Målet med denne protokol er at muliggøre problemfri CRISPR /Cas9 redigering af C. elegans genom ved hjælp af samlede ribonucleoprotein komplekser og dpy-10 co-CRISPR markør til screening. Denne protokol kan bruges til at foretage en række genetiske modifikationer i C. elegans herunder indsættelser, sletninger, generstatninger og codon substitutioner.
Den bakterielle Clustered Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associeret protein (Cas) system er blevet udnyttet af forskere til at studere vigtige biologisk relevante problemer. Crispr/Cas genomredigeringsmetodens enestående effekt gør det muligt for forskere præcist at redigere enhver græshoppe efter eget valg og derved lette en øget forståelse af genfunktion. Flere metoder til redigering af C. elegans genomet af CRISPR / Cas9 er blevet beskrevet tidligere. Her diskuterer og demonstrerer vi en metode, der anvender in vitro-samlede ribonucleoproteinkomplekser og dpy-10 co-CRISPR-markøren til screening. Specifikt gennemgår vi i denne artikel den trinvise proces med at introducere for tidlige stop codons i C. elegans rbm-3.2-genet ved homologi-rettet reparation ved hjælp af denne metode til CRISPR / Cas9-redigering. Denne relativt enkle redigeringsmetode kan bruges til at studere funktionen af ethvert interessegen og giver mulighed for generering af homozygot-redigerede C. elegans af CRISPR / Cas9 redigering på mindre end to uger.
Den clustered regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associeret protein (Cas) teknologi muliggør effektiv målrettet genomredigering i en bred vifte af organismer1,2,3,4. CRISPR-systemet blev først opdaget som en del af et prokaryote antiviralt immunrespons5,6,7. Type II CRISPR-systemet bruger en endonuclease som Cas9, en transaktiverende RNA (tracrRNA) og en kort DNA-specifik 20-nukleotid lang guide CRISPR RNA (crRNA) til at genkende en “NGG” Protospacer Tilstødende Motiv (PAM) og gøre en dobbeltstrenget pause i målet DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Denne dobbeltstrengede pause er anerkendt som en læsion af de cellulære DNA-reparationsmaskiner. Derfor kan den genererede dobbeltstrengede pause repareres af en af to veje- i) Ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) eller ii) Homology-rettet reparation (HDR)13. NHEJ er ofte fejlbehæftet, og derfor, når denne vej bruges til at reparere den dobbeltstrengede pause i mål-DNA’et, forårsager det ofte inaktiverende mutationer (indsættelser, sletninger) i interessegen. På den anden side, ved at levere en udefrakommende reparation skabelon med homology til begge sider af dobbelt-streng pause, den cellulære DNA reparation maskiner kan instrueres til at bruge HDR til at reparere pause13. HDR-metoden muliggør således præcis redigering af ethvert locus af interesse.
En række CRISPR/Cas9-genredigeringsprotokoller er blevet beskrevet for C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De mest anvendte CRISPR/Cas9-redigeringsmetoder i C. elegans omfatter både kloningsbaserede og kloningsfrie protokoller til generering af reparationsskabeloner til CRISPR/Cas9-redigering14,15,16,17,18,19,20. Denne protokol diskuterer i detaljer en kloningsfri CRISPR/Cas9-redigeringsprotokol baseret på brug af dpy-10 som co-CRISPR-markør til screening. Indtil nu, den eneste detaljerede C. elegans-fokuseretCRISPR / Cas9 redigering video protokol, der findes udnytter en fluorescerende markør for screening21. Men ved hjælp af en fluorescerende markør til screening kræver adgang til et fluorescensmikroskop, som mange laboratorier på små primært bachelorinstitutioner (PUI’ er) kan have svært ved at få adgang til. Det er opmuntrende at bemærke , at der er opnået positive korrelative resultater i tidligere undersøgelser mellem orme , der bærer fluorescerende markører, og tilstedeværelsen af redigering21,22. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at bestemme den samlede effektivitet af den fluorescensbaserede screeningsmetode til redigering af en lang række loci med forskellige vejledning RNA’er og reparationsskabeloner. Endelig, da plasmider kodning for disse fluorescerende markører danner ekstrakromosom arrays, variabel fluorescens er ofte fremstillet af disse arrays, der kan gøre positiver vanskeligt at identificere23. Selv om den fluorescensbaserede screeningsmetode kan være nyttig at anvende, kan ovennævnte spørgsmål derfor begrænse dens anvendelighed.
