Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.
Het bacteriële Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) systeem is door onderzoekers gebruikt om belangrijke biologisch relevante problemen te bestuderen. De ongeëvenaarde kracht van de CRISPR/Cas-genoombewerkingsmethode stelt onderzoekers in staat om elke locus van hun keuze nauwkeurig te bewerken, waardoor een beter begrip van de genfunctie wordt vergemakkelijkt. Verschillende methoden voor het bewerken van het C. elegans-genoom door CRISPR / Cas9 zijn eerder beschreven. Hier bespreken en demonstreren we een methode die gebruik maakt van in vitro geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. In dit artikel gaan we specifiek door het stapsgewijze proces van het introduceren van voortijdige stopcodons in het C. elegans rbm-3.2-gen door homologiegerichte reparatie met behulp van deze methode van CRISPR / Cas9-bewerking. Deze relatief eenvoudige bewerkingsmethode kan worden gebruikt om de functie van elk interessant gen te bestuderen en maakt het mogelijk om homozygoot-bewerkte C. elegans te genereren door CRISPR / Cas9-bewerking in minder dan twee weken.
De Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) technologie maakt efficiënte gerichte genoombewerking mogelijk in een breed scala van organismen1,2,3,4. Het CRISPR-systeem werd voor het eerst ontdekt als onderdeel van een prokaryote antivirale immuunrespons5,6,7. Het Type II CRISPR-systeem maakt gebruik van een endonuclease zoals Cas9, een transactiverend RNA (tracrRNA) en een korte, doel-DNA-specifieke 20-nucleotide lange gids CRISPR-RNA (crRNA) om een “NGG” Protospacer Adjacent Motif (PAM) te herkennen en een dubbelstrengs breuk te maken in het doel-DNA5,6,7,8,9,10,11,12. Deze dubbelstrengs breuk wordt herkend als een laesie door de cellulaire DNA-reparatiemachinerie. Bijgevolg kan de gegenereerde dubbelstrengs breuk worden gerepareerd door een van de twee paden: i) Niet-homologe eindvoeging (NHEJ) of ii) Homologie-gerichte reparatie (HDR)13. NHEJ is vaak foutgevoelig en daarom, wanneer deze route wordt gebruikt om de dubbelstrengs breuk in het doel-DNA te repareren, veroorzaakt het vaak inactiverende mutaties (inserties, deleties) in het gen van belang. Aan de andere kant, door een exogene reparatiesjabloon te leveren met homologie aan weerszijden van de dubbelstrengsbreuk, kan de cellulaire DNA-reparatiemachinerie worden aangestuurd om HDR te gebruiken om de breuk te repareren13. De HDR-methode maakt dus nauwkeurige bewerking van elke locus van belang mogelijk.
Een verscheidenheid aan CRISPR / Cas9-genbewerkingsprotocollen zijn beschreven voor C. elegans14,15,16,17,18,19,20. De meest gebruikte CRISPR / Cas9-bewerkingsmethoden in C. elegans omvatten zowel op klonen gebaseerde als kloonvrije protocollen om reparatiesjablonen te genereren voor CRISPR / Cas9-bewerking14,15,16,17,18,19,20. Dit protocol bespreekt in detail een kloonvrij CRISPR/Cas9-bewerkingsprotocol op basis van het gebruik van dpy-10 als co-CRISPR-marker voor screening. Tot nu toe maakt het enige gedetailleerde C. elegans-gerichteCRISPR / Cas9-bewerkingsvideoprotocol dat bestaat gebruik van een fluorescerende marker voor screening21. Het gebruik van een fluorescerende marker voor screening vereist echter toegang tot een fluorescentiemicroscoop, die veel laboratoria bij kleine voornamelijk niet-gegradueerde instellingen (PUI’s) moeilijk toegankelijk kunnen vinden. Het is bemoedigend om op te merken dat positieve correlatieve resultaten zijn verkregen in eerdere studies tussen wormen die fluorescerende markers dragen en de aanwezigheid van de edit21,22. Er zijn echter aanvullende studies nodig om de algehele efficiëntie van de op fluorescentie gebaseerde screeningsmethode te bepalen voor het bewerken van een breed scala aan loci met verschillende gids-RNA’s en reparatiesjablonen. Ten slotte, aangezien de plasmiden die coderen voor deze fluorescerende markers extrachromosomale arrays vormen, wordt vaak variabele fluorescentie geproduceerd uit deze arrays die het moeilijk kunnen maken om positieven te identificeren23. Hoewel de op fluorescentie gebaseerde screeningsmethode nuttig kan zijn om toe te passen, kunnen de bovengenoemde problemen de toepasbaarheid ervan beperken.
