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Bioengineering

캐비테이션 강화 치료 연구

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/61989
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

제시된 실험 프로토콜은 성공적인 약물 전달 및/또는 기타 생체 효과에 필요한 조건의 조사를 가능하게 하기 위한 목적으로 세포 배양 장치에서 캐비테이션 활성의 실시간 측정을 수행하는 데 사용될 수 있다.

Abstract

초음파의 치료 응용에 대한 관심은 암에서 알츠하이머 병에 이르기까지 잠재적 인 임상 목표와 함께 중요하고 성장하고 있습니다. 초음파 분야 내의 기포의 형성과 후속 운동인 캐비테이션은 이러한 치료법의 대부분을 뒷받침하는 중요한 현상을 나타냅니다. 그러나 캐비테이션이 치료 효과를 촉진하고 임상적으로 구현될 수 있는 신뢰할 수 있는 모니터링 기술을 개발할 필요가 있는 행동의 상세한 메커니즘에 관한 상당한 불확실성이 남아 있습니다. 특히, 치료 효과와 그에 상응하는 음향 방출을 성공적으로 전달하는 것으로 보고된 노출 파라미터의 연구 사이에는 상당한 차이가 있다. 이 논문의 목적은 캐비테이션 매개 생체 효과에 대한 연구를 수행하기 위해 널리 사용되는 구성 요소를 사용하여 설계 지침과 실험 프로토콜을 제공하고 실시간 음향 모니터링을 포함하는 것입니다. 이 프로토콜은 음향 모니터링을 치료 초음파 실험에 보다 광범위하게 통합할 수 있게 되어 노출 조건 및 관련 바이오 효과의 상관 관계에 대한 연구를 통해 쉽게 비교할 수 있기를 바랍니다.

Introduction

초음파 (미국)는 안전하고 비 침습적 성격, 환자의 침대 옆에서의 구현 용이성 및 비용 효과1때문에진단 영상 기술로 널리 사용되어 왔다. 진단 및 모니터링 기능 옆에, 미국은 치료 응용 프로그램에 대한 상당한 잠재력을 가지고있다. 초기 연구는 혈전용, DNA 형질, 약물 전달2,3,4 및 치료 미국에서의 사용을 탐구하여 종양 치료5,6,7,면역 요법8,9,혈액 뇌 장벽 (BBB) 중단10,11,12,혈전리13,14,15, 15세균 성,16감염 및 16 세균 성 감염 및 16 세균 성 감염 및 16 감염및 16 세균 성 감염 및 16 .17의 약물 치료 및 치료 학적 영역을 나타냅니다. 이러한 응용 분야의 핵심 현상은 캐비테이션입니다: 유체압력(18,19)의변화로 인한 기체 충치의핵형성,성장 및 진동.

캐비테이션이 생물학적 효과를 생성하는 메커니즘의 범위가 있습니다. 예를 들어, 적용된 미국 필드의 영향으로 버블 진동의 고도로 비선형적 특성은 약물대류(20)를 강화하고 기포 부근의 조직에 전단 응력을 발휘할 수 있는 주변 액체에서 마이크로스트리밍을 생성할 수 있다. 이는 특히 기포가 경계 부근에 있을 때 널리 퍼져 있어 비구체를 진동시키는 거품을 일으키고, 전단 유도 투과화를 통해 잠재적으로 약물 섭취를 촉진할 수있다(21,22,23,24). 고압에서는, 더 큰 진폭 진동 및 급속한 기포 붕괴가 관찰되고, 직접 기계적응력(25)을 부여하고 자주 충격파를 생성하고, 결과적으로 조직을 방해하고 투과할 수 있는 큰 압력그라데이션(26,27)이관찰된다. 표면 근처의 기포가 붕괴되면 고속 액체 마이크로제트28,29,30이형성될 수도 있다. 이 마이크로제트는 조직을 관통할 수 있으며, 잠재적으로 모공을 만들거나 이차 스트레스 파31,32를유도할 수 있다. 조직 및 세포 수준에서 생물학적 막의 투과화는 다양하게 소노포레시스라고 하며, 주로 피부 투과성33,34,및 sonoporation의 미국 유도 향상의 맥락에서 주로 사용되는 소노포레시스로 불리며, 주로 막 기공35,36의형성으로 인한 세포막의 가역적 투과화를 설명하기 위해 주로 사용된다.

진동 거품을 둘러싼 액체의 점성 흡수는 상당한 가열 효과를 생성 할 수있습니다 (37). 또한, 고도로 비선형 진동은 구동 미국 필드보다 높은 주파수에서 음향 방사선을 생성합니다. 이것은 주변 조직에서 증가한 흡수와 추가 가열38로이끌어 냅니다. 버블 붕괴는 또한 고도반응성 종 및 전자기 방사선의 생성과 같은 버블 코어의 일시적인 고온 및 압력으로 인한 화학적효과(32)를수반할 수 있다. 이러한 효과는전달을 위한 관련 세포 경로의 잠재적 손상 및/또는 활성화를 평가하기 위해 조사되었으며, sonodynamic 치료40,41,42,43로알려진 접근 방식으로 빛에 민감한 약물의 국소 활성화에 악용되었다.

많은 미국 매개 생체 효과는 미국 필드 파라미터(압력 진폭, 주파수, 펄스 길이 및 반복 주파수 및 노출 기간)의 제어를 통해서만 개시될 수 있지만 생물학적 조직에서 캐비테이션을 안정적으로 생성하려면 종종 높은 입력 에너지가 필요하므로 손상 위험이 높아집니다. 외인성 또는 인공 캐비테이션 핵의 도입은 위에서 논의한 광범위한 효과를 생성하는 데 필요한 입력 에너지를 실질적으로 감소시킬 수 있으며, 미국과단독으로는 불가능할 수 있는 추가 효과를 추가로 소개한다. 캐비테이션 핵은 가스기포(26,44,액체 물방울45,46,47, 고체 입자48,49,50)및 나노스케일 캐비테이션 핵을 장기간 순환 시간, 개선된 사치화 및 장기간 캐비테이션 활동49,51,52,53을포함한다.

가장 일반적으로 사용되는 핵은 원래 진단 이미징에서 조영제로 사용되는 가스 마이크로 버블 (MBs)입니다. 그(것)들은 전형적으로 직경에 있는 1-2 마이크로미터이고 주변 매체에 있는 낮은 수성 용해도를 가진 고분자 중량 가스의 심을 포함합니다. 코어는 가장 일반적으로인지질(54)으로구성된 보호 지질, 단백질 또는 폴리머 쉘에 둘러싸여 있다. 미국 분야에 노출되면 MB의 압축성은 체적 진동을 겪게 하여 강력한 음향 산란을 일으키며, 이는 대조제인 MB의 성공을 책임집니다. 언급했듯이, 이러한 진동은 또한 치료 응용 분야에서 활용할 수 있는 전술한 기계적, 열 및 화학적 효과로 이어진다. MB 코팅 공정은 또한 MB 구조 내에서 약물을 캡슐화하고 약물을 MB 표면에 부착 및/또는 표적화하는 메커니즘을 제공합니다. 이 기술은 전신 독성을 줄이기 위해 약물의 트리거 방출을 용이하게55. 또한 최근에는 MB 표면의 물질이 생물학적 구조로 옮겨져 소위 "sonoprinting"56,57,58을통해 약물 전달을 강화하는 것으로 나타났다.

미국 중재 된 캐비테이션 활성의 모니터링은 시험관 내 및 생체 내 의 결과 생물학적 효과에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적으로 이러한 효과의 튜닝 및 최적화를 허용합니다. 캐비테이션 활성을 모니터링하기 위한 가장 널리 적용되는 두 가지 방법은 i) 광학으로, 초고속 비디오 현미경을 사용하고 일반적으로 생체 내에서는 실현 가능하지 않으며, ii) 음향은 진동 및/또는 붕괴기로 생성된 재방사음 필드를 기록한다. 음향 신호의 진폭 및 주파수 구성 요소 모두 버블 거동에 대한 정보를 포함합니다. 낮은 시중 미국 진폭에서 낮은 농도의 거품은 주로 고조파 배출 (운전 주파수의 정수 배수)을 생산하는 것으로 나타났다59. 운전 압력이 증가함에 따라, 거품 방출 스펙트럼은 또한 관성 캐비테이션을 나타내는 광대역 소음뿐만 아니라 더 강한 비선형 동작을 나타내는 서브 하모닉 및 초하모닉(60)으로 알려진 분수 구성 요소를 포함 할 수 있습니다. 정수 고조파는 거품 진동의 주요 지표이지만 비선형 전파로 인해 실험 시스템의 어느 곳에서나 비선형으로 인해 발생할 수도 있습니다. 대조적으로, 분수 고조파 및 광대역 잡음은 매우 강하게 거품 역학과 상관 관계가 있습니다.

발포거동과 검출된 음향 방출 사이의 관계는 미국 의 발병 현장, 핵형성 환경 및 검출경로(60)의특성을 포함하는 요인에 의해 복잡해질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 음향 스펙트럼에서 주파수와 에너지의 분별 동향에 의해 거품 행동과 세포와의 상호 작용에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 이러한 데이터는 또한 임상 치료 모니터링 기술의 기초를 형성하는 데 사용할 수있는 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다. 이 정보를 완전히 활용하려면 강력하고 번역 가능하며 재현 가능한 실험 방법을 개발해야 합니다.

현재 시스템을 설계하고 캐비테이션 지원 요법의 개발을 지원하기 위한 연구를 수행하기 위한 보고된 프로토콜에 상당한 변화가 있습니다. 장치의 관점에서, 디자인 접근의 범위는 착수되었습니다. 여러 그룹은 병렬 플레이트챔버56,61,62,63,사용자 정의 내장 또는 시판 용 (예 : 옵티셀, ThermoFisher 과학)을 사용했습니다. Hu et al. (2013)는 미국 초음파 모듈 및 실시간 공초점 이미징64,카루고 외와 결합된 세포 챔버를 개발했다. (2015) 미국 노출65동안 수조에 침을 수있도록 맞춤형 PDMS 뚜껑이 있는 시판가능한 세포 배양 접시를 포함하는 시스템을 사용했으며, 페레노 외(2018)는 다이나믹 버블및 버블셀상호작용의동시 광학 및 음향 특성화를 허용하는 층층형 공진기로 구성된 장치를 사용했다. 맞춤형 제작 및 응용 분야별 설계를 사용하면 미국 분야 및 기타 환경 노출 조건의 특성화가 복잡해교차 학습 비교가 어려워지므로 더욱 복잡해지고 있습니다. 예를 들어,0.02~15MHz의 중심 주파수, 1%에서 연속파까지의 중부하, 0.1~20MPa23,64,67,68,69,70(표 1)에이르는 희귀압력 등 성공적인 음포화를 달성하기 위해 확인된 미국 파라미터의 상당한 변동이 있다. 특정 생체 효과와 연관된 것으로 확인된 스펙트럼 성분(고조파, 하위 고조파 등)도 유사하게 상당한 변동이 있다.

따라서 이 작업의 목적은 캐비테이션 모니터링 기능의 특정 포함과 함께 캐비테이션 유도 세포 생물제의 체외 연구를 위한 쉽게 재현 가능한 시스템 설계 및 구현 프레임워크를 제공하는 것이다.

Protocol

1. 시스템 설계 원칙

참고: 이 섹션에서는 미국 노출 및 캐비테이션 모니터링을 위한 시스템을 만드는 데 사용되는 설계 원칙을 제시합니다. 이러한 원칙은 음향 형질 전환 (SAT)에 대한 두 개의 기존 시스템으로 설명됩니다 (그림 1에도시됨). 각 시스템은 셀 노출 구획, 미국 소스 및 패시브 캐비테이션 검출기(PCD)로 작동하는 단일 요소 변환기로 구성되며, 모두 벤치탑 테스트 챔버에 통합됩니다. 이러한 설계는 카루고 외(2015)65에기술된 이전 시스템 개발을 기반으로 합니다.

  1. 사용 편의성을 극대화합니다.
    1. 기존 상용 세포 배양 장치를 종향/성장 기판으로 사용하여 기존 배양 기술 및 이미징 시스템과 호환되는 세포 노출 구획을 만듭니다.
      1. SAT2의 경우, 문화 접시(직경 35mm, 직경 21mm 면적을 관찰할 수 있는 것)를 사용하십시오.
      2. SAT3의 경우 트랜스웰 인서트(직경 6.5mm, 재료 표 참조)를사용합니다. 트랜스웰은 투과성 멤브레인을 가지고 있으므로 물보다는 세포 매체에 배치해야합니다.
  2. 셀 노출 구획의 신속한 하중 및 밀봉을 지원합니다.
    1. 배양 접시 위에 유연한 폴리머 뚜껑을 프레스하여 SAT2 세포 노출 구획을 형성한다(Carugo et al. 201565). 도 1C에서볼 수 있듯이 뚜껑에는 18G 무딘 바늘 주사기로 구획을 채울 수 있는 1.2mm 직경 구멍이 있습니다. 충전 후, 짧은 플라스틱 막대(재료의 표)로이러한 충전 포트를 밀봉합니다.
    2. 주사기 나 파이펫으로 SAT3 구획을 채우고 고무 스토퍼 / 붕을 눌러 밀봉하십시오.
    3. 밀폐된 셀 노출 구획을 시험 챔버에 신속하게 적재할 수 있습니다. 셀 노출 구획에 대한 홀더는 챔버 뚜껑에 내장되어 있어 가벼운 프레스 핏이 적절한 정렬을 보장하기에 충분합니다. 도 1에표시된 시스템을 사용하면 여러 셀 노출 구획이 미리 준비되었을 때 샘플 변경 시간이 20초만큼 짧을 수 있습니다.
    4. 시스템이 이식 가능하고 필요한 물/매체의 양을 최소화할 수 있도록 챔버 내부 볼륨을 최소화합니다. 이렇게 하면 우발적인 유출이나 캐비테이션 에이전트가 셀 노출 구획에서 누출되어 복구가 가속화됩니다.
      참고: SAT2 내부 볼륨은 약 0.8L입니다. SAT3 내부 볼륨은 약 7.6L로 소스 트랜스듀서 또는 구성의 간편한 로딩 및 변경을 수용할 수 있도록 더 크게 제작되었습니다. 0.3L의 내부 챔버를 첨가하여 일회용 부피를 최소화하고 탱크 채우기 물(예를 들어, 세포 배양 매체)이 아닌 생물학적으로 관련된 유체를 사용할 수 있도록 하였다. 내부 챔버 바닥은 최대 음향 전송을 허용하기 위해 30 μm 두께의 마일라 시트로 만들어집니다.
    5. 가능한 경우 챔버와 내부 구성 요소를 광학적으로 명확한 재료로 만들어 모든 문제(예: 누수, 포획된 매크로버블)를 신속하게 관찰하고 해결할 수 있도록 합니다.
  3. 노출 구획의 음향 형무성을 극대화합니다.
    1. 구획 벽 재료와 두께의 선택을 통해 투명도를 극대화합니다. 벽의 양쪽에 있는 액체가 본질적으로 동일하다는 가정하에(예를 들어, 물), 정상 발생 압력 전송 계수계수(71)의 크기는 다음과 같습니다.
      Equation 1, λ가 두께 L의벽에 파장인 Equation 2 경우, 및 zL 및 zo는 벽 재료 및 액체에 대한 특징적인 임피던스(밀도 및 음속의 제품)이다. T = 1은 완벽한 변속을 나타냅니다.
    2. 캐비테이션(예를 들어, 1-8MHz)의 광범위한 스펙트럼 모니터링을 위해 대부분의 실험실 폴리머(예: PDMS, PTFE, 폴리스티렌)는 재료의 두께가 재료내파장의 1/10th 미만인 경우 전염 압력을 10% 이하로 변화시킬 것이다. 이러한 조건은 높은 주파수(예: 8MHz의 #1.5 커버슬립)에서 표준 소모품을 충족하기 어려울 수 있으므로 전송 주파수 응답을 예측하거나 직접 보정하는 것이 좋습니다.
    3. 미국 소스 신호를 세포 노출 구획으로 좁은 대역 전달의 경우, 층 재료에서 반 파장의 정수 다중인 경우 두꺼운 층을 허용한다. 예를 들어, SAT2의 PDMS 뚜껑은 2.0mm(1MHz에서~2파장, cPDMS ~ 1000m/s)의 두께로 사용됩니다.
  4. 소스 및 셀 환경 의 선택을 통해 노출 영역을 최대화합니다.
    1. 노출 된 세포의 수를 최대화하려면 사용 가능한 배양 및 이미징 장비와의 호환성을 유지하면서 셀 부착 영역을 가능한 한 넓게 만듭니다.
    2. 큰 집중 된 소스 (SAT2)의 사전 초점 영역 또는 세포 부착 영역 (SAT3)의 직경과 일치하는 주 엽 폭을 가진 집중 또는 렌즈 소스를 사용하여 최소한의 공간 가변성을 가진 세포 부착 영역을 가로 지르는 필드를 가진 미국 소스를 사용합니다. 특정 소스에 대한 재료 표를 참조하십시오.
    3. 입사 장의 가장 강한 부분에서 멀리 떨어진 셀 컴파트먼트를 기계적으로 지지하거나 홀더의 산란 단면을 최소화하거나 홀더에 흡수 재료를 배치하여 셀 컴파트먼트 홀더에 의해 도입된 현장 복잡성을 최소화한다. 예는 그림 1A 및 1D에표시됩니다.
  5. 반복 가능한 노출 조건을 보장합니다.
    1. 고정 된 경계에서 음향 필드를 종료하여 부분적으로 채워진 챔버의 공기 물 인터페이스에서 발생할 수있는 가변성을 제거합니다. SAT2 및 3에서는, 이것은 경계 반사에서 발생할 수 있는 필드 복잡성을 감소시키는 추가 이점을 가진 실내 뚜껑에 음향 흡수제(재료표참조)를 설치함으로써 달성된다.
    2. 경미한 가변성 또는 주요 오작동을 신속하게 감지할 수 있도록 증폭기 출력/소스 입력에서 소스 드라이브 전압을 모니터링하고 기록합니다. 관심 있는 드라이브 전압 범위에서 사용하기에 안전한 전압 프로브 또는 기타 장치를 사용합니다. 파형 발생기와 같은 잘 알려진 소스를 사용하여 전압 프로브의 교정을 주기적으로 확인합니다.
    3. 챔버의 온도와 그 내용을 제어, 모니터링 및 기록합니다. 세포, 트랜스듀서 및 전파 매체의 반응은 모두 온도에 민감할 수 있다. SAT2에서는 수중 컨디셔닝 시스템에 연결된 순환 포트 한 쌍으로 모니터링 및 제어를 수행하며 SAT3은 수족관 히터(도시되지 않음)를 사용합니다. 치료 적용을 위한 관련 생리학적 조건을 모방하기 위해 필요에 따라 수온을 설정합니다.
      참고: 내부 온도는 외부 요인의 결과와 트랜스듀서와 매체의 미국 생성 된 가열로 인해 모두 변경 될 수 있습니다.
    4. 조립 경로의 기존 기포에서 의도하지 않은 캐비테이션 및/또는 산란가능성을 최소화하기 위해 챔버 액체를 조심스럽게 탈착합니다.
      참고: 탈기가 수행되지 않는 경우, 예를 들어 세포에 대한 부정적인 영향으로 인해, 그 때 적합한 거품 활동의 향상된 배경 수준이있을 것이다.
  6. 완전히 조립된 시스템을 보정합니다.
    1. 셀 노출 구획을 포함하여 모든 시스템 구성 요소가 제자리에 있을 때 노출된 셀에 대한 압력 필드 사고를 측정하는 수단을 포함한다. SAT2 및 3에서는, 이것은 측정될 필드를 방해하지 않고 바늘 또는 광섬유 수압기를 삽입할 수 있는 챔버 뚜껑에 있는 개구부로 달성된다. 셀이 있는 위치에 가능한 한 가깝게 측정합니다.
    2. 감지 된 반지름(rcv)이있는 하이드로폰을 선택하면 측정되는 압력 필드를 잘못 보고하지 않을 만큼 작습니다. 허용 크기는 소스주파수(f)및반지름(src)뿐만아니라 소스와 필드 스캔(zrcv)사이의 거리의 함수이다. 하이드로폰 크기 선택에 대한 일반적인 기준은 다음과 Equation 6 입니다. Equation 7
    3. 1.6절에 지정된 온도를 포함하여 시스템 특성화에 사용되는 조건하에서 하이드로폰을 보정해야 합니다. 특히, 하이드로폰이 스캔 평면과 관련하여 각도로 유지되는 경우, 지향성 효과는 형상에 기초하여 예상되는 것과 크게 다를 수 있기 때문에 하이드로폰을 해당 각도로 보정해야 합니다. 온도와 관련하여 하이드로폰 감도의 변화는 제조업체에서 사용할 수 있어야합니다.
    4. 세포가 노출될 수 있는 전체 영역을 스캔합니다. 적절한 수준의 필드 디테일을 캡처하려면 가장 높은 관심 주파수에서 파장의1/5보다 거친 간격을 검사합니다. 예기치 않은 필드 복잡성이 관찰되는 경우, 직접 및 산란된 필드 기여도의 식별 및 정량화를 허용하기 위해 짧은 버스트 신호(예: 1-3 주기)를 사용하는 것이 좋습니다.
  7. 캐비테이션 모니터링 기능을 통합합니다.
    1. 모니터링 트랜스듀서 유형 및 배치를 개조가 아닌 전체 시스템의 설계의 일부로 결정합니다. 실제로 중요한 시스템 구성 요소를 안정적으로 정렬할 수 있는 기능을 희생하지 않고 최대 컴팩트한 시스템으로 이어집니다.
    2. 캐비테이션 모니터링 장치를 시스템에 배치하여 최소한의 추가 설정 시간 또는 워크플로우방해로 반복배치할 수 있습니다. SAT2에서는 챔버 뚜껑에 장착된 PCD 역할을 하는 단일 요소 압전 트랜스듀서로 수행되며 SAT3은 PCD를 90° 리플렉터를 사용하여 소스 베이스에 통합합니다.
    3. 실험의 목표에 따라 PCD 셰이프를 선택합니다. 도 2에서,초점이 맞지 않는(왼쪽)과 집중(오른쪽) 장치의 반 진폭 윤곽의 계산은 주파수에 대하여 공간 감도의 심오한 차이를 보여준다. 초점을 맞추지 않은 장치는 주파수와 관련하여 적당한 공간 적 변화와 함께 대량 모니터링에 더 적합하며, 집중 된 장치는 관심의 주파수에서 보다 복사 컴팩트한 측정에 더 적합합니다.
    4. 실험의 요구에 맞게 PCD 센터 주파수 및 대역폭을 선택합니다. 중심 주파수는 일반적으로 직접 소스 배출에 대한 민감도를 최소화하기 위해 미국 원천의 5배 이상으로 선택됩니다. 대역폭은 일반적으로 광범위한 버블 동작(고조파 및 광대역 노이즈)을 관찰하기 위해 최대화됩니다.
    5. 다음 섹션에 설명된 대로 캐비테이션 데이터를 분석할 수 있도록 컨디셔닝, 기록 및 처리 방법을 선택합니다.

2. 캐비테이션 모니터링을 위한 계측 및 처리

참고: 이 섹션에서는 캐비테이션 모니터링 데이터 수집에 권장되는 신호 흐름 구성 요소 및 기능과 캐비테이션 활동의 정성적 및 정량적 평가로 이어지는 데이터 처리를 제공합니다.

  1. 계측(그림 3참조).
    1. 응용 프로그램이 사용자 지정 장치를 요구하지 않는 한 일반적으로 침수 대상의 비파괴 테스트를 위해 판매되는 상용 단일 요소 변환기의 광범위한 범위에서 PCD를 선택합니다. 이러한 공급업체에는 케이블 및 액세서리(예: SAT3의 미러 리플렉터)도 있습니다.
    2. 미국 소스에 대한 PCD 응답을 최소화합니다. 이는 PCD(중앙 주파수 및 대역폭)를 선택하여 노치 또는 하이패스 필터를 사용하여 모두 수행할 수 있다. 후자는 독립 실행형 모듈또는 신호 컨디셔닝 장치의 일부로 구현할 수 있습니다.
    3. 큰 다이나믹 레인지(최소 12비트)의 디지타이저를 사용하여 가장 작은 신호의 높은 신호 클리핑 및 최대 신호 대 노이즈 비율(SNR)의 가능성을 최소화하면서 가능한 한 많은 데이터를 캡처합니다. 장치를 비교할 때 신호 사양을 노이즈 및 왜곡 및/또는 유효 비트 수에 대해 검토합니다. 또한 메모리 버퍼의 크기가 원하는 길이및 데이터 캡처 속도에 충분한지 여부를 고려합니다.
    4. 디지타이저의 동적 범위 사용을 최적화합니다. PCD 신호는 긴 노출(거품이 제거됨에 따라) 및 다양한 미국 드라이브 수준에서 실험을 실행하는 경우 모두 여러 수의 크기를 커버할 수 있습니다. 따라서 신호 컨디셔닝 체인이 모든 신호를 조정하여 제대로 기록할 수 있는지 확인해야 합니다.
    5. 신호 체인에 프리앰프를 포함하여 예상되는 가장 작은 신호를 적절하게 캡처할 수 있도록 합니다. 우리의 경험에서 PCD 자기 잡음은 대부분의 디지털화보다 훨씬 낮기 때문에 예 : <100x)의 적당한 정도는 여전히 최종 결과의 SNR을 향상시킬 수 있습니다.
    6. 증폭기 의 포화를 피하기 위해 사전 증폭 전에 미국 소스 주파수를 필터링합니다.
    7. 미국 펄스/수신기가 게인 및/또는 필터링 기능을 제공하는 데 사용되는 경우 펄스 모드로 사용하여 경로 길이/정렬을 확인하거나 PCD와 셀 노출 구획 사이의 전파 경로에서 예기치 않은 산란기를 확인합니다.
    8. 스토리지에 대한 데이터를 실시간으로 스트리밍할 수 있습니다. SAT2 및 SAT3 시스템은 모두 휴대성과 잘 구축된 사용자 인터페이스의 편리함을 갖는 12비트 스트리밍 USB 오실로스코프(재료 표참조)를 사용합니다.
    9. 게인 또는 대역폭 오류를 방지하기 위해 신호 체인에서 적절한 임피던스 일치를 확인합니다. PCD 장치는 일반적으로 50 옴 근처의 출력 임피던스를 가지고 있으므로 적합한 과정은 PCD를 파형 발생기(50옴 출력 임피던스)에서 알려진 신호로 대체하고 디지털화기에 나타나는 신호 크기가 기대와 일치하고, 주입된 신호가 변경될 때 선형적으로 비늘을 가지며, 가장 큰 관심 신호에 대해 클리핑이 관찰되지 않는다는 것을 확인하는 것입니다.
  2. 사전 처리
    1. 관심 있는 주파수 범위에서 데이터 처리와 관련된 신호 경로에서 알려진 모든 이득 및 민감성에 대한 원시 전압 신호를 수정합니다.
    2. 데이터가 DC 입력 커플링으로 기록되거나 DC 오프셋이 표시되는 경우 직접 빼기 또는 높은 패스 필터로 이 오프셋을 제거합니다.
  3. 기록된 각 신호의 전력 스펙트럼 P를 계산합니다.
    1. 미국 소스 f0의 기본 주파수가 변환 빈 폭의 큰 정수 배수되도록 Fourier 변환 길이 Nft를 설정: Nft =   nfs/f0,여기서 n정수 및 fs는 디지털화된 데이터의 샘플 주파수이다. 스펙트럼 특징을 명확하게 캡처하기 위해 n ≥ 50을 설정합니다. 50MHz에서 샘플링된 1MHz 기본 샘플의 예로, Nft는 2500이고 빈 폭은 0.02MHz입니다.
    2. 변환 길이 Nft는 일반적으로 기록된 신호의 지속 시간보다 작기 때문에 웰치의방법(73)과같은 전력 스펙트럼 밀도(PSD) 추정기를 사용합니다. f1-f2에 걸친 주파수 대역의 전력은 Equation 13 dF가 변환 빈 폭입니다.
    3. 각 노출 시 버블 활성을 특성화하려면 f0의 정수 배수(고조파), f 0/2(초하모니),광대역 노이즈(관성 캐비테이션)의 정수 배수에서 전력 스펙트럼에 대한 기여를 추정합니다.
    4. 고조파 및 초하모닉 콘텐츠는 특정 주파수에서 전력 스펙트럼 값을 선택하여 가장 간단하게 추정됩니다. 그러나 큰 진폭 색조 응답은 소수의 인접 주파수 저장소(예: f0 ± 2-3)로 확산될 수 있으므로 좁은 대역 전력 계산에 포함되고 광대역 계산에서 제외되어야 합니다.
    5. 총 전력 스펙트럼에서 고조파 및 초하모닉 기여도를 빼서 광대역 대역 캐비테이션 전력을 추정합니다. 또는 이러한 기여도는 보다 정교한 사전 처리74를사용하여 추정될 수 있다.
    6. 스펙트럼 피쳐/버블 활동 유형에 따라 노출 기간 동안 누적 캐비테이션 신호 에너지를 추정한다.
    7. 모든 데이터 레코드가 동일한 기간 Tr을가지고 있다고 가정하면 기록된 데이터의 누적 에너지는 Equation 15 M이 레코드 수를 나타내는 곳입니다.
    8. 기록 사이에 간격이 있는 경우, 노출이 연속될 때 발생할 수 있으며, 저장된 파일이 총 노출 기간 Te의일부를 캡처할 때, 누적 에너지는 Equation 16
    9. 스펙트럼 레벨을 비교하여 미국 이없는 경우 기록된 배경 잡음의 측정 SNR을 추정합니다.

3. 실험 프로토콜

  1. SAT 준비
    1. -105 Pa의 압력하에서 채우기 액체(일반적으로 여과된 물)를 적어도 2시간 동안 의 압력하에서 탈착하여 전파 경로에서 캐비테이션의 가능성을 최소화한다. 산소의 부분 압력이 10 kPa 이하라는 용존 산소 프로브확인이 권장됩니다.
    2. 시험 챔버를 천천히 채우고 기락액에 공기의 재도입을 최소화합니다. 필요한 경우 채워진 챔버를 계속 탈퇴하십시오.
    3. 노출 실험을 시작하기 직전에 충전 직후와 다시 트랜스듀서 및 미디어 용기 표면에서 잔류 기포를 모두 제거합니다.
    4. 노출 실험을 시작하기 전에 챔버의 온도와 내용물이 안정화되었는지 확인하십시오.
    5. 미국 소스 전원 증폭기가 예열(제조업체 권장 량당)을 예열하여 시간에 따라 게인 및 출력이 안정되도록 합니다.
  2. 노출 구획 준비
    1. 캐비테이션 에이전트 서스펜션
      1. 캐비테이션 제를 희석할 때, 매크로버블을 가두거나 에이전트를 파괴하지 않고 균일한 서스펜션을 만들기 위해 부드럽고 지속적으로 저어줍니다(특히 껍질이 있는 경우).
      2. MB와 함께 작업할 때, 로딩공정(75)에서파괴를 최소화하기 위해 사용할 수 있는 가장 큰 게이지 바늘을 사용하여 천천히 철수하고 분배한다. SAT 시스템에서는 18G 무딘 필 바늘이 정기적으로 사용되었습니다.
  3. SAT2 준비
    1. 라이브 셀 실험에 사용하기 전에 PDMS 뚜껑을 살균하십시오.
    2. PDMS 뚜껑을 배양 접시에 끼여 프레스하여 셀 노출 구획을 형성한다.
    3. 18G 무딘 바늘로 주사기를 준비하고 약 10mL의 액체(예: MB 서스펜션 또는 물 제어)로 채웁니다.
    4. PDMS 채우기 구멍 중 하나를 통해 바늘을 삽입하고 천천히 챔버를 채우기, 매크로 버블오픈 채우기 구멍을 통해 탈출 할 수 있도록 기울어. 최상의 결과를 얻으려면 챔버를 기울여 구멍이 채우기 구멍 위에 있도록 합니다.
    5. 충전시 짧은(4-5mm) 폴리머 로드를 삽입하여 열린 구멍을 닫습니다. 두 구멍이 수평되도록 어셈블리를 설정합니다.
    6. 공기가 유입되지 않도록 여분의 유체를 주입하는 동안 무딘 충전 바늘을 제거합니다. 다른 폴리머 로드로 구멍을 닫습니다. 이 프로세스는 셀 노출 구획의 밀봉을 완료합니다.
    7. 구획을 시각적으로 확인하여 포획된 매크로버블의 증거를 확인하고, 발견되면 3.3.3.-3.3.6을 반복하십시오.
    8. 셀 노출 구획을 구획 홀더에 고정합니다. 챔버 뚜껑을 챔버 위에 설치합니다. 뚜껑을 수평으로 낮추면 매크로버블이 침수된 부품(흡수기, 홀더)에 놓지 못하게 됩니다.
    9. 세포 노출 구획의 방향을 결정할 때 현탁액에 있는 입자의 부력을 고려하십시오(예를 들어, 부동 기포 또는 가라앉는 나노 입자) 이것이 세포와의 접촉에 어떤 영향을 미치는지 고려하십시오.
    10. 모든 작업에서, 세포 성장 표면의 굴곡과 세포의 분리를 최소화하기 위해 가능한 한 적은 힘을 사용합니다.
  4. SAT3 준비
    1. 약 150μL의 액체(예: MB 서스펜션 또는 물 제어)로 트랜스웰을 채웁니다.
    2. 고무 플러그로 트랜스웰을 조심스럽게 밀봉하고 깨끗한 종이 타월로 오버플로액을 제거하거나 닦아 세포 노출 구획을 형성합니다. 라이브 셀실험에 사용하기 전에 고무 플러그를 살균하십시오.
    3. 시각적으로 포획 매크로 버블의 증거를 확인하고, 발견되면, 플러그를 제거하고 매크로 버블을 제거하고 4.4.2를 반복합니다.
    4. 셀 노출 구획을 구획 홀더에 고정합니다. 챔버 뚜껑을 챔버 위에 설치합니다. 뚜껑을 수평으로 낮추면 매크로버블이 침수된 부품(흡수기, 홀더)에 놓지 못하게 됩니다.
      참고: 위에서 언급했듯이 매크로 버블은 미국 노출 실험에 대해 반복할 수 없는 잠재적으로 해로운 다양한 영향을 줄 수 있습니다. 가장 비판적으로, 세포 노출 구획에 갇힌 매크로 버블은 의도된 처리를 대표하지 않는 PCD 반응 및 국부 세포 생물효과를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 미국 실험을 시작하기 전에 항상 모든 시스템 구성 요소를 시각적으로 검사하여 매크로버블을 찾아 제거합니다.

4. 데이터 수집

  1. 제어 액체(예: 탈가스물 또는 세포 매체)로 채워진 세포 노출 구획으로 초기 실험을 수행하여 배경 PCD 응답 수준을 설정합니다.
  2. 배경 전자 소음 수준을 설정하기 위해 미국 소스를 운전하지 않고 PCD 데이터를 기록합니다.
  3. 계획된 드라이브 레벨의 전체 범위에서 미국 소스를 구동하는 동안 PCD 데이터를 기록합니다. 이 데이터는 음향 반응의 어떤 부분이 나중에 테스트될 캐비테이션 에이전트와 관련이 없음을 나타냅니다.
    참고: 일반적인 실험실 액체(예: PBS 또는 세포 매체)는 탈기하지 않을 경우 적당한 압력(예: 0.5 MHz의 0.5 MPa)에서 캐비테이션을 나타낼 것입니다.
  4. 측정을 시작하기 전에 서스펜션이 챔버 온도와 열적으로 평형화할 시간을 줍니다. 미세 한 바늘 열전대는 이 목적을 위해 유용할 수 있습니다.
  5. 시간 및 주파수 도메인 모두에서 실험을 실시간으로 모니터링합니다.
    1. PCD의 시간 도메인 모니터링은 신호가 현재 계측 설정에 적합한지 여부를 나타냅니다. 특히, 신호 클리핑은 주파수 도메인에 다조 고조파 응답으로 나타나기 때문에 피해야 한다.
    2. PCD의 시간 도메인 모니터링은 또한 미국 소스에서 PCD에 노출 구획에 전파 시간에 따라 캐비테이션 신호가 예상보다 일찍 표시되는지 보여줍니다. 이러한 신호가 보이는 경우, 이것은 시험 챔버로 캐비테이션 에이전트의 누설을 나타낼 수 있습니다.
    3. PCD의 주파수 도메인 모니터링은 버블 거동의 유형을 나타내며 원하는 세포 자극을 달성하기 위해 필요에 따라 드라이브 수준을 조정하는 데 사용할 수 있습니다(예: 고조파 흥분을 위한 낮은 드라이브 수준).
  6. 첫 번째 노출을 놓치지 않도록 하려면 미국 소스 드라이브 신호를 켜기 전에 데이터 수집 프로세스를 시작합니다.
  7. 실험 전반에 걸쳐 미국 소스를 구동하는 증폭기 출력 신호를 모니터링하여 노출이 예상대로 진행되고 있는지 확인합니다. 이 측정을 위해 고전압 프로브를 사용하고 오실로스코프가 프로브 감쇠를 보정하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
  8. 샘플을 노출 한 후, 신중하게 테스트 챔버에서 제거합니다.
    1. 후속 사용에 대비하여 PDMS 뚜껑(SAT2)/고무 플러그(SAT3)를 제거하고 청소합니다.
    2. 후속 분석(예: 현미경 검사법, 형광 화상 진찰)에 필요에 따라 배양 접시(SAT2)/트랜스웰(SAT3)을 전송합니다.
    3. 소수의 노출(예를 들어, 3-5)이 지나면 기준선 캐비테이션 신호를 다시 획득하고(캐비테이션 제의 부재 시)를 다시 획득하고 챔버 미디어가 오염되지 않았는지 확인하기 위해 원래 데이터 세트와 비교하는 것이 좋습니다.

Representative Results

그림 4는 세 가지 뚜렷한 캐비테이션 동작을 보여 주며 시간 및 주파수 도메인 PCD 응답의 예를 보여줍니다. 모든 데이터는 PBS에서 5배 희석된 SonoVue MB를 사용하여 SAT3에서 수집되었으며, 최종 농도는 ~2*107 MB/ml입니다. 이 단면도의 모든 예에 대한 온도는 19± 1°C였다. 미국 공급원은 0.20(그림 4A 및 4B),0.30(도4C 및 4D),0.70MPa(도4E 및 4F)의발생 피크 음압을 달성하기 위해 0.5MHz에서 2.0 ms 펄스로 구동되었다. 신호 기록은 미국 펄스의 t = 0 시작 전에 1.4 ms시작되었습니다. 인셋 추적은 기록된(빨간색)과 2MHz 하이패스 필터(blue)로, 소스에서 셀 노출 구획에서 PCD로 비행시 중심의 시간 창에 대해 표시합니다. 이 시간 이전의 낮은 수준의 응답은 PCD가 미국 소스 뒤에 있는 구성에서 흔히 볼 수 있는 소스에서 직접 수신된 방사선 때문입니다.

가장 낮은 인시던트 압력에서 PCD 응답은 전적으로 0.5MHz 기본 미국 주파수의 정수 고조파로 구성됩니다. 0.20에서 0.30 MPa로 증가하면 추가로 높은 정수 고조파 외에도 스펙트럼에서 뚜렷한 초하모닉이 발생합니다. 0.30 MPa 결과가 펄스 지속 시간 동안 더 많은 가변성을 보여 주지만 이 두 압력에서 도메인 파형이 비슷해 보입니다. 가장 높은 압력에서 도메인 파형 진폭은 스펙트럼에서 보이는 광대역 노이즈가 명확하게 상승하여 낮은 압력에 비해 비선형적으로 증가했습니다. 이 노이즈는 일반적으로 관성 캐비테이션의 결과로 간주되며이 예에서는 MB의 파괴에 해당합니다.

이를 보다 명확하게 보려면 시간의 함수로 PCD 응답이 그림 5에표시됩니다. 왼쪽패널(그림 5A)에서전체 스펙트럼은 50초 동안 표시되며, 이 동안 소스는 0.20초마다 2.0ms 펄스를 방출한다. 해당 총, 고조파 및 광대역 전력은 오른쪽패널(도 5B)에표시됩니다. 미국은 t =3 .0 s에서 켜져 있었고, 이 때 큰 진폭 광대역 응답이 보였습니다. 초기 스파이크는 현탁액에서 가장 큰 기포의 파괴에 대응하는 것으로 생각되며 (SonoVue는 폴리 분산) 쉘 버블과 비 변형 된 미디어 (예를 들어, PBS)와 캐비테이션 실험에서 일반적인 관찰이다.

몇 초 후, 광대역 응답은 거품 파괴로 인해 빠르게 감소했으며 신호는 주로 고조파로 구성됩니다. 이는 해방된 가스와 남은 MB가 안정적으로 비불활성으로 진동하고 있음을 시사한다. t~50대에서 광대역 구성 요소는 원래 배경 잡음 수준으로 떨어졌습니다. 이와 같은 노출 테스트는 따라서 다른 거품 효과 챔버의 세포에 작용 할 수있는 기간 척도를 이해하려고 할 때 중요합니다.

기포는 특히 희석 현탁액을 처리할 때 모니터링된 캐비테이션 신호의 가변성을 증가시킬 수 있는 PCD 시야 안팎에서 미국 의 노출 및 외측 의 MB의 이동 중에 생성된 방사선 력에 반응하여 변환될 가능성이 높습니다. 따라서 PCD의 민감한 영역은 가능한 한 많은 세포 노출 표면에 걸쳐 있어야 합니다. 동일한 중심 주파수를 가진 집중및 초점이 맞지 않는 PCD의 응답 비교(그림 2참조)는 도 6에나타내며, 정상 PBS에서 20:1 의 MB 희석을 사용하여 SAT2이다. 패널 그림 6A의 시간 및 샘플 평균 스펙트럼은 초점이 맞지 않는 PCD가 고조파(도 6B)와 초하모닉 파워(도6C)에서샘플 대 시료 가변성을 감소시키는 강력한 광대역 반응을 포함하고 있음을 보여준다.

체외 세포 작업에 사용되는 미디어는 탈가스가 없으며 거품 활동의 향상된 배경 수준을 제시 할 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다. 도 7은 공급업체가 제공한 형태로 사용되는 PBS의 SAT2와 진공 상태에서 2시간 동안 탈유한 후, 광 센서(PreSens, 독일)로 결정된 공기 포화도를 92%에서 46%로 감소시킨 후 반응을 나타낸다. 그림 7A의 스펙트럼은 노출 시간 동안 평균화되었고 5개의 독립적인 샘플로 반복되었으며, 일반 PBS에서 명확하게 높은 초하모닉을 보여줍니다. 3개의 고조파(도7B)를합산한 힘은 각 실험 출력의 표준 편차 내에 잘 있습니다. 대조적으로, 그림 7C의 초하모닉 합계는 일반 PBS가 샘플 사이의 크기가 높고 실질적으로 더 높은 가변성을 거의 가지고 있음을 보여줍니다. 이러한 예는 일반적인 세포 호환 매체가 MB의 존재에 기인할 수 있는 (잘못) 동작을 나타낼 수 있음을 나타냅니다. 세포 및/또는 캐비테이션 제안정성에 대한 부정적인 영향으로 인해 배양 배지를 탈착하는 것은 일반적으로 실용적이지 않으므로, 모든 캐비테이션 관련 연구에서 적합한 제어를 수행하는 것이 중요합니다.

Figure 1
그림 1: 캐비테이션 모니터링: SAT3(D-F)을 통합한 두 개의 미국 노출 시스템 설계에 대한 그림입니다. (A)SAT2 에 의해 송신된 어셈블리와 측면 벽이 제거되어 명확성을 위해. (B)사이드 월이 그대로 있는 SAT2. (C)SAT2 세포 노출 구획, 분해. (D)SAT3 에 의해 추가 된 어셈블리. (E)SAT3 은 정상(왼쪽)과 다른 주파수에서 일치하는 빔 폭에 대한 렌즈(오른쪽) 구성입니다. (F)SAT3 셀 노출 구획, 분해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 12.7mm 직경 에 대한 반 진폭 압력 필드 윤곽의 계산 (왼쪽) 및 구형 집중 (오른쪽) 트랜스듀서. 2, 4 및 8MHz의 주파수는 좌표 원점(0,0)에서 PCD 요소에 대해 각각 빨간색, 파란색 및 녹색 윤곽으로 표시됩니다. 초점 장치의 가장 바깥쪽 윤곽은 주파수에 상대적으로 민감하지 않지만 내부 구조는 주파수에 따라 다릅니다. 주파수가 증가함에 따라 구형적으로 초점을 맞춘 필드 계약은 되지만 윤곽 내부는 필드가 원활하게 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 캐비테이션 신호 컨디셔닝 및 기록(파란색 화살표), 미국 소스 여기(빨간색 선), 데이터 수집 트리거링을 위한 계측. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: PBS에서 5배 희석된 MB로 기록된 시간(왼쪽) 및 주파수(오른쪽) 도메인 PCD 응답. 입사 피크 음압은 (A, B) 0.2 MPa, (C, D) 0.4 MPa, (E, F) 0.7 MPa, 모두 0.5 MHz에서 신호 기록이 2.0 ms 지속시간 초음파 펄스의 t=0 시작 전에 1.4ms를 시작했다. (A, C, E) 시간 도메인 신호(빨간색)는 고정 된 수직 축척으로 표시되어 인시던트 압력으로 응답 수준이 어떻게 변경되는지 나타냅니다. 인셋 추적은 기록된(빨간색)과 2MHz 하이패스 필터(blue)로, 소스에서 셀 노출 구획에서 PCD로 비행시 중심의 시간 창에 대해 표시합니다. (B, D, F) 노이즈 및 신호 전력 스펙트럼 밀도는 각각 t<0 및 t>0에 대해 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: PBS에서 5배 희석된 MB의 현탁액의 50초 이상 스펙트럼 이력. (A)전체 스펙트럼 및(B)총, 고조파 및 광대역 신호 전력, 모든 시간의 함수로. 드라이브 조건은 0.5 MHz, 0.7 MPa 피크 음압, 2.0 ms 펄스 지속 시간, 200 ms 펄스 반복 기간이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 일반 PBS에서 마이크로 버블의 20:1 희석으로 기록된 PCD 초점 형상의 효과. 드라이브 조건은 1.0 MHz, 0.50 MPa 피크 음압, 3.0 ms 펄스 지속 시간, 10 ms 펄스 반복 기간이었다. (A)전체 스펙트럼은 노출 시간 및 세 개의 독립적 인 샘플 반복을 통해 평균. (B)3, 4, 5MHz 의 전력,(C)2.5, 3.5 및 4.5 MHz 초하모닉의 전력. 두꺼운 선은 샘플 수단이며, 그늘진 영역은 +/- 1 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: PBS로 기록된 변형된 미디어의 효과. (A)전체 스펙트럼은 노출 시간 및 5 개의 독립적 인 샘플 반복을 통해 평균. (B)3, 4, 5MHz 의 전력,(C)2.5, 3.5 및 4.5 MHz 초하모닉의 전력. 두꺼운 선은 샘플 수단이며, 그늘진 영역은 +/- 1 표준 편차를 나타냅니다. 드라이브 조건은 1.0 MHz, 0.50 MPa 피크 음압, 1.0 ms 펄스 지속 시간, 200 ms 펄스 반복 기간이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

매개 변수 단위 최소 최대
빈도 MHz 0.02 15
압력(피크 음수) MPa 0.1 20
펄스 길이 사이클 1 CW
듀티 사이클 % 1 CW
노출 시간 s 10 1000

표 1: 시험관 내소포화를 용이하게 하는 보고된 매개변수의 범위 요약.

Discussion

모든 음향 측정에 대한 중요한 단계는 1981 년76 에서 Apfel에 의해 캡슐화되었다 "당신의 액체를 알고, 당신의 사운드 필드를 알고, 무슨 일이 일어나는지 알고." 이 프로토콜의 맥락에서, 이들은 트랜스듀서 교정 및 정렬 및 물 준비 및 거품 처리 단계를 포함한다. 첫째, 주행 트랜스듀서 및/또는 PCD를 교정하는 데 사용되는 하이드로폰자체가 일반 외부 서비스 또는 사내 비교를 통해 참조 표준에 대한 자체 비교를 통해 정확하게 보정되는 것이 필수적입니다. 마찬가지로, 구동 트랜스듀서와 PCD의 응답은 정기적으로 출력 및 / 또는 감도의 손실을 확인하는 특성이 필요합니다. 운전 조건과 시스템의 감도가 알려지지 않은 경우 노출 조건, 생물 효과 및 음향 방출 사이의 의미있는 관계를 추론하는 것은 불가능합니다. 이와 직접적으로 관련이 있는 트랜스듀서와 샘플 챔버의 정렬은 챔버 내의 노출 조건이 예상대로 이루어지고 PCD의 샘플링 부피가 관심 영역에 해당하는지 확인하기 위해 신중하게 점검되어야 합니다. 지시된 바와 같이, 일시 중단 매체의 온도 및 가스 함량은 최종 결과에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 점에서 일관성은 매우 중요하다77,78. 마찬가지로, 캐비테이션 제제 서스펜션의 준비, 특성화 및 처리는 샘플 내에 입자의 예상 크기 분포 및 농도가 존재하는지 확인하기 위해 매우 세심한 주의를 기울여야 한다. 예를 들어, 기포의 농도가 너무 높으면 미국 측으로부터 시료 부피를 효과적으로 차폐하게 된다. MB 요원은 특히 파괴와 결합에 취약하며, 그들의 처리에 대한 추가 지침은 Mulvana 등에서 찾을 수 있습니다. al. (2012)79.

캐비테이션 신호 감지와 관련하여 매우 일반적인 문제는 적절한 SNR을 달성하는 것입니다. 이는 설명된 바와 같이 신호 자체의 특성에 부분적으로 기인하지만 실험 설정 내의 전기 소음의 원천 때문일 수도 있다. 시스템 구성 요소, 특히 공동 축 케이블과 관련된 구성 요소 간의 연결을 확인하면 이러한 구성 요소 중 일부를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 공동 축 케이블을 교체하거나 수리해야 할 수 있습니다. 전기 소음을 일으킬 수 있는 펌프와 같은 실험실에서 다른 장비를 식별하고 제거하거나 비활성화하는 것도 도움이 될 수 있습니다. 시스템 구성 요소 간의 열악한 전기 임피던스 매칭은 신호 대 노이즈 비율의 추가 원인이 될 수 있으며 장비손상의 잠재적 인 원인이 될 수 있으며 신중하게 검사해야합니다. 신호 생성기 및 오실로스코프의 트리거링 설정도 마찬가지로 실험에 맞게 구성되고 제조업체 기본 설정으로 되돌리지 않은지 확인해야 합니다. 취급 하는 동안 거품의 상당한 파괴가 있는 경우, SAT2의 경우, 출구 포트에 제2 주사기를 부착 하 고 부드럽게 챔버에서 유체를 추출 하는 이사용 하는 것이 도움이 될 수 있습니다., 따라서 현탁액에 도면. 또한 원하는 경우 매크로 버블을 제거하거나 미국 노출 중에 흐름을 활성화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

샘플 챔버 내에서 음향 반사를 완전히 제거할 수 없으므로 입사 필드가 전체 샘플 볼륨에 완전히 균일하지 않습니다. 1.3.2 및 1.3.3 단계에서 언급했듯이 음향 창의 형질성은 주파수에 따라 달라지므로 음향 방출 측정을 위한 원하는 대역폭을 신중하게 고려해야 합니다. 특히, 더 높은 주파수 구성 요소의 상당한 다중 반사가있을 수 있습니다. 이는 완전히 조립된 시스템 내에서 필드를 보정하는 것이 사고 압력의 불확실성을 최소화하는 데 매우 중요한 또 다른 이유입니다. 기록된 신호의 적절한 게이팅은 여러 반사의 영향을 최소화하기 위해 고려해야 합니다. 편의성과 음향 투명성을 위해 상용 장치를 사용하면 일부 광학 투명성을 희생해야 합니다. 이것은 세포 생존성 또는 약 uptake를 평가하기 위하여 후속 화상 진찰, 예를 들어, 연속적인 화상 진찰의 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 상용 장치에 사용되는 멤브레인 중 일부는 다공성이며, 따라서, 불완전한 격리는 샘플 챔버와 주변 수조 사이에 발생합니다. 위와 같이, 오염의 해당 위험을 완화할 수 있는 작은 서브 챔버를 사용 하 여, 내용물 정기적으로 교체될 수 있다. 재료의 표에 표시된 세포 배양 장치는 모든 미국 /캐비테이션 매개 생물 효과의 관점에서 조직을 대표하지 않을 수 있는 세포 단층에 주로 적합합니다. 고체 표면에 대한 세포의 근접성은 또한 도입에 설명된 바와 같이 마이크로 스트리밍 및 마이크로제트를 촉진하는 등 생체 내 의 조건을 반영하지 못할 수 있는 방식으로 MB 역학에 영향을 미칩니다. 이러한 제한은 대체 조직 모델의 간단한 대체를 통해, 그러나, 해결 될 수있다.

SAT를 제안하는 목적은 미국 중재 된 생물 효과의 연구 사이에 음향 노출 조건과 음향 방출의 재현성을 향상시키는 수단을 제공함으로써 기본 메커니즘에 대한 더 나은 이해와 안전성과 효능을 향상시키기 위한 치료 모니터링 기술의 개발을 용이하게하는 것입니다. 이 시스템은 시판되는 세포 배양 장치와 호환되도록 설계되어 관심의 적용에 따라 광범위한 생물학적 적 실험을 수행하고 높은 처리량 실험의 성능을 가능하게 하여 실행 간에 시간이 많이 소요되는 정렬 절차의 필요성을 제거합니다. 노출 조건의 특성화 및 음향 배출 포착을 위한 프로토콜을 표준화함으로써 시스템 의존적 변동성을 줄일 수 있습니다. 특정 실험을 위해 탐구해야 하는 파라미터의 범위는 응용(원하는 바이오 효과, 세포 유형, 생체 내의 경우 표적 조직의 깊이)과 사용되는 캐비테이션 제의 특성에 따라 달라집니다. 많은 변수(미국 주파수, 압력 진폭, 펄스 길이, 펄스 반복 주파수 등)를 감안할 때 전체 파라미터 공간을 완전히 탐색할 수 있는 것은 실행 가능하지 않을 것이다. 제안된 프로토콜의 장점은 이 매개 변수 공간의 일부 범위를 신속하게 설정할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 캐비테이션 신호가 생성되는 최소 압력, 세포 분리/사망 발생 전에 사용할 수 있는 최대 압력 또는 펄스 길이, 분수 고조파 또는 광대역 노이즈가 발생하는 압력을 측정할 수 있습니다. 이러한 범위 측정 세트는 모든 연구에서 첫 번째 단계로 수행되는 것이 좋습니다.

제시된 바와 같이, SAT는 음향 방출의 실시간 모니터링을 위해 설계되었으며, 실험 외부에서 생물학적 해석이 수행됩니다. 그러나 현미경 목표를 통해 샘플 챔버의 직접 광학 관찰을 가능하게 하기 위해 SAT를 수정하는 것은 비교적 간단할 것이다. 이것은 차례차례로 형광 및/또는 고속 현미경 계통에 결합될 수 있었습니다, 예를 들면 약 uptake 및 거품 역학의 관찰을 가능하게 하기 위하여. 전압 측면에서 현재 제시된 PCD 출력은 다음과 같이 나타냅니다: i) 캐비테이션 동작의 유형과 상대적 비율; ii) 이러한 캐비테이션 동작이 지속되는 기간; iii) 관찰된 시간 누적 노출 특성이 특정 생체 효과와 상관관계가 있는지 여부; 및 iv) 상대 수준 및 시간 종속 동작이 노출 시스템의 이전 실험과 일치하는지 여부. PCD의 수신 감도는 정량화될 수 있지만 절대 에너지 측면에서 음향 방출을 안정적으로 특성화하기 위해서는 추가 공간 정보가 필요합니다. 이는 PCD를 어레이 프로브로 교체하여 패시브 어쿠스틱 매핑(PAM)80을구현하여 달성할 수 있습니다. 그러나 신호 처리의 복잡성과 필요한 계산 시간과 전력이 증가합니다.

멤브레인 전기 저항 또는 물리적 표적화 방법의 적용을 위한 다른 계측물(예: 자기장)도 통합될 수 있다. 또한 종양 스페로이드, 오르가노이드, 또는 전 생체 조직 샘플과 같은 3차원 조직 구조를 세포 단층 대신 음향적으로 "부드러운" 젤 기판에 사용하여 보다 현실적인 조직 환경에서 미국과 캐비테이션 매개 효과를 연구할 수 있을 것이다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 보조금 EP / L024012/1을 통해이 작업을 지원하는 공학 및 물리 과학 연구 위원회에 감사드립니다. VB는 또한 공학 및 물리 과학 연구 위원회 (EPSRC) 및 의학 연구 위원회 (MRC)에 의해 지원됩니다 (보조금 EP / L016052/1). VB와 AV는 졸업 장학금 클라렌던 재단에 감사드립니다. AV는 또한 산탄데르 장학금엑서터 대학에 감사드립니다. 저자는 제임스 피스크와 데이비드 솔즈베리가 장치 제조에 귀중한 도움을 주도록 빚지고 있습니다. 그들은 또한 다리오 카루고 박사와 조슈아 오웬 박사가 이전 프로토타입 SAT의 개발에 기여한 것에 대해 감사하게 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage

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References

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