Brug af en co-CRISPR-markør, der producerer en synlig fænotype, reducerer i høj grad antallet af afkom, der skal screenes for at finde en positivt redigeret orm23,24,25,26,27,28. Det er vigtigt, at de fænotyper, der produceres af dissemarkører,let kan detekteres under et simpelt dissekeringmikroskop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Dpy-10 co-CRISPR markør er en af de bedst karakteriserede og udbredte co-CRISPR markører til udførelse af C. elegans CRISPR / Cas9 genom redigering24,27. Derfor vil denne artikel diskutere metoden til udførelse af CRISPR / Cas9 redigering i C. elegans ved hjælp af direkte levering af ribonucleoprotein komplekser med dpy-10 som en co-CRISPR markør27,35. I denne metode består den forberedte redigeringsindsprøjtningsblanding af en velkarakteriseret dpy-10 crRNA og dpy-10 reparationsskabelon for at mægle i generationen af en observerbar dominerende “roller” (Rol) fænotype, der tildeles af en kendt heterozygot dpy-10(cn64) mutation inden for dpy-10 genet 24,27,29. Når den er til stede i sin homozygoøse tilstand, forårsager dpy-10(cn64) mutationen en dumpy (Dpy) fænotype, der producerer kortere og stouter orme24,29. Rol-fænotypen medieres ved nøjagtig indsættelse af den medfølgende dpy-10 reparationsskabelon i en enkelt kopi af dpy-10-genet ved HDR-medieret CRISPR/Cas9-redigering. Derfor indikerer udseendet af Rol C. elegans en vellykket injektion samt en vellykket HDR-medieret redigeringshændelse i den injicerede orm celler. Da crRNA og reparationsskabelonen for målgen af interesse er i samme injektionsblanding med dpy-10 crRNA- og dpy-10-reparationsskabelonen, er der en god chance for, at de identificerede Rol-orme også samtidig blev redigeret ved målgen af interesse. Derfor screenes disse Rol orme derefter for redigering af interesse ved teknikker som polymerasekædereaktion (PCR) (til redigeringer større end 50 bp) eller af PCR efterfulgt af begrænsning fordøjelse (for redigeringer mindre end 50 bp).
Fordelene ved at bruge denne metode til genomredigering er: i) CRISPR-redigeringer kan genereres med en relativt høj effektivitet (2% til 70%) ved hjælp af denne metode27; ii) reparationsskabelonerne og vejledningsRNA’erne, der anvendes i denne metode, indebærer ikke kloning, hvorved den tid, der kræves til deres generation, reduceres. iii) ved at samle ribonucleoproteinkomplekser in vitrokan koncentrationerne af de samlede redigeringskomplekser opretholdes relativt konstant og derved forbedre reproducerbarheden; iv) nogle vejledende RNA’er, der undlader at generere redigeringer, når de udtrykkes fra plasmider, har vist sig at arbejde for CRISPR/Cas9-genomredigering, når de leveres som in vitro transskriberede crRNAs27; v) herunder dpy-10 co-CRISPR-markøren muliggør nem screening ved hjælp af et dissekeringmikroskop og reducerer antallet af afkom, der skal screenes for at finde positive24,27; og vi) DNA sekventering verificeret homozygot-redigeret orm linjer kan opnås ved denne metode inden for et par uger19,27.
Fremragende bog kapitler vedrørende mange forskellige C. elegans CRISPR metoder er blevet offentliggjort14,15,16,17,18,19,20,43. Demonstrationen af co-CRISPR-metoden dpy-10 i et videoformat i laboratorieindstilling mangler dog i øjeblikket. I denne artikel beskriver og demonstrerer vi processen med at bruge dpy-10 co-CRISPR-metoden til at redigere et repræsentativt målgen ved navn rbm-3.2, et putativt RNA-bindende protein (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Specifikt beskriver vi her i detaljer metoden til at indføre tre for tidlige stop codons inden for C. elegans rbm-3.2 genet ved hjælp af in vitro samlet ribonucleoprotein komplekser og en exogent leveret lineær enkeltstrenget reparation skabelon. Disse undersøgelser har haft succes med at generere den første C. elegans CRISPR stamme med for tidlig stop codons i rbm-3.2 genet. Da der i øjeblikket ikke er meget kendt med hensyn til funktionen af dette gen i C. elegans, vil denne stamme tjene som et nyttigt værktøj til dissekere funktionen af RMB-3.2. Denne metode kan også anvendes til at foretage indsættelser, udskiftninger, og sletninger på ethvert græshoppe inden for C. elegans genom.
Vi har brugt ovenstående protokol til at redigere flere gener udover rbm-3.2. Vores redigeringseffektivitet for forskellige loci, guide RNA’er og reparationsskabeloner (enkeltstrengede og dobbeltstrengede) har varieret mellem 2% og 58% (data ikke vist). De observerede redigeringseffektiviteter kan sammenlignes med de tidligere rapporterede redigeringseffektiviteter på 2 % til 70 % for denne protokol27. Vi har også haft succes med at bruge denne teknik til at gøre gen sletninger. Ved hjælp af to crRNAs erstattede vi et gen, der er tæt på 6 kb i længden med kodningssekvensen for grønt fluorescerende protein (GFP) (data, der ikke er vist). Til dette eksperiment viste det sig, at ca. 14 % af de Rol F 1-orme, der blev analyseret, var positive for gensletning og udskiftning med GFP (data, der ikke blev vist). Der kræves dog yderligere eksperimenter for at bestemme den maksimale længde af gensletninger og udskiftninger, der kan udføres ved hjælp af denne teknik.
