Summary
Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.
Abstract
Die Neovaskularisation wird in der Regel aus einer bestehenden normalen Vaskulatur initialisiert und die biomechanische Mikroumgebung von Endothelzellen (ECs) variiert in der Anfangsphase dramatisch vom folgenden Prozess der Neovaskularisation. Obwohl es viele Modelle gibt, um verschiedene Stadien der Neovaskularisation zu simulieren, fehlt noch ein In-vitro-3D-Modell, das den anfänglichen Prozess der Neovaskularisation unter den entsprechenden Stimulationen normaler Vaskulatur-Mikroumgebungen kapituliert. Hier haben wir ein In-vitro-3D-Modell rekonstruiert, das das ausgangse Ereignis der Neovaskularisation (MIEN) nachahmt. Das MIEN-Modell enthält einen mikrofluidischen Keimchip und ein automatisches, hocheffizientes Zirkulationssystem. Es wurde ein funktioneller, perfusabler Mikrokanal gebildet, der mit Endothel beschichtet ist, und der Prozess des Keimens wurde im mikrofluidischen Sprossenchip simuliert. Die ursprünglich physiologische Mikroumgebung der Neovaskularisation wurde mit dem mikrofluidischen Kontrollsystem rekapituliert, durch das ECs gleichzeitig hoher Luminalscherspannung, physiologischem transendothelialen Fluss und verschiedenen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Verteilungen (VEGF) ausgesetzt waren. Das MIEN-Modell kann problemlos auf die Untersuchung des Neovaskularisationsmechanismus angewendet werden und ist als kostengünstige Plattform für Arzneimittelscreenings und toxikologische Anwendungen ein potenzielles Versprechen.
Introduction
Neovaskularisation geschieht in vielen normalen und pathologischen Prozessen1,2,3,4, die zwei wichtige Prozesse bei Erwachsenen, Angiogenese und Arteriogenese5enthalten. Neben den bekanntesten Wachstumsfaktoren, wie dem vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF)6,sind mechanische Stimulationen, insbesondere der durchblutungsinduzierte Scherstress, bei der Regulierung der Neovaskularisation7wichtig. Wie wir wissen, variieren die Größe und Formen der Scherspannung dramatisch und dynamisch in verschiedenen Teilen der Vaskulatur, was zu wichtigen Auswirkungen auf die Gefäßzellen8,9,10,11,12führt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Scherspannung verschiedene Aspekte von ECs beeinflussen kann, einschließlich Zellphänotypische Veränderungen, Signaltransduktion, Genexpression und die Kommunikation mit Wandbildzellen13,14,15,16,17,18,19,20; daher die Neovaskularisation21,22,23,24regulieren.
Daher ist es wichtig, den Prozess in der natürlichen zellulären Mikroumgebung in vitrozu rekonstruieren, um die Neovaskularisation besser zu verstehen. In jüngster Zeit wurden viele Modelle zur Herstellung von Mikrogefäßen und zur präzisen Steuerung der Mikroumgebung25,26,27entwickelt, wobei die Fortschritte in der Mikrofertigung und der mikrofluidischen Technologie genutzt werden. In diesen Modellen können Mikrogefäße durch Hydrogel28,29, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidische Chips30,31,32 oder 3D Bioprinting33,34erzeugt werden. Einige Aspekte der Mikroumgebung, wie Luminalscherspannung22,23,35,36, transendotheliale Durchfluss37,38,39,40, biochemischer Gradient der angiogenen Faktoren41,42, Stamm/Stretch43,44,45, und co-cultured mit anderen Arten von Zellen32,46 wurden nachgeahmt und kontrolliert. In der Regel wurde ein großes Reservoir oder eine Spritzenpumpe verwendet, um durchfundiertes Medium bereitzustellen. Transendothelfluss in diesen Modellen wurde durch Druckabfall zwischen dem Reservoir und Mikrorohr22,23,38,40. Die mechanische Mikroumgebung war jedoch auf diese Weise nur schwer konstant zu pflegen. Der transendotheliale Fluss würde zunehmen und dann das physiologische Niveau überschreiten, wenn eine hohe Durchflussrate mit hoher Scherspannung für die Perfusion verwendet würde. Frühere Studien zeigten, dass in der Anfangsphase der Neovaskularisation die Geschwindigkeit des transendotheliaalen Flusses aufgrund der intakten ECs und der Kellermembran, in der Regel unter 0,05 m/s8,sehr gering ist. Obwohl die Luminalscherspannung im Gefäßsystem stark variiert, ist sie mit Mittelwerten von 5-20 dyn/cm2,11,47relativ hoch. Vorerst wurde die Geschwindigkeit des transendothelialen Durchflusses in früheren Arbeiten in der Regel zwischen 0,5-15 'm/s22,38,39,40, gehalten und die Luminalscherspannung lag in der Regel unter 10 dyn/cm223. Es bleibt ein schwieriges Thema, ECs ständig einer hohen Luminalscherspannung und physiologischem Grad des transendothelialen Flusses gleichzeitig auszusetzen.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein In-vitro-3D-Modell, um das ausgangse Ereignis der Neovaskularisation (MIEN) nachzuahmen. Wir entwickelten einen mikrofluidischen Chip und ein automatisches Steuerungssystem, hocheffizientes Zirkulationssystem, um Perfusionsmikroröhrchen zu bilden und den Prozess des Keimens zu simulieren48. Mit dem MIEN-Modell wird zunächst die Mikroumgebung von ECs, die in der Anfangsphase der Neovaskularisation stimuliert wurden, rekapituliert. ECs können durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene VEGF-Verteilung gleichzeitig stimuliert werden. Wir beschreiben die Schritte zur Erstellung des MIEN-Modells im Detail und die wichtigsten Punkte, denen Aufmerksamkeit gewidmet werden muss, in der Hoffnung, eine Referenz für andere Forscher zu bieten.
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Protocol
1. Wafer-Vorbereitung
HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für die SU-8 2075 negativen Photoresist während dieser Forschung verwendet.
- Den Siliziumwafer 3 bis 5 Mal mit Methanol und Isopropanol auf einem Spincoater wie folgt reinigen: Zuerst 15 s bei 500 U/min drehen und dann 60 s bei 3.000 U/min drehen.
- Den Siliziumwafer auf eine auf 180 °C vorgewärmte Kochplatte geben und 10 min backen.
- Entfernen Sie den Siliziumwafer von der Kochplatte und kühlen Sie ihn auf Raumtemperatur. Reinigen Sie den Wafer erneut mit Druckluft, bevor Sie mit der Spinbeschichtung fortfahren. Tragen Sie 4 ml des SU-8 2075 Photoresist auf die Mitte des Wafers auf.
- Erhalten Sie eine Funktionshöhe von 70 'm auf dem Spincoater wie folgt: erste Drehung für 12 s bei 500 U/min, und dann drehen für 50 s bei 2.100 U/min.
- Den Wafer auf einer Kochplatte wie folgt weich backen: erst 8 min bei 65 °C backen, dann 20 min bei 95 °C backen. Als nächstes entfernen Sie den Siliziumwafer von der Kochplatte und kühlen Sie ihn vor der Lithographie auf Raumtemperatur ab.
- Legen Sie eine Fotomaske auf den Fotoresist-Film. Setzen Sie den Wafer mit einer Lithographie-Ausrüstung aus, um eine Gesamtbelichtung von 200 mJ/cm2zu erreichen.
HINWEIS: Die Fotomaske enthält neun Sätze von Mustern des Chips, so dass sie jedes Mal neun mikrofluidische Keimchips fertigen kann. - Den Wafer wie folgt auf einer Kochplatte aussetzen: erst 5 min bei 65 °C backen und dann 20 min bei 95 °C backen. Als nächstes entfernen Sie den Siliziumwafer von der Kochplatte und kühlen Sie ihn vor der Entwicklung auf Raumtemperatur ab.
- Übertragen Sie den Wafer auf eine glasige Petrischale, die mit DEM SU-8-Entwickler (PGMEA) gefüllt ist, um mit der Entwicklung zu beginnen.
VORSICHT: Der Entwickler reizt die Augen und Atemwege. Führen Sie die Entwicklung in einer Rauchhaube. Tragen Sie während des Betriebs eine Spritzbrille, Nitrilhandschuhe und eine Airline-Maske. - Schütteln Sie die Schale sanft entlang der Richtung des Strömungskanals und ändern Sie den Entwickler nach 10 min.
- Wiederholen Sie Schritt 1.9 3-5 mal, bis die Muster deutlich beobachtet werden können.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Photoresist-Rückstände auf dem Wafer zurückbleiben, sonst spülen Sie den Wafer im Entwickler wieder aus. - Den Wafer auf eine vorgeheizte Kochplatte auf 120 °C geben und 30 min backen.
- Pipetten Sie 35 l Silan auf einen Deckelschlupf, dann legen Sie den Deckelzusammen mit dem Wafer in einen Austrocknungs- und Zugvakuum. Versiegeln Sie den Austrocknungsgerät und lassen Sie den Wafer 4 h unter Vakuum, um den Wafer zu silanisieren, um die Haftung von PDMS während der Softlithographieprozesse zu verhindern.
VORSICHT: Das Silan ist giftig. Um eine Vergiftung zu verhindern, führen Sie eine Silanisierung in der Dunstabzugshaube durch und tragen Sie beim Handling Nitrilhandschuhe. - Lassen Sie das Vakuum aus dem Trockenheitor. Den silanisierten Wafer auf eine vorgeheizte Kochplatte nehmen und bei 65 °C 2 h backen.
- Bewahren Sie den Wafer in einer sauberen Petrischale auf, bis er benötigt wird.
2. Mikrofluidische Spriegung Chip Herstellung
- 20 g Basismittel und 2 g Härtemittel (10:1-Verhältnis) in einem Kunststoffbecher kombinieren und mit einem Mischstab gründlich vermischen.
- Legen Sie den Becher in einen Trockenheitor und ziehen Sie Vakuum für 1 h, um Luftblasen in der PDMS-Mischung zu entfernen.
- Gießen Sie die PDMS-Mischung auf den Wafer in der Petrischale und legen Sie die Petrischale wieder in den Trockener, entgasen für weitere 30 min.
HINWEIS: Es ist hilfreich, doppelseitiges Klebeband zu verwenden, um den Wafer auf den Boden der Petrischale zu kleben, um sicherzustellen, dass der Wafer während der Entgasung und Aushärtung horizontal gehalten wird. - Die Petrischale aus dem Trockenschrank nehmen und in einen 80 °C-Trockenofen für 3 h zum Aushärten geben.
- Trennen Sie vorsichtig die PDMS-Schicht vom Wafer und schneiden Sie die Schicht mit einem Skalpell nach dem Muster auf neun Chips.
HINWEIS: Halten Sie die Feature-Seite nach der Trennung aufrecht. - Stanzen Sie zwei Hydrogel-Injektionsöffnungen und vier Medieninjektionsöffnungen aus jedem Chip mit einem 1 mm bzw. 3,5 mm Biopsie-Punch.
- Reinigen Sie die gestanzten Späne mit rückstandsfreiem Klebeband, um PDMS-Rückstände zu entfernen. Legen Sie die Chips und neun Glasabdeckungen in einen Plasmareiniger und behandeln Sie sie mit Sauerstoffplasma für 30 s, um eine kovalente Verklebung auf der Oberfläche zu bilden.