Het gebruik van een co-CRISPR-marker die een zichtbaar fenotype produceert, vermindert het aantal nakomelingen dat moet worden gescreend om een positief bewerkte worm te vinden23,24,25,26,27,28. Belangrijk is dat de fenotypen die door deze markers worden geproduceerd, gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd onder een eenvoudige ontleedmicroscoop23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. De dpy-10 co-CRISPR marker is een van de best gekarakteriseerde en meest gebruikte co-CRISPR markers voor het uitvoeren van C. elegans CRISPR/Cas9 genome editing24,27. Daarom zal dit artikel de methode bespreken voor het uitvoeren van CRISPR / Cas9-bewerking in C. elegans met behulp van de directe afgifte van ribonucleoproteïnecomplexen met dpy-10 als een co-CRISPR-marker27,35. In deze methode bestaat de voorbereide bewerkingsinjectiemix uit een goed gekarakteriseerd dpy-10 crRNA en dpy-10 reparatiesjabloon om de generatie van een waarneembaar dominant “roller” (Rol) fenotype te bemiddelen dat wordt verleend door een bekende heterozygote dpy-10 (cn64) mutatie binnen het dpy-10 gen24,27,29. Wanneer aanwezig in zijn homozygote toestand, veroorzaakt de dpy-10 (cn64) mutatie een dumpy (Dpy) fenotype dat kortere en stoutere wormen produceert24,29. Het Rol-fenotype wordt gemedieerd door de nauwkeurige invoeging van de gelijktijdig geleverde dpy-10-reparatiesjabloon in een enkele kopie van het dpy-10-gen door HDR-gemedieerde CRISPR / Cas9-bewerking. Daarom duidt het verschijnen van Rol C. elegans op een succesvolle injectie en een succesvolle HDR-gemedieerde bewerkingsgebeurtenis in de cellen van de geïnjecteerde worm. Aangezien het crRNA en het reparatiesjabloon van het doelgen van belang zich in dezelfde injectiemix bevinden met de dpy-10 crRNA en dpy-10 reparatiesjabloon, is de kans groot dat de geïdentificeerde Rol-wormen ook tegelijkertijd werden bewerkt op het doelgen van belang. Daarom worden deze Rol-wormen vervolgens gescreend op de bewerking van belang door technieken zoals polymerasekettingreactie (PCR) (voor bewerkingen groter dan 50 bp) of door PCR gevolgd door restrictieve vertering (voor bewerkingen minder dan 50 bp).
De voordelen van het gebruik van deze methode voor genoombewerking zijn: i) CRISPR-bewerkingen kunnen met deze methode met een relatief hoog rendement (2% tot 70%) worden gegenereerd27; ii) de reparatiesjablonen en geleideRNA’s die bij deze methode worden gebruikt, omvatten geen klonen, waardoor de tijd die nodig is voor het genereren ervan wordt verkort; iii) door ribonucleoproteïnecomplexen in vitrote assembleren, kunnen de concentraties van de geassembleerde bewerkingscomplexen relatief constant worden gehouden, waardoor de reproduceerbaarheid wordt verbeterd; iv) van sommige gids-RNA’s die geen bewerkingen genereren wanneer ze worden uitgedrukt uit plasmiden, is aangetoond dat ze werken voor CRISPR/Cas9-genoombewerking wanneer ze worden geleverd als in vitro getranscribeerde cRNA’s27; v) het opnemen van de dpy-10 co-CRISPR-marker maakt eenvoudige screening met behulp van een ontleedmicroscoop mogelijk en vermindert het aantal nakomelingen dat moet worden gescreend om positieven te vinden24,27; en vi) DNA-sequencing geverifieerde homozygoot-bewerkte wormlijnen kan met deze methode worden verkregen binnen een paar weken19,27.
Uitstekende boekhoofdstukken met betrekking tot veel verschillende C. elegans CRISPR-methoden zijn gepubliceerd14,15,16,17,18,19,20,43. De demonstratie van de dpy-10 co-CRISPR-methode in een videoformaat in een laboratoriumomgeving ontbreekt momenteel echter. In dit artikel beschrijven en demonstreren we het proces van het gebruik van de dpy-10 co-CRISPR-methode om een representatief doelgen genaamd rbm-3.2 te bewerken, een vermeende RNA-bindende eiwit (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). In het bijzonder beschrijven we hier in detail de methode voor het introduceren van drie voortijdige stopcodons in het C. elegans rbm-3.2-gen met behulp van in vitro geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en een exogene geleverde lineaire enkelstrengs reparatiesjabloon. Deze studies zijn succesvol geweest in het genereren van de eerste C. elegans CRISPR-stam met voortijdige stopcodons in het rbm-3.2-gen. Aangezien er momenteel niet veel bekend is over de functie van dit gen in C. elegans, zal deze stam dienen als een nuttig hulpmiddel bij het ontleden van de functie van RMB-3.2. Deze methode kan ook worden gebruikt om inserties, substituties en deleties te maken op elke locatie in het C. elegans-genoom.
We hebben het bovenstaande protocol gebruikt om verschillende genen naast rbm-3.2 te bewerken. Onze bewerkingsefficiëntie voor verschillende loci, gids-RNA’s en reparatiesjablonen (enkelstrengs en dubbelstrengs) varieerde tussen 2% en 58% (gegevens niet weergegeven). De waargenomen bewerkingsefficiënties zijn vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde bewerkingsefficiënties van 2% tot 70% voor dit protocol27. We zijn ook succesvol geweest in het gebruik van deze techniek bij het maken van gendeleties. Met behulp van twee crRNA’s hebben we een gen vervangen dat bijna 6 kb lang is door de coderende sequentie voor groen fluorescerend eiwit (GFP) (gegevens niet weergegeven). Voor dit experiment bleek ongeveer 14% van de Rol F1-wormen die werden geanalyseerd positief te zijn voor de gendeletie en vervanging door GFP (gegevens niet getoond). Er zijn echter aanvullende experimenten nodig om de maximale lengte van gendeleties en vervangingen te bepalen die met deze techniek kunnen worden uitgevoerd.
Deze techniek kan worden gebruikt om inserties te maken die ongeveer 1,6 kb lang zijn19. Een recente studie heeft aangetoond dat voor het maken van inserties die meer dan 1,6 kb lang zijn met behulp van dit protocol, het genereren van twee dubbelstrengsbreuken en het gebruik van reparatiesjablonen met langere homologiearmen de inbrenging van veel grotere DNA-fragmenten (~ 10 Kb) mogelijk kan maken28. Als alternatief kunnen meerdere rondes van genbewerking met dit protocol worden uitgevoerd om grotere bewerkingen te genereren. Andere op plasmide gebaseerde C. elegans CRISPR / Cas9-genbewerkingsprotocollen kunnen ook worden aangenomen voor CRISPR-experimenten waarbij DNA-fragmenten groter dan 1,6 kb46,47,48worden ingebracht.
Voordat u dit protocol voor genbewerking gebruikt, moet u ervoor zorgen dat het betreffende gen niet is gekoppeld aan de dpy-10-locus op chromosoom II. In het geval van een doelgen dat gekoppeld is aan dpy-10, kan het problematisch zijn om de dpy-10 mutatie weg te scheiden van uw bewerking van interesse. Daarom, in het geval dat het gen van belang is gekoppeld aan de dpy-10 locus, kunnen andere co-CRISPR-markers zoals unc-58 (X-chromosoom),unc-22 of zen-4 (chromosoom IV) en ben-1 of pha-1 (chromosoom III) die zich op verschillende chromosomen bevinden, worden gebruikt24,25,26,28. Gegevens van het Meyer-lab tonen aan dat ben-1- en zen-4-mutaties kunnen worden gebruikt als succesvolle co-CRISPR-markers voor screening met deze methode28. Het is echter belangrijk op te merken dat het gebruik van zen-4 en pha-1 als co-CRISPR-markers het uitvoeren van het CRISPR-experiment vereist in niet-wild-type zen-4 (cle10ts) of pha-1 (e2123ts) achtergronden respectievelijk26,28. Verder kunnen CRISPR-experimenten met sommige co-CRISPR-markers zoals ben-1 de bereiding van speciale platen vereisen (bijv. Platen met benzimidazol)28. We hebben met succes de unc-58 co-CRISPR-marker gebruikt om te screenen op positieve bewerkingen voor een gen dat is gekoppeld aan de dpy-10 met behulp van deze methode (gegevens niet weergegeven). De unc-58(e665) mutatie verleent een zichtbaar fenotype (verlamming) dat effectief kan worden gebruikt om te screenen op positief bewerkte wormen24. Als alternatief, als toegang tot een fluorescerende microscoop beschikbaar is, kan een fluorescerend getagd gtbp-1-gen ook worden gebruikt als co-CRISPR-marker voor dit protocol19.
Voor een hoge bewerkingsefficiëntie tijdens het gebruik van deze methode van genoombewerking, moet de bewerkingsplaats zich binnen 10 tot 30 basen van de Cas9-snijplaats liggen. Als de bewerkingssite meer dan 30 bases verwijderd is van de Cas9-snijsite, daalt de bewerkingsefficiëntie drastischmet 19,35,37. Een recente studie van het Meyer-lab heeft echter aangetoond dat het creëren van twee dubbelstrengsbreuken op afstand van elkaar het invoegen van bewerkingen ver weg van de Cas9-snijlocatie mogelijk kan maken met behulp van dit protocol28.
In het huidige protocol is de reparatiesjabloon zo ontworpen dat alle drie de ingevoegde stopcodons in hetzelfde leesframe verschijnen. Een alternatieve strategie om null-mutanten te maken zou echter zijn om een universele 43-basen lange knock-in STOP-IN cassette te gebruiken die eerder is beschreven50. Belangrijk is dat deze cassette stopcodons heeft in alle drie de mogelijke leesframes en frameshift-mutaties veroorzaakt. Dit is een bijzonder nuttige strategie voor het genereren van null-mutanten wanneer onjuiste of onvolledige reparatie plaatsvindt op de bewerkingssite.
Kortom, vanwege de korte duur en de recente vooruitgang in deze methode, is dit een uitstekende methode voor routinematige laboratoriumexperimenten met de toevoeging van korte immunogene epitooptags, fluorescerende tags, het maken van gendeleties, genvervangingen en codonsubstituties.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door start-upfondsen van de Universiteit van Tulsa (TU) en de TU Faculty Development Summer Fellowship toegekend aan Jyoti Iyer. We willen het Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) en de Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) bedanken voor het toekennen van stipendia aan de studenten die betrokken zijn bij deze studie. We willen mevrouw Caroline Dunn bedanken voor haar technische bijstand. Tot slot willen we Drs. Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter en Saili Moghe bedanken voor hun kritische commentaar op dit manuscript.
Barcoded DNA sequencing tubes | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Premixed | N/A |
Cas9 protein | PNA Bio | CP01 | Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C |
crRNAs | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | N/A | Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |
ECoRI | New England Biolabs | R3101S | Stored at -30 °C |
Minelute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | Spin columns stored at 4 °C |
MyTaq Redmix | Meridian Bioscience | BIO-25043 | Stored at -30 °C |
Primers | IDT | N/A | Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
Proteinase K | Gold Bio | P-480-SL4 | Stored at -30 °C |
Repair template oligos | IDT | N/A | 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C |
tracrRNA | Horizon Discovery/ GE Dharmacon | U-002005-50 | Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C |