Denne teknik kan bruges til at foretage indsættelser, der er omkring 1,6 kb i længden19. En nylig undersøgelse har vist, at for at gøre indsættelser, der er over 1,6 kb i længden ved hjælp af denne protokol, generere to dobbelt-streng pauser og ved hjælp af reparation skabeloner med længere homology arme kan gøre det muligt at indsætte meget større fragmenter af DNA (~ 10 Kb)28. Alternativt kan der udføres flere runder af genredigering med denne protokol for at generere større redigeringer. Andre plasmidbaserede C. elegans CRISPR/Cas9-genredigeringsprotokoller kan også anvendes til CRISPR-eksperimenter , der involverer indsættelse af DNA-fragmenter større end 1,6 kb46,47,48.
Før du bruger denne protokol til genredigering, er det nødvendigt at sikre, at genet af interesse ikke er knyttet til dpy-10 græshoppe på kromosom II. I tilfælde af et mål gen er knyttet til dpy-10, kan det være problematisk at adskille dpy-10 mutation væk fra din redigering af interesse. I tilfælde af at interessegen er knyttet til dpy-10-locus, kan andre co-CRISPR-markører som unc-58 (X-kromosom),unc-22 eller zen-4 (kromosomIV) og ben-1 eller pha-1 (kromosom III), der er placeret på forskellige kromosomer, anvendes24,25,26,28. Data fra Meyer lab viser, at ben-1 og zen-4 mutationer kan bruges som succesfulde co-CRISPR markører til screening med denne metode28. Det er dog vigtigt at bemærke, at brug af zen-4 og pha-1 som co-CRISPR markører kræver at udføre CRISPR eksperiment i ikke-vilde-type zen-4 (cle10ts) eller pha-1(e2123ts) baggrunde henholdsvis26,28. Crispr-eksperimenter med visse CO-CRISPR-markører som ben-1 kan desuden kræve fremstilling af specielle plader (f.eks. plader, der indeholder benzimidazol)28. Vi har med succes brugt unc-58 co-CRISPR-mærket til at screene for positive redigeringer for et gen, der er knyttet til dpy-10 ved hjælp af denne metode (data ikke vist). UNC-58(e665) mutationen giver en synlig fænotype (lammelse), der effektivt kan bruges til at screene for positivt redigerede orme24. Alternativt, hvis adgang til et fluorescerende mikroskop er tilgængeligt, kan et fluorescerende mærket gtbp-1-gen også bruges som co-CRISPR-markør for denne protokol19.
For en høj redigeringseffektivitet, mens du bruger denne metode til genomredigering, skal redigeringsstedet være inden for 10 til 30 baser fra Cas9-skærestedet. Hvis redigeringsstedet er over 30 baser væk fra Cas9-skærestedet, falder redigeringseffektiviteten drastisk19,35,37. Men en nylig undersøgelse fra Meyer lab har vist, at skabe to dobbelt-streng pauser i en afstand fra hinanden kan gøre det muligt at indsætte redigeringer langt væk fra Cas9 cut site ved hjælp af denne protokol28.
I den aktuelle protokol er reparationsskabelonen designet, så alle tre indsatte stop codons vises i samme læseramme. Men en alternativ strategi for at skabe null-mutanter ville være at bruge en universel 43-baser lang knock-in STOP-IN kassette, der er blevet beskrevet tidligere50. Vigtigere, denne kassette har stop codons i alle de tre mulige læserammer og forårsager frameshift mutationer. Dette er en særlig nyttig strategi til generering af null-mutanter, når der sker forkert eller ufuldstændig reparation på redigeringsstedet.
Afslutningsvis vil jeg sige, at dette på grund af dens korte varighed og de seneste fremskridt inden for denne metode er en fremragende metode til rutinemæssige laboratorieforsøg, der involverer tilsætning af korte immunogene epitoptags, fluorescerende tags, fremstilling af gensletninger, generstatninger og codonsubstitutioner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af University of Tulsa (TU) start-up midler og TU Faculty Development Summer Fellowship tildelt Jyoti Iyer. Vi vil gerne takke Kemi Summer Undergraduate Research Program (CSURP) og Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) for tildeling af stipendier til de studerende, der er involveret i denne undersøgelse. Vi vil gerne anerkende Miss Caroline Dunn for hendes tekniske hjælp. Endelig vil vi gerne takke Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter og Saili Moghe for deres kritiske kommentarer til dette manuskript.
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |