Summary
Il pretrattamento a base di solvente eutettico profondo, assistito da microonde, è un processo verde, veloce ed efficiente per il frazionamento lignocellulosico e il recupero della lignina ad alta purezza.
Abstract
Il pretrattamento è ancora il passo più costoso nei processi di bioraffineria lignocellulosica. Deve essere reso conveniente riducendo al minimo i requisiti chimici, il consumo di energia e calore e utilizzando solventi rispettosi dell'ambiente. I solventi eutettici profondi (DES) sono solventi chiave, verdi e a basso costo nei bioradiostori sostenibili. Sono miscele trasparenti caratterizzate da bassi punti di congelamento risultanti da almeno un donatore di legami idrogeno e un accettore di legami idrogeno. Sebbene i DES siano solventi promettenti, è necessario combinarli con una tecnologia di riscaldamento economica, come l'irradiazione a microonde, per una redditività competitiva. L'irradiazione a microonde è una strategia promettente per ridurre i tempi di riscaldamento e aumentare il frazionamento perché può raggiungere rapidamente la temperatura appropriata. Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo rapido e in una fase per il frazionamento della biomassa e l'estrazione della lignina utilizzando un solvente a basso costo e biodegradabile.
In questo studio, un pretrattamento DES assistito da microonde è stato condotto per 60 s a 800 W, utilizzando tre tipi di DES. Le miscele DES sono state preparate in modo facile dal cloruro di colina (ChCl) e da tre donatori di legame idrogeno (HBD): un acido monocarrbossilico (acido lattico), un acido dicarrbossilico (acido ossalico) e urea. Questo pretrattamento è stato utilizzato per il frazionamento della biomassa e il recupero della lignina dai residui marini (foglie di Posidonia e aegagropile), sottoprodotti agroalimentari (gusci di mandorle e vinacce di olive), residui forestali (pigne) ed erbe lignocellulosiche perenni(Stipa tenacissima). Ulteriori analisi sono state condotte per determinare la resa, la purezza e la distribuzione del peso molecolare della lignina recuperata. Inoltre, l'effetto dei DES sui gruppi funzionali chimici nella lignina estratta è stato determinato dalla spettroscopia a infrarossi a trasformata di Fourier (FTIR). I risultati indicano che la miscela di acido chcl-ossalico offre la massima purezza di lignina e la resa più bassa. Il presente studio dimostra che il processo DES-microonde è una tecnologia ultraveloce, efficiente e competitiva in termini di costi per il frazionamento della biomassa lignocellulosica.
Introduction
I processi di bioraffineria sostenibile integrano la lavorazione della biomassa, il suo frazionamento in molecole di interesse e la loro conversione in prodotti avalore aggiunto 1. Nella bioraffineria di seconda generazione, il pretrattamento è considerato essenziale per frazionare la biomassa nei suoi componenti principali2. I metodi tradizionali di pretrattamento che utilizzano strategie chimiche, fisiche o biologiche sono stati ampiamente applicati3. Tuttavia, tale pretrattamento è considerato il passo più costoso nella bioraffinatura e presenta altri svantaggi come lunghi tempi di lavorazione, elevato consumo di calore ed energia e impurità del solvente4. Recentemente, i DES, le cui proprietà sono simili a quelle dei liquidi ionici3,sono emersi come solventi verdi grazie a vantaggi come biodegradabilità, compatibilità ambientale, facilità di sintesi e recupero dopo il trattamento5.
I DES sono miscele di almeno un HBD, come acido lattico, acido malico o acido ossalico, e un accettore di legame idrogeno (HBA) come betaina o cloruro di colina (ChCl)6. Le interazioni HBA-HBD consentono un meccanismo catalitico che consente la scissione di legami chimici, causando il frazionamento della biomassa e la separazione della lignina. Molti ricercatori hanno riportato il pretrattamento a base di DES di materie prime lignocellulosiche come chcl-glicerolo sulla pannocchiera del mais e stover7,8, ChCl-urea e acido chcl-ossalico sulla paglia di grano9,acido chcl-lattico sulla segatura di eucalipto 10e acido chcl-acetico11 e glicole chcl-etilene sullegno 11. Per migliorare l'efficienza del DES, il pretrattamento deve essere combinato con il trattamento a microonde per accelerare il frazionamento dellabiomassa 5. Molti ricercatori hanno riportato un pretrattamento combinato (DES e microonde) dilegno 8 e di stover di mais, switchgrass e Miscanthus 5 , chefornisce nuoveinformazioni sulla capacità di DESs per il frazionamento lignocellulosico e l'estrazione della lignina in un semplice passaggio in un breve periodo.
La lignina è una macromolecola fenolica valorizzata come materia prima per la produzione di biopolimeri e presenta un'alternativa per la produzione di sostanze chimiche come monomeri aromatici e oligomeri12. Inoltre, la lignina ha attività antiossidanti e di assorbimentoultravioletto 13. Diversi studi hanno riportato applicazioni di lignina nei prodotti cosmetici14,15. La sua integrazione nei prodotti commerciali per la protezione solare ha migliorato il fattore di protezione solare (SPF) del prodotto da SPF 15 a SPF 30 con l'aggiunta di solo il 2 wt % di lignina e fino a SPF 50 con l'aggiunta del 10 wt % lignin16. Questo documento descrive un approccio ultraveloce per la scissione lignina-carboidrati, assistito dal pretrattamento combinato DES-microonde delle biomasse mediterranee. Queste biomasse sono costituite da sottoprodotti agroalimentati, in particolare sansa di oliva e gusci di mandorle. Altre biomasse che sono state studiate sono state quelle di origine marina (foglie di Posidonia e aegagropile) e quelle provenienti da una foresta (pigne ed erbe selvatiche). Lo studio si è posto l'obiettivo di testare solventi verdi a basso costo per valutare gli effetti di questo pretrattamento combinato sul frazionamento delle materie prime, di studiarne l'influenza sulla purezza e sulla resa della lignina e di studiarne gli effetti sui pesi molecolari e sui gruppi funzionali chimici nella lignina estratta.
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Protocol
1. Preparazione delle biomasse
- Essiccazione della biomassa
- Mettere le foglie di Posidonia e le palline di aegagropile(Posidonia oceanica),raccolte dalle spiagge mediterranee, in forno a 40 °C per 72 ore.
- Mettere i gusci di mandorle(Prunus dulcis),generati dalle industrie alimentari, e le vinacce dioliva (Olea europaea L.), ottenutedai frantoi, in forno a 40 °C per 72 ore.
- Posizionare le pigne (Pinus halepensis), raccolte da una foresta, e le foglie alfa (Stipa tenacissima), raccolte dal bacino del Mediterraneo meridionale, in forno a 40 °C per 72 ore.
NOTA: Se la biomassa contiene sabbia, deve essere risciacquata con acqua distillata prima di essere posta nel forno. Le biomasse sono indicate nella figura 1A-F.
- Macinazione a biomassa
- Posizionare 20 g di ogni biomassa in una fresa a martello dotata di setaccio da 1 mm. Raccogliere la polvere risultante in un becher da 0,25 L e alimentarla a un martello dotato di setaccio da 0,5 mm. Raccogliere la polvere in un becher da 0,25 L.
2. Estrazione di lignina ultraveloce assistita da microonde
- Preparazione del solvente eutettico profondo (DES)
- Preparare il DES1 (acido chcl-ossalico) in un rapporto molare di 1:1 mescolando 174 g di ChCl con 126 g di diidrato di acido ossalico in un pallone a fondo tondo da 500 ml e sciogliendoli in un bagno a 70 °C per 4 ore fino a formare un liquido omogeneo e trasparente.
- Preparare il DES2 (acido chcl-lattico) in un rapporto molare di 1:1 mescolando 174 g di ChCl con 90 g di acido lattico in un pallone a fondo rotondo da 500 ml e sciogliendoli in un bagno a 70 °C per 4 ore fino a formare un liquido omogeneo e trasparente.
- Preparare il DES3 (ChCl-urea) in un rapporto molare di 1:12 mescolando 174 g di ChCl con 120 g di urea in un pallone a fondo tondo da 500 mL e sciogliendoli in un bagno a 70 °C per 4 ore fino a formare un liquido omogeneo e trasparente.
NOTA: Mescolare queste miscele continuamente con una barra di agitazione a 500 giri/min.
- Trattamento combinato microonde-DES
- Mettere 5 g della materia prima in un forno a microonde in un reattore chiuso in politetrafluoroetilene. Aggiungere 50 mL di DES e posizionare una barra di agitazione nel campione. Chiudere il contenitore a microonde con un tappo appropriato e fissare il limite di temperatura.
- Posizionare il contenitore a microonde sul bordo del giradischi, assicurandosi che sia costantemente agitato. Impostare la potenza a microonde a 800 W per 1 minuto. Usando guanti adatti, eserti il contenitore dal microonde e lasciare raffreddare la miscela. Ripetere questo trattamento utilizzando i tre DES per ogni campione di biomassa.
NOTA: Controllare e assicurarsi che la sonda di temperatura sia posizionata correttamente e che il contenitore a microonde abbia una temperatura omogenea.
- Isolamento di Lignin
- Preparare una soluzione antisolvente omogenea mescolando etanolo:acqua in un rapporto 50:50 (v:v). Aggiungere 50 mL della soluzione antisolvente alla materia prima trattata, posizionare la miscela in un contenitore di centrifugazione (250 mL) e centrifugare per 5 minuti a 3.000 × g.
- Dopo la centrifugazione, filtrare il supernatante (frazione ricca di lignina) utilizzando un crogiolo filtrante in vetro (porosità 4, 10-16 μm, diametro 10 mm). Lavare il residuo residuo di cellulosa raccolto dopo la centrifugazione con 25 mL della soluzione antisolvente.
- Centrifuga a 3.000 × g per 5 minuti dopo ogni lavaggio. Ripetere i lavaggi 4x e raccogliere e filtrare i lavaggi attraverso il crogiolo del filtro di vetro (porosità N 4, 10-16 μm, diametro 10 mm).
- Aggiungere la frazione filtrata ricca di lignina dal passo 2.3.2 ai lavaggi filtrati dal passo 2.3.3 in un pallone inferiore rotondo da 500 mL. Evaporare l'etanolo utilizzando un evaporatore rotante a 50 °C e 110 mbar.
- Aggiungere 150 mL di acqua deionizzata al liquore concentrato (frazione ricca di lignina) e far precipitare la lignina mediante centrifugazione. Raccogliere la lignina come pellet e lavarla con 25 mL di acqua distillata; ripetere i lavaggi 4x. Liofilizzare la lignina o asciugarla in forno a 40 °C.
NOTA: Se necessario, lavare la lignina >4x per rimuovere i sali dai solventi. - Utilizzare la formula seguente per determinare la resa:
NOTA: L'estrazione di Lignina è stata eseguita anche con altri due DES: cloruro di colina + resorcinolo e cloruro di colina + acido butirrico a 1 min. Tuttavia, gli importi di lignina recuperati utilizzando questi DES erano estremamente piccoli (e irrecuperabili) rispetto agli importi ottenuti utilizzando gli altri tre DES.
3. Determinazione della purezza della lignina estratta da Klason
- Preparazione del campione per l'idrolisi di Klason
- Posizionare il crogiolo filtrante (porosità 4, diametro 4,5 mm) in un forno a muffle a 550 °C per 4 ore (rampa 2 ore, da 25°C). Rimuovere il crogiolo quando il forno si raffredda a 150 °C, posizionare in un essiccatore per raffreddare e pesare.
- Aggiungere circa 30 mg di lignina in un tubo di vetro borosilicato (vedere la tabella dei materiali)e notare il peso del campione. Aggiungere 1 mL di acido solforico al 72% (H2SO4) al campione, posizionare il campione in un bagno di 30 °C per 60 minuti e mescolare ogni 10 minuti con vortici.
- Rimuovere il campione, trasferirlo in una bottiglia di vetro da 100 ml e aggiungere 28 ml di acqua distillata per diluire l'acido a una concentrazione del 4%. Mettere la bottiglia di vetro in autoclave a 121 °C per 60 min. Rimuovere la bottiglia di vetro e lasciare raffreddarla.
- Analisi della lignina acida insolubile
- Filtrare l'idrollysato utilizzando un crogiolo sotto vuoto. Raccogliere tutti i solidi in una bottiglia di vetro contenente acqua deionizzata. Risciacquare il crogiolo con 50 mL di acqua deionizzata.
- Asciugare il crogiolo contenente i solidi posizionandolo in forno a 105 °C per 16 ore. Rimuovere il crogiolo dal forno, posizionare in un essiccatore e lasciare raffreddarlo. Pesare il campione.
- Posizionare il crogiolo in un forno a muffola a 550 °C per 4 ore (rampa 2 ore). Rimuoverlo e posizionare in un essiccatore. Pesare il campione.
- Utilizzare la seguente formula per calcolare la percentuale del residuo insolubile acido (AIR):
WCSA: peso del crogiolo + campione dopo averli rimosso dal forno
WC: peso del crogiolo
WCSMF: peso del crogiolo dopo la rimozione dal forno del silenziatore
ODW: peso secco del forno del campione
- Analisi della lignina solubile in acido
- Misurare l'assorbanza del filtrato ottenuto nel passaggio 3.2.1 con uno spettrofotometro a 205 nm utilizzando cuvette di quarzo. Utilizzare acqua distillata come vuota.
- Utilizzare la seguente formula per calcolare la percentuale del residuo solubile in acido (ASL):
NOTA: L'assorbanza deve essere compresa tra 0,2 e 0,7. Diluire il campione, se necessario.
UVabs: assorbanza a 205 nm
Lunghezza percorso: percorso luminoso della cella di misura (in cm)
ε: assorbenza della biomassa ad una lunghezza d'onda specifica
4. Tenore di azoto nella lignina estratta
- Preparazione della soluzione alcalini
- In un pallone volumetrico da 2,5 L pesare 1 kg di idrossido di sodio (NaOH) e aggiungere acqua deionizzata fino al marchio. Posizionare una barra magnetica nel pallone e mescolare fino a quando il NaOH non è completamente sciolto.
- Preparazione della soluzione di acido solforico
- Prendere 0,1 N H2SO4 (vedere il tavolo dei materiali)in un ma pallone volumetrico da 5 L, aggiungere acqua deionizzata fino al segno da 5 L, posizionare una barra magnetica e mescolare fino a quando il contenuto non si dissolve.
- Preparazione della soluzione ricevente
- In un masto volumetrico da 5 L sciogliere 100 g di H3BO3 (acido borico) in acqua deionizzata e portare il volume nel segno.
- Pesare 100 mg di verde bromocresol in un masto volumetrico da 100 ml e aggiungere metanolo tecnico fino al marchio.
- Pesare 100 mg di rosso metile in un masto volumetrico da 100 ml e aggiungere metanolo tecnico fino al marchio.
- Versare i 5 Ldella soluzioneH 3 BO3 dal passo 4.3.1, 100 mL di soluzione verde bromocresol dal passo 4.3.2, 70 mL della soluzione rosso metile dal passo 4.3.3 e 5 L di acqua deionizzata in un contenitore. Agitare bene la soluzione ricevente per 30 minuti.
NOTA: Il colore finale della soluzione deve essere verde. Se il colore non è verde, aggiungere 50 mL di 1 soluzione NaOH N.
- Preparazione del campione
- In un tubo di Kjeldahl, posizionare 100 mg di lignina pesati su una carta priva di azoto, aggiungere una compressa di Kjeldhal (1,5 g di solfato di potassio (K2SO4) + 0,045 g di pentaidrato di solfato di rame (CuSO4,5H2O) + 0,045 g di biossido di titanio (TiO2))e aggiungere 7,2 mL di H concentrato2SO4.
NOTA: Utilizzare quattro tubi con solo carta priva di azoto (senza i campioni) come spazi vuoti.
- In un tubo di Kjeldahl, posizionare 100 mg di lignina pesati su una carta priva di azoto, aggiungere una compressa di Kjeldhal (1,5 g di solfato di potassio (K2SO4) + 0,045 g di pentaidrato di solfato di rame (CuSO4,5H2O) + 0,045 g di biossido di titanio (TiO2))e aggiungere 7,2 mL di H concentrato2SO4.
- Digestione del campione
- Accendere il termostato sul digester con 1 h di anticipo a 360 °C.
- Posizionare i tubi campione su un rack, posizionare i quattro tubi vuoti ai quattro angoli del rack e riempire i fori (se presente) del rack con tubi vuoti.
- Posizionare il rack nel digester preriscaldato, coprire il sistema di aspirazione e aprire la pompa dell'acqua.
NOTA: Fare attenzione ad evitare i fumi; aumentare il flusso d'acqua in caso di fumi. - Dopo 2 ore, spegnere il riscaldamento, rimuovere i campioni e posizionarli su un supporto metallico. Lasciare raffreddare il rack per circa 40 minuti con il sistema di aspirazione.
- Procedura di distillazione Kjeldhal
- Accendi il distillatore Kjeldahl. Consenti l'esecuzione di auto-test fino a quando la selezione non viene visualizzata sullo schermo. Passare alla modalità manuale, inserire un tubo vuoto e chiudere la porta scorrevole.
- Eliminare la burette titolazione (0,02 N H2SO 4 )(sollevareil coperchio) premendola più volte nella parte inferiore e superiore ed eliminare le bolle d'aria dai tubi spremendo il tubo del flacone H2SO4. Chiudi il cofano.
- Eliminare la soluzione ricevente H3BO3 3x.
- Aggiungere acqua 3x e passare al vapore attivo (10 min). Passare al programma di analisi Kjeldahl 1. Immettere Blanco utilizzando le frecce a livello di linea Risultato.
- Inserire il tubo. Inizia con i quattro spazi vuoti e calcola le loro medie. Immettere il valore nella riga Blanco.
NOTA: Dopo l' inserita del tubo, il dispositivo aggiunge automaticamente e successivamente 30 mL di H2O, 30 mL di H3BO3e 40 mL di 10 N NaOH. - Passare a mL di titolazione alla riga del risultato. Inserire il tubo e notare la quantità di H2SO4 utilizzata.
NOTA: Per testare il distillatore Kjeldahl, si consideri che 50 mg di glicerina corrispondono al 18,60% ± 5% di % N. Al termine di ogni titolazione, il dispositivo svuota e pulisce automaticamente il tubo. - Calcolare la percentuale di N.
V s.a : Volume di acido solforico
T s.a : 0,02 N H2SO4
S: massa campione
5. Contenuto di ceneri nella lignina estratta
- Asciugare i crogioli ceramici per 1 h a 105 °C. Lasciali raffreddare in un essiccatore.
- Pesare un crogiolo e annotarne il numero. Aggiungere circa 1 g di polvere campione. Posizionare il crogiolo nel forno a muffola con il seguente programma: una rampa di 2 ore fino a 575 °C; un altopiano di 4 ore a 575 °C.
- Lasciare raffreddare il forno a 100 °C. Rimuovere i crogioli, metterli nell'essiccatore e pesarli.
6. Contenuto di carboidrati
- Preparazione della soluzione di boroidro di sodio (NaBH 4)/dimetilsolfoossido (DMSO)
- Posizionare 2 g di NaBH4 in un masto volumetrico da 100 mL e riempire a segno con DMSO. Riscaldare a 100 °C in un bagno del sindaco e mescolare la soluzione fino a completa dissoluzione.
- Preparazione della soluzione MIX
- Mettere 20 mg ciascuno di xilosio, arabinosio, rhamnosio, glucosio, galattosio, mannosio e 2-deossiglucosio in un masto volumetrico da 100 ml e riempire fino al segno di 100 ml con acqua deionizzata.
- Idrolisi del campione
- Pesare un campione di 50 mg di lignina in un tubo di vetro borosilicato, aggiungere 3 ml di 1 M H2SO4e scaldare la miscela per 3 ore a 100 °C.
- Raffreddare il campione, aggiungere 1 mL di idrossido di ammonio da 15 M (NH4OH) e controllare il pH per assicurarsi che sia neutro o alcalino. Aggiungere esattamente 1 mL di standard interno (2-deossiglucosio) a ciascun campione.
NOTA: Il 2-deossiglucosio aggiunto come norma interna consente di quantificare la quantità di ciascuna dose presente nel campione.
- Riduzione e acetilazione dei monosaccaridi in acetato di alditolo
- Prendere 400 μL della soluzione dal passaggio 6.3.2 e posizionarla in tubi speciali. Prendere 400 μL della soluzione MIX di controllo e posizionarla in tubi speciali.
NOTA: L'utilizzo della soluzione MIX facilita il calcolo dei fattori di risposta (FF) e delle percentuali di monosaccaridi. - Aggiungere 2 mL della soluzione NaBH4/DMSO preparata nella sezione 6.1. Chiudere il tubo e incubare per 90 minuti a 40 °C in un bagno d'acqua. Rimuovere il tubo dal bagno d'acqua e aggiungere 0,6 ml di acido acetico glaciale.
NOTA: Poiché si tratta di una reazione esotermica, appariranno bolle e fumo. - Aggiungere circa 0,4 mL di 1-metillimidazolo e circa 4 mL di anidride acetica. Dopo 15 minuti, aggiungere 10 mL di acqua distillata, raffreddare e aggiungere ~3 mL di diclorometano (CH2Cl2).
- Dopo almeno 2 ore, raccogliere ~1 mL della fase inferiore (organica) e iniettarlo in un gascromatografo dotato di una colonna capillare del rivelatore di ionizzazione di fiamma, HP1-metilsiloxano (30 m (lunghezza) x 320 μm (diametro interno), 0,25 μm (spessore del film)). Analizzare i dati.
- Utilizzare la formula seguente per calcolare il fattore di risposta (RF).
A m. p: Media dell'area del picco di monosaccaride nella soluzione MIX
M a. h di 2 - glucosio deossi: Massa di 2-deossiglucosio dopo idrolisi
Un 2dg. p: Media dell'area del picco di 2-deossiglucosio nella soluzione MIX
M a. h del monosaccaride: Massa del monosaccaride dopo idrolisi
NOTA: La correzione dell'anidro è 0,8 per la rhamnosi, 0,88 per il arabinosio e lo xilosio e 0,9 per il mannosio, il glucosio e il galattosio. Massa dopo idrolisi = correzione dell'anidro x massa (g) del monosaccaride utilizzato nella soluzione MIX. - Utilizzare la formula seguente per calcolare la massa del monosaccaride.
Ap. M: Area di picco del monosaccaride nel campione analizzato
M. IS: Massa di standard interni aggiunti; qui, C SI=1 mg/mL
AP.2: Area di picco di 2-deossiglucosio nel campione
RF: fattore di risposta - Calcolare la percentuale di ogni monosaccaride utilizzando la formula seguente.
- Prendere 400 μL della soluzione dal passaggio 6.3.2 e posizionarla in tubi speciali. Prendere 400 μL della soluzione MIX di controllo e posizionarla in tubi speciali.
7. Funzioni chimiche nella lignina estratta (infrarosso trasformato da Fourier)
- Per identificare i gruppi funzionali chimici nella lignina estratta, utilizzare uno spettrometro FT-IR dotato di un modulo di riflettanza totale attenuata (ATR). Aprire il software di spettroscopia e regolare i parametri: risoluzione 4 cm-1,tempo di scansione del campione 32, tempo di scansione in background 16, salvataggio dei dati da 4000 a 400 cm-1,trasmissione dello spettro dei risultati.
- Non aggiungere alcun campione; premere lo sfondo a canale singolo. Ora posizionare 1 mg del campione sul cristallo e premere il campione a canale singolo. Elaborare gli spettri ottenuti.
8. Peso molecolare della lignina estratta (cromatografia a permeazione del gel)
- Preparare una soluzione di dimetilformamide (DMF) con cloruro di litio 0,5% (LiCl). Prendere 5 g di LiCl in un masto volumetrico da 1 L, aggiungere DMF fino alla linea di gauge e mescolare il contenuto fino a ottenere un liquido omogeneo.
- Sciogliere 3 mg del campione di lignina in 3 mL di DMF con 0,5% di LiCl. Centrifugare in un tubo di centrifuga da 10 ml e separare la frazione solubile in una fiala.
- Sciogliere 3 mg di polistirolo standard 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 10 kDa, 20 kDa e 30 kDa nella soluzione di DMF con 0,5% LiCl. Centrifugare in tubi di vetro borosilicati da 10 ml e trasferire la frazione solubile in una fiala.
- Preparare un sistema liquido cromatografico-ultravioletto (UV) ad alte prestazioni.
- Aprire il sistema dati e controllare il rilevatore UV.
- Spurgo il sistema con acqua distillata. Installare lo stantuffo nell'eluente (DMF con 0,5% LiCl). Aprire la valvola di spurgo ed eliminare la linea con una portata di 1 mL/min per 15 min. Interrompere il flusso e chiudere la valvola di spurgo.
- Impostare la portata su 1 mL/min per 10 minuti per pulire il percorso eluente verso il rilevatore. Interrompere la portata.
- Installare la colonna preceduta da una colonna di protezione (vedere la tabella dei materiali). Accendere il riscaldatore a colonna a 45 °C, accendere il rilevatore UV e impostare gradualmente la portata fino a raggiungere una portata di 0,6 mL/min.
- Iniettare 30 μL di ogni campione per 40 min ad una lunghezza d'onda di 270 nm. Elaborare i dati ottenuti e calcolare la distribuzione di massa utilizzando la linea di calibrazione.
- Calcolare il peso molecolare medio numerico (Mn), il peso medio molecolare (Mw) e l'indice di polidispersità (PDI).
Mi: peso molecolare di una catena
Ni: numero di catene per quel peso molecolare
9. Trattamento dei dati e analisi statistiche
- Eseguire tutti gli esperimenti analitici in triplice copia ed esprimere i risultati come % di sostanza secca.
- Eseguire un'analisi uni-way della varianza (ANOVA) e confrontare i mezzi utilizzando il test di confronto multiplo di Tukey.
- Eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) .
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Representative Results
La figura 2A-C illustra la resa di lignina dell'estrazione dalle sei materie prime, illustrata nella figura 1A-F, dopo il pretrattamento combinato microonde-DES. I risultati mostrano che la resa di lignina ottenuta con DES1 (acido chcl-ossoalico) (figura 2A) era inferiore alle rese ottenute con DES2 (acido chcl-lattico) e DES3 (ChCl-urea)(figura 2B, C). Inoltre, le rese di lignina dalle pigne (PC) e dalle vinacce di ulivo (OP) erano più elevate rispettivamente del 32,31% e del 26,04% per il trattamento des1 e del 48,72% e del 43,76% per il DES3. La resa di lignina dalle foglie alfa (A) era significativamente superiore alle rese di tutte le altre lignine estratte con DES2. La figura 3A-C mostra che la purezza della lignina ha superato il 70% per i tre pretrattamenti delle biomasse, ad eccezione del pretrattamento DES3 delle foglie alfa (A), dell'aegagropile (Ag) e dei gusci di mandorle (AS) nel trattamento DES3 (ChCl-urea), che ha dato una purezza di lignina del 65%. La purezza della lignina più alta (> 90%) è stato ottenuto con il trattamento DES1: foglie alfa (A) 94%, gusci di mandorle (AS) 93%, pigne (PC) 90%, foglie di Posidonia (PL) 92% e vinacce di oliva (OP) 91%.
I dati sulla purezza e sulla resa della lignina sono stati sottoposti all'analisi dei componenti principali (PCA) considerando due parametri (resa e purezza) e 18 trattamenti. La figura 4 mostra che il cerchio di correlazione spiegava il 100% della variazione totale. Il primo componente, PCA1, ha spiegato il 58,09%, e il secondo componente, PCA2, ha spiegato il 41,91% della variazione totale. La purezza della lignina era positivamente correlata al trattamento DES1 (Ox). I coefficienti di correlazione di Pearson (R) erano alfa (A Ox) 0.32, sansa di oliva (OP Ox) 0,27, pigne (BUE PC) 0,2, foglie di Posidonia (PL Ox) 0,35, gusci di mandorle (AS Ox) 0,32 e aegagropile (Ag Ox) 0,05, rispettivamente. Tuttavia, il trattamento con DES3 era negativamente correlato con la resa di lignina con valori R che oscillavano tra −0,37 e −0,05. Pertanto, i risultati dell'APC hanno confermato che la lignina estratta con DES1 era la più pura con la resa più bassa.
La lignina è stata caratterizzata per il suo contenuto di zucchero, azoto e ceneri(figura 5A-C). Il tenore totale di zucchero è stato determinato dalla gascromatografia (GC). Il contenuto di carboidrati nella lignina è stato estratto utilizzando DES3 (ChCl-urea) è stato il più alto (6-15%). Segue la lignina estratta con DES2 (acido chcl-lattico), che aveva un contenuto di carboidrati del 3-12%. Tuttavia, il contenuto di carboidrati più basso (1%) è stato segnalato per la lignina estratta utilizzando DES1 (acido chcl-ossalico). Il tipo di zuccheri identificati differiva significativamente(figura 6A-C); Il D-xilosio e il D-glucosio erano i monosaccaridi più abbondanti. Questi risultati indicano che il DES1 è stato estremamente selettivo nella sua estrazione di lignina rispetto agli altri due DES, che hanno estratto non solo lignina, ma anche carboidrati. In altre parole, la purezza della lignina era inferiore dopo l'estrazione con l'acido lattico e l'urea DESs.
L'alta selettività del DES1 per frazionare la matrice lignocellulosica ed estrarre la lignina pura è probabilmente a causa dell'elevata acidità dei suoi legami idrogeno (alfa = 1,3). Il cloruro di colina contiene ioni cloruro che rompono le interazioni intramolecolari dei legami idrogeno, e i gruppi carbossilati nell'acido ossalico contribuiscono a sciogliere i polimeri di lignina. Analogamente, il tenore di azoto della lignina estratta con DES1 era inferiore al tenore di azoto della lignina estratta utilizzando DES2 e DES3, raggiungendo fino al 3%(figura 5A-C). La lignina estratta dalle foglie alfa aveva il più alto contenuto di azoto: 2,70, 3,84 e 3,40 rispettivamente per DES1, DES2 e DES3. Questi risultati dimostrano che i composti azotati sono stati estratti e co-precipitati con lignina. Inoltre, la calcinazione della lignina in tutti i campioni indicava che la lignina estratta utilizzando DES2 e DES3 conteneva un componente inorganico superiore rispetto alla lignina estratta utilizzando il DES1.
Questi risultati indicano che il DES1 ha promosso l'estrazione della lignina ad alta purezza, ma con basso contenuto di azoto, carboidrati e ceneri. In altre parole, la lignina estratta con DES1 (acido chcl-ossoalico) era più pura di quella estratta utilizzando DES2 (acido chcl-lattico) e DES3 (ChCl-urea), che possiede una purezza inferiore e un alto contenuto di azoto, carboidrati e ceneri. La tabella 1 riassume la distribuzione di massa molecolare della lignina, analizzata mediante cromatografia a permeazione del gel (GPC) e rappresentata dal peso molecolare medio-numero (Mn), dal peso molecolare medio del peso (Mw) e dall'indice di polidispersità (PDI). I valoriM w variavano da 48.123 a 147.233 g di mol-1. La lignina estratta dal DES2 da foglie alfa, gusci di mandorle e aegagropile aveva un PDI inferiore rispetto alla lignina estratta da DES1, DES3 e alcali, così come la lignina grezza. Al contrario, la lignina estratta dal DES2 da pigne, vinacce di ulivo e foglie di Posidonia mostrava una PDI più elevata. Il PDI inferiore della lignina estratta dall'egagropile indica che il suo peso molecolare è più omogeneo di quello delle lignine estratte dalle altre biomasse.
I gruppi funzionali chimici presenti nella lignina estratta sono stati studiati mediante spettroscopia FTIR(figura 7A-F). La banda forte e larga tra 3.441 e 3.198 cm-1 è stata attribuita alle vibrazioni oh stretching dei gruppi idrossili alcolici e fenolici coinvolti nell'incollaggio dell'idrogeno. I segnali nell'intervallo del numero d'onda 2.963-2.852 cm-1 sono stati assegnati alle vibrazioni di allungamento alchil C-H. Le vinacce di oliva, le foglie alfa e i gusci di mandorle mostravano fasce più intense rispetto alle altre biomasse. Nessuna bande è stata osservata da 2.800 a 1.800 cm-1. La lignina ottenuta dal trattamento DES1 e DES2, aveva una banda crescente a 1.708 cm-1, che indicava la presenza di gruppi C=O non coniugati. Tuttavia, questo segnale era assente negli spettri del solvente(figura 8B). Gli spettri di acido lattico e ossalico erano caratterizzati da una banda nella gamma 1.737-1.723 cm-1, che indicava la presenza di gruppi C=O non coniugati, mentre lo spettro dell'urea era caratterizzato da due segnali nell'intervallo del numero d'onda di 1.660 cm-1 e 1.604 cm-1 attribuiti ai gruppi di ammide. Le bande a 1.606-1.618 cm-1 sono state osservate nella lignina estratta dal trattamento DES1 e DES2, associata al tratto C=C coniugato ad anello.
Il segnale a 1.640 cm-1 in lignina estratta dal DES3 indicava la presenza di vibrazioni di allungamento C=O in gruppi carbonili coniugati di lignina. Il segnale a 1516 cm-1 è nato dalle vibrazioni degli anelli aromatici presenti nella lignina, mentre la banda a 1200 cm-1 indicava la presenza di gruppi di etere. Bande nell'intervallo del numero d'onda di 1.250-1.200 cm-1 sono state assegnate allo stiramento C-O di alcoli nonaromatici. La banda a 953 cm-1 fu assegnata ai sostituenti metile. I risultati indicano che gli spettri delle frazioni di DES-lignina hanno mostrato segnali a 1.730-1.702 cm-1 e 1.643-1.635 cm-1, assegnati rispettivamente alla vibrazione di allungamento di gruppi carbonilici non coniugati e coniugati. Tuttavia, queste gamme di bande erano assenti in tre lignine commerciali: lignine crude, trasformate in soda ed estratte alcalin(figura 8A). Questa osservazione indica che durante la sua estrazione e solubilizzazione, alcuni gruppi funzionali di lignina sono stati coniugati con acido ossalico e lattico.
Figura 1: Biomasse mediterranee studiate. (A) Gusci di mandorle, (B) Vinacced'oliva,( C ) Pini a cono, (D) Aegagropile (palline di Posidonia), (E) Foglie di Posidonia, (F) Foglie alfa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Resa di Lignina. (A) Cloruro di colina + acido ossalico (DES1), (B) Cloruro di colina + acido lattico (DES2), (C) Cloruro di colina + Urea (DES3). Differenze significative sono state determinate con il test post-hoc di ANOVA e Fisher (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Abbreviazioni: A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce di ulivo, Ag = Aegagropile; ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Lignina (%). Differenze significative sono state determinate con il test post hoc di ANOVA e Fisher (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Abbreviazioni: A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce di ulivo, Ag = Aegagropile; ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi principale dei componenti della resa e della purezza della lignina estratta dalle biomasse mediterranee. L'accettore di legame idrogeno (HBA) è cloruro di colina (ChCl) e i donatori di legami idrogeno (HBD) sono Ox = acido ossalico, Lac : acido lattico e Urea. PCA = analisi dei componenti principali; A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce d'ulivo, Ag = Aegagropile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Carboidrati (%), azoto (%) e tenore di ceneri (%) in campioni di lignina. (A) Cloruro di colina + acido ossalico (DES1), (B) Cloruro di colina + acido lattico (DES2), (C) Cloruro di colina + Urea (DES3). Differenze significative sono state determinate con il test post-hoc di ANOVA e Fisher (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Abbreviazioni: A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce di ulivo, Ag = Aegagropile; ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Identificazione dei monosaccaridi nei campioni di lignina (%). (A) Cloruro di colina + acido ossalico (DES1), (B) Cloruro di colina + acido lattico (DES2), (C) Cloruro di colina + Urea (DES3). Differenze significative sono state determinate con il test post-hoc di ANOVA e Fisher (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Abbreviazioni: A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce di ulivo, Ag = Aegagropile; ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Spettri infrarossia trasformata di fourier di campioni di lignina. (A) Foglie alfa, (B) Gusci di mandorle, (C) Pigne, (D) Foglie di posidonia, (E) Vinacce di oliva, (F) Aegagropile. Abbreviazioni: DES1 = Cloruro di colina + Acido ossalico, DES2 = Cloruro di colina + Acido lattico, DES3 = Cloruro di colina + Urea. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Controlli della lignina a trasformata di Fourier (A), donatori di legami idrogeno (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| campione | trattamento | Mn | Mw | Pdi |
| un | urea | 47558 | 120141 | 2.5 |
| lacca | 35241 | 73665 | 2.1 | |
| bue | 35793 | 84312 | 2.4 | |
| come | urea | 50181 | 105817 | 2.1 |
| lacca | 60409 | 104915 | 1.7 | |
| bue | 83112 | 147233 | 1.8 | |
| PC | urea | 34013 | 65181 | 1.9 |
| lacca | 55513 | 145963 | 2.6 | |
| bue | 46409 | 102298 | 2.2 | |
| Pl | urea | 25696 | 50093 | 1.9 |
| lacca | 45530 | 122900 | 2.7 | |
| bue | 28427 | 70726 | 2.5 | |
| Op | urea | 29669 | 70424 | 2.4 |
| lacca | 26735 | 66743 | 2.5 | |
| bue | 34161 | 75509 | 2.2 | |
| argentum | urea | 30184 | 48123 | 1.6 |
| lacca | 33835 | 52123 | 1.5 | |
| bue | 30025 | 49808 | 1.7 | |
| controllo | Lignina cruda | 23275.3 | 36496.5 | 1.6 |
| Lignina estratta dagli alcali | 22792.6 | 43014.3 | 1.9 |
Tabella 1: Pesi molecolari delle lignine. Abbreviazioni: A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce di ulivo, Ag = Aegagropile; Mn = peso molecolare medio-numero; Mw = peso molecolare medio ponderato; PDI = indice di polidispersità; Bue =acido ossalico; Lac = acido lattico.
Figura S1: Lignin. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura S2: Campioni dopo essere stati autoclavati (30 mg di lignina + 1 mL di acido solforico al 72% + 28 mL di acqua distillata). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura S3: Pellet di lignina. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura S4: Residuo solido lavato quattro volte per recuperare il massimo contenuto di lignina. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura S5: Cromatogrammi di permeazione del gel dei controlli della lignina, lignine crude ed estratte alcalin. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura S6: Cromatogrammi di permeazione del gel di campioni di lignina. Abbreviazioni: A = Foglie alfa, AS = Gusci di mandorle, PC = Pigne, PL = Foglie di Posidonia, OP = Vinacce di ulivo, Ag = Aegagropile; DES1 = cloruro di colina + acido ossalico, DES2 = cloruro di colina + acido lattico, DES3 = cloruro di colina + urea. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura S7: Foglio di flusso del solvente eutettico profondo (DES) -processo a microonde per l'estrazione della lignina. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo studio aveva molti obiettivi; il primo dei quali è stato quello di preparare e utilizzare solventi verdi a basso costo con le caratteristiche sia dei liquidi ionici che dei solventi organici. Il secondo obiettivo era quello di frazionare la biomassa ed estrarre la lignina in un'unica fase, senza richiedere fasi preliminari come l'estrazione di estraibili utilizzando Soxhlet o emicellulosa utilizzando solventi alcalini, tecniche di base o termofise. Il terzo obiettivo era quello di recuperare la lignina mediante semplice filtrazione dopo il trattamento, senza regolazione del pH, ma semplicemente aggiungendo acqua distillata. I risultati dell'estrazione ultraveloce della lignina da sei diverse fonti utilizzando il processo a microonde basato su DES utilizzando tre diversi DES indicano che la resa di estrazione può variare a seconda della biomassa e della natura del DES. Ad esempio, la più alta resa di estrazione di lignina tra tutti e tre i DES era da vinacce di oliva. Questo è stato seguito dalle rese di foglie alfa, pigne e gusci di mandorle. Le rese di estrazione erano più basse per le foglie e le palline di Posidonia oceanica.
La purezza della lignina è stata valutata utilizzando i metodi Klason, Kjeldahl (azoto), carboidrati (GC) e cenere. Come illustrato nella figura 3 e nella figura 5A-C, la purezza della lignina è diminuita a causa della co-precipitazione di componenti di azoto, carboidrati e ceneri con lignina. Le condizioni per l'estrazione della lignina con DES1 hanno garantito un'elevata purezza, ma una bassa resa, indicando che i miglioramenti del processo sono necessari per la correlazione positiva tra resa e purezza della lignina. La resa di lignina può essere migliorata se la durata del trattamento è più lunga, la potenza a microonde viene aumentata da 800 W a 1200 W o il rapporto tra solido:solvente (1:10) è ridotto. I dati sul peso molecolare della lignina forniscono una visione della dissociazione o della ripolimerizzazione dei frammenti di lignina dopo il trattamento. Un aumento del Mw di lignina per le biomasse è stato osservato dopo l'estrazione con microonde-DES, come è evidente, ad esempio, nel caso delle foglie di Posidonia (il Mw è 50093 per DES3 ed è 70726 per DES1), il che dimostra che la depolimerizzazione si è verificata durante l'estrazione della lignina ed è stata seguita da una rapida ripolimerizzazione dell'interunità carbonio-carbonio sotto l'azione del DES. Ciò richiede l'uso di un agente di acquisizione, ad esempio la formaldeide, per stabilizzare la distribuzione.
Nel pretrattamento del DES, la dissociazione e la condensazione della lignina sono le due reazioni concorrenti. Il PDI delle lignine estratte è inferiore a quello della lignina di faggio estratta da solventi organici (etanolo/acqua/H2SO4)riportata nella letteratura17. Ciò indica che il trattamento DES migliora l'omogeneità del peso molecolare nella lignina rispetto al trattamento con solventi organici. Gli spettri FTIR indicano che i gruppi funzionali di lignina sono influenzati dal solvente DES utilizzato. Gli spettri mostrano segnali a 1.730-1.702 cm-1 assegnati alla vibrazione di allungamento di gruppi carbonilici non coniugati, mentre picchi a 1.643-1.635 cm-1 indicano la vibrazione di allungamento dei gruppi carbonilici coniugati. Questi risultati dimostrano la possibilità di estrarre lignina a valore aggiunto ad alta purezza dalle biomasse mediterranee (attualmente sottovalutata e utilizzata come mangime o come modifica del suolo) e possono contribuire a determinare il solvente DES ottimale garantendo nel contempo la purezza della lignina. Ad esempio, il DES1 dimostrò l'estrazione più pura della lignina, anche se con una resa inferiore a quella osservata usando gli altri due DES.
Il metodo proposto può essere applicato facilmente grazie al sistema di solvente eutettico profondo acido chcl-ossalico economico e verde. Il cloruro di colina è un sale organico e l'acido ossalico è disponibile come prodotto naturale delle piante, che sono abbondanti a basso costo. Questa tecnica (un protocollo ultraveloce, che in un passaggio fornisce il frazionamento della biomassa e il recupero di lignina ad alta purezza) è applicabile a qualsiasi tipo di biomassa lignocellulosica che abbia una composizione chimica simile a quella studiata qui su scala di laboratorio utilizzando il processo microonde-DES o su scala pilota utilizzando il processo DES-ultrasuoni o mediante riscaldamento convettivo.
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Disclosures
Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
MK e TB ringraziano Haitham Ayeb per le analisi statistiche e la preparazione delle figure, la regione vallone (Sviluppo regionale europeo-VERDIR) e il ministro dell'istruzione superiore e della ricerca scientifica (Taoufik Bettaieb) per il finanziamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC Gel Permeation Chromatography | Agilent 1200 series | ||
| 1 methylimadazole | Acros organics | ||
| 2-deoxy-D-glucose (internal standard) | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Acetic acid | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Adjustables pipettors | |||
| Alkali | alkali-extracted lignin | ||
| Arabinose (99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Autoclave | CERTO CLAV (Model CV-22-VAC-Pro) | ||
| Water Bath at 70 °C | |||
| Boric acid | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Bromocresol | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Catalyst | CTQ (coded A22) (1.5 g K2SO4 + 0.045 g CuSO4.5 H2O + 0.045 g TiO2) | Merck | |
| Centrifugation container | |||
| Centrifuge | BECKMAN COULTER | Avanti J-E centrifuge | |
| Ceramic crucibles | |||
| Choline chloride 99% | Acros organics | ||
| Column | Agilent PLGel Mixed C (alpha 3,000 (4.6 × 250 mm, 5 µm) preceded by a guard column (TSK gel alpha guard column 4.6 mm × 50 mm, 5 µm) | ||
| Column | HP1-methylsisoxane (30 m, 0.32 mm, 0.25 mm) | ||
| Crucible porosity N°4 ( Filtering crucible) | Shott Duran Germany | boro 3.3 | |
| Deonized water | |||
| Dessicator | |||
| Dimethylformamide | VWR BDH Chemicals | ||
| Dimethylsulfoxide | Acros organics | ||
| Erlenmeyer flask | |||
| Ethanol | Merck (Darmstadtt, Germany) | ||
| Filtering crucibles, procelain | |||
| Filtration flasks | |||
| Fourrier Transformed Inra- Red | Vertex 70 Bruker apparatus equipped with an attenuated total reflectance (ATR) module. Spectra were recorded in the 4,000–400 cm−1 range with 32 scans at a resolution of 4.0 cm−1 |
||
| Galactose (98% | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Gaz Chromatography | Agilent (7890 series) | ||
| Glass bottle 100 mL | |||
| Glass tubes ( borosilicate) with teflon caps 10 mL | |||
| Glucose (98% | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Golves | |||
| Graduated cylinder 50 mL /100 mL | |||
| H2SO4 Titrisol (0.1 N) | Merck (Darmstadtt, Germany) | ||
| H2SO4 (95-98%) | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | BUCHI R-114) | |
| Hummer cutter equiped with 1 mm and 0.5 mm sieve | Mill Ttecator (Sweden) | Cyclotec 1093 | |
| Indulin | Raw lignin control | ||
| Kjeldahl distiller | Kjeltec 2300 (Foss) | ||
| Kjeldahl tube | FOSS | ||
| Kjeldhal rack | |||
| Kjeldhal digester | Kjeltec 2300 (Foss) | ||
| Kjeldhal suction system | |||
| Lab Chem station Software | GC data analysis | ||
| Lactic acid | Merck (Darmstadtt, Germany) | ||
| Lithium chloride LiCl | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Mannose (98%) | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Methyl red | |||
| Microwave | START SYNTH MILESTONE Microwave laboratory system | ||
| Microwave temperature probe | |||
| Microwave container | |||
| Muffle Furnace | |||
| NaOH | Merck (Darmstadtt, Germany) | ||
| Nitrogen free- paper | |||
| Opus | spectroscopy software | ||
| Oven | GmbH Memmert SNB100 | Memmert SNB100 | |
| Oxalic acid | VWR BDH Chemicals | ||
| P 1000 | Soda-processed lignin | ||
| pH paper | |||
| precision balance | |||
| Infrared spectroscopy | |||
| Quatz cuvette | |||
| Rhamnose (98%) | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Rotary vacuum evaporator | Bucher | ||
| Round-bottom flask 500 mL | |||
| sodium borohydride NaBH4 | |||
| Schott bottle | glass bottle | ||
| Sovirel tubes | sovirel | Borosilicate glass tubes | |
| Spatule | |||
| Special tube | |||
| Spectophotometer | UV-1800 Shimadzu | ||
| Sterilization indicator tape | |||
| Stir bar in teflon | |||
| Stirring plate | |||
| Syringes | |||
| Sodium borohydride | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) | ||
| Titrisol | Merck | Merck 109984 | 0.1 N H2SO4 |
| Urea | VWR BDH Chemicals | ||
| Vials | |||
| VolumetriC flask 2.5 L /5 L | Bucher | ||
| Vortex | |||
| Xylose (98%) | Sigma Aldrich (St. Louis, USA) |
References
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