- Nehmen Sie die Chips und Deckellipsen heraus. Befestigen Sie die Funktionsseite der Chips an den Abdeckungen.
- Die befestigten Späne 1 H in einen 80 °C-Trockenofen geben, um die Verklebung zu intensivieren.
- Autoklavieren Sie die Chips vor dem Gebrauch und halten Sie sie steril für den Rest des Verfahrens.
3. Oberflächenmodifikation und Hydrogel-Injektion
- Für jeden Chip 40 l Poly-D-Lysin (PDL) pipet und aus dem Hydrogel-Injektionsanschluss in Kanäle im Chip einspritzen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PDL Kanäle ausfüllt, insbesondere in engen Kanälen in der Nähe der Ports. - Inkubieren Sie die Chips bei 37 °C für 4 h, um die Oberfläche des PDMS zu verändern.
- Pipetten Sie 200 l steriles Wasser und injizieren Sie es in Kanäle im Chip aus Hydrogel-Injektionsanschluss, um PDL auszuwaschen.
- Entfernen Sie die Späne in einen 120 °C Trockenofen für 3 h, um die Hydrophobie wiederherzustellen.
- Legen Sie eine sterile Röhre auf Eis und berechnen Sie das Volumen von Typ I Kollagen, das als folgende Gleichung verwendet werden soll.
Endvolumen (50 l) x Endgültige Kollagenkonzentration (3 mg/ml in dieser Forschung) / Konzentration in der Flasche = zuzurechnendes Volumen kollagen - Berechnen Sie das Volumen von NaOH, das als folgende Gleichung verwendet werden soll.
(Volumenkollagen) x 0,023 = Volumen 1 N NaOH - Bereiten Sie 50 l Hydrogel in der Röhre als folgendes Protokoll vor: 5 l von 10x PBS, 0,5 l Phenolrot, berechnetes Volumen von 1 N NaOH, 4 l von 1 mg/ml Fibronectin, berechnetes Volumen von Typ I Kollagen nacheinander. Fügen Sie die richtige Menge von dH2O hinzu, so dass das Gesamtvolumen 50 l erreicht. Mischen Sie den gesamten Inhalt im Rohr gründlich.
HINWEIS: Führen Sie alle Operationen auf Eis aus. Verwenden Sie Phenolrot als säurebasierten Indikator, um die visuelle Bestimmung des pH-Werts des Hydrogels zu unterstützen. Das endgültige Hydrogel endet orange, wenn der pH-Wert etwa 7,4 und die Steifigkeit etwa 15 kPa49beträgt. - Pipetten Sie für jeden Chip 2-3 l Hydrogel und injizieren Sie ihn langsam aus dem Hydrogel-Injektionsanschluss in den zentralen Hydrogelkanal.
- Inkubieren Sie die Chips bei 37 °C für 30 min, um eine Gelation zu ermöglichen.
HINWEIS: Versiegeln Sie die Chips in einer versiegelten Box mit 1 ml sterilem Wasser, wenn sie nicht sofort verwendet werden. Versiegelte Späne können bei 37 °C für höchstens 24 h gelagert werden.
4. Zellsaat
- Pipetten Sie 20 l von 125 g/ml Fibronectin in einen Medieninjektionsport des Zellkulturkanals.
- Schneiden Sie eine Pipettenspitze, um den Port des Zellkulturkanals mit einer Schere zu passen.
- Setzen Sie die Pipettenspitze in den anderen Medieninjektionsport des Zellkulturkanals ein. Dann, Pipetten Sie Luft aus dem Zellkulturkanal, um es mit Fibronectin zu füllen.
- Die Chips bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Vor der Zellaussaat, Pipetten Sie 20 l ECM-Medien in jeden Medieninjektionsanschluss und inkubieren Sie die Chips bei 37 °C für 30 min.
- Pipetten Sie dann alle Medien in allen Medieninjektionsports heraus.
- Als nächstes pipet die Pipetten5 L der Zellsuspension in einen Medieninjektionsport des Zellkulturkanals. Dann breiten sich Endothelzellen unter differenziellem hydrostatischem Druck schnell über den gesamten Kanal aus.
HINWEIS: Bereiten Sie die Zellsuspension vor, indem Sie die endotheliale Endothelzellen (HUVECs) des menschlichen Nabelvenen aus dem Kulturkolben ausprobieren und bei 400 x gzentrifugieren. Setzen Sie dann die Zellen auf 107 Zellen/ml in einer Röhre aus. - Fügen Sie dem anderen Port etwa 4-6 L ECM-Medien hinzu, um den hydrostatischen Druck einzustellen und die Zellbewegung zu stoppen.
- Entfernen Sie die Chips in den Zellinkubator. Dann drehen Sie die Chips alle 30 min um, bis endotheliale Zellen um die innere Oberfläche des Zellkulturkanals 2 h später überziehen(Abbildung 1).
HINWEIS: Um den Chip auf den Kopf zu stellen, pfeifen Sie ein wenig Wasser auf der Rückseite des Deckels. Dann kann der Chip an der Abdeckung der Petrischale befestigt werden. - Verwenden Sie die Pipettenspitze, um die angeschlossenen Zellen in den Injektionsports sehr sorgfältig zu entfernen.
- Legen Sie dann vier Stachelbuchsen luer in die Medieninjektionsanschlüsse ein und füllen Sie sie mit ECM-Medien.
HINWEIS: Die Adapter können als Flüssigkeitsreservoirs fungieren, um Nährstoffe für die Zellen im Kanal bereitzustellen. - Entfernen Sie die Chips in den Zellinkubator. Ändern Sie ECM-Medien in Luer-Adaptern alle 12 stunden.
5. Messung der FITC-dextran Diffusionspermeabilität
ANMERKUNG: Zur Beurteilung der Barrierefunktion des Mikrogefäßes wird die Diffusionsdurchlässigkeit des EG-Kulturkanals mit oder ohne Zellauskleidung bewertet.
- Nehmen Sie einen mikrofluidischen Keimchip mit Hydrogel injiziert.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.6.
- Entfernen Sie alle Luer-Adapter und pipetdien Sie alle Medien in vier Medieninjektionsports aus.
- Legen Sie den Chip auf das konfokale Laserscanmikroskop.
- Pipetten 5 l Kulturmedien, die 500 g/ml 40 kDa FITC-dextran zu einem Port des Zellkulturkanals enthalten.
HINWEIS: 40 kDa FITC-dextran hat eine ähnliche molekulare Größe wie VEGF-165 (39-45 kDa). - Erfassen Sie Bilder alle 3 s für 30 s. So wird die Diffusionsdurchlässigkeit ohne Zellfutter gemessen.
- Nehmen Sie den mikrofluidischen Keimchip heraus, nachdem HUVECs im Zellkulturkanal konfluent sind.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.3-5.5.
- Erfassen Sie Bilder alle 3 s für 30 s. So wird die Diffusionsdurchlässigkeit mit Zellfutter gemessen.
- Berechnen Sie die Diffusionsdurchlässigkeit, indem Sie Veränderungen der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf mit der folgenden modifizierten Gleichung50quantifizieren.
Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib) t) S/d
wobei Pd der Diffusionsdurchlässigkeitskoeffizient ist, I1 die durchschnittliche Intensität zu einem anfangs Zeitpunkt ist, I2 die durchschnittliche Intensität nach der Deltazeitist( t ), ib die Hintergrundintensität, S ist der Bereich des Kanals in Fluoreszenzbildern und d ist das Gesamtintervall von Mikropfosten in Fluoreszenzbildern. In der vorliegenden Arbeit wird die Werte auf 9 s festgelegt.
HINWEIS: Die vorliegende Gleichung unterscheidet sich geringfügig von der ursprünglichen50, aufgrund der Diffusionsrichtung der Fluoreszenz im Chip ist nur vom EC-Kanal zum Hydrogelkanal, der nicht wie das kreisförmige Rohr in der gesamten radialen Richtung diffundiert.
6. Einrichtung des mikrofluidischen Steuerungssystems
HINWEIS: Das mikrofluidische Steuerungssystem in der vorliegenden Studie besteht aus einer Mikrospritzenpumpe, einem elektromagnetischen Pinch-Ventil, einem Blasenfalle-Chip, einem mikrofluidischen Chip, einer mikroperistaltischen Pumpe und einem Reservoir. Jeder Teil des Systems kann durch Alternativen ersetzt werden, die die gleiche Funktion ausführen können.
- Bubble Trap Chip Fertigung
HINWEIS: Der Blasenfalle-Chip wird verwendet, um Luftblasen im Umlauf zu entfernen. Der Chip besteht aus drei PDMS-Schichten. Die obere Schicht wird mit weicher Lithographie konstruiert, um Gitterstruktur als Flüssigkammer zu bilden. Jeder Kanal der Rasterstruktur ist 100 m breit. Die untere Ebene ist ein PDMS-Chunk mit einem Loch. Zwischen den beiden Schichten wird eine 100 m dünne PDMS-Folie verlegt.- Wiederholen Sie Schritt 1, um den Wafer für Denblasenfalle-Chip vorzubereiten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5, um die obere und die untere Schicht des Blasenfallenchips herzustellen.
HINWEIS: Die Fotomaske der obersten Schicht enthält drei Sätze von Mustern, also schneiden Sie die PDMS-Schicht entsprechend dem Muster auf drei Chips. - Stanzen Sie sechs Löcher am Ende der Ein- und Auslasskanäle der Deckschicht mit einem 3,5 mm Biopsie-Punch.
- Stanzen Sie zwei Löcher auf die entsprechende Position der unteren Schicht mit einem 6 mm Biopsie-Stempel entsprechend dem Muster auf der oberen Schicht.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2, um 10 g PDMS-Mischung vorzubereiten und auf die Mitte eines gereinigten Siliziumwafers zu gießen.
- Fertigen Sie eine 100-mm-PDMS-Folie unter Anwendung des folgenden Spin-Protokolls: Drehen Sie 15 s bei 500 U/min, erhöhen Sie die Spin-Geschwindigkeit auf 1.300 U/min und halten Sie hier 45 s.
- Den Wafer auf eine vorgeheizte Kochplatte auf 180 °C geben und 30 min backen.
- Reinigen Sie die gestanzten Schichten mit rückstandsfreiem Klebeband, um PDMS-Rückstände zu entfernen. Legen Sie die oberen Schichten und Wafer in einen Plasmareiniger und behandeln Sie sie mit Sauerstoffplasma für 30 s, um kovalente Verklebungen auf der Oberfläche zu bilden.
- Nehmen Sie die oberen Schichten und Wafer heraus. Befestigen Sie die Feature-Seite der oberen Ebenen an der PDMS-Folie.
- Schneiden Sie den Film vorsichtig entlang der Kante der oberen Schichten mit einer Nadel.
- Trennen Sie den Film langsam vom Wafer und drehen Sie die Chips um, um die Filmseite nach der Trennung nach oben zu machen.
- Legen Sie die unteren Schichten und befestigten Chips in einen Plasmareiniger und behandeln Sie sie wieder mit Sauerstoffplasma für 30 s.
- Nehmen Sie die unteren Schichten und die befestigten Chips heraus. Befestigen Sie die unteren Schichten auf der PDMS-Folie und die Blasenfallenchips sind fertig.
HINWEIS: Richten Sie die Löcher auf der unteren Ebene beim Anfügen an den Mustern auf der obersten Ebene aus. - Die Späne für 1 H in einen 80 °C-Trockenofen geben, um die Verklebung zu intensivieren.
- Montieren