2018).
  51. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
  52. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
  53. Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
  54. Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
  55. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
  56. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  57. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
  58. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  59. Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
  60. Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
  61. Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
  62. Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
  63. Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
  64. Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  65. Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
  66. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109 (2018).
  67. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  68. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
  69. Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
  70. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  71. Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , Wiley. ISBN: 0-471-84789-5 (2000).
  72. Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
  73. Stoica, P., Moses, R. Spectral Analysis of Signals. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2005).
  74. Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
  75. Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
  76. Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
  77. Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
  78. Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
  79. Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
  80. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Tags

Återkallelse utgåva 170 ultraljud mikrobubblor läkemedelsleverans bioeffektiva kavitation sonoporation terapiövervakning passiv akustisk kartläggning
Studera kavitation förbättrad terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans,… More

Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans, V., Stride, E. Studying Cavitation Enhanced Therapy. J. Vis. Exp. (170), e61989, doi:10.3791/61989 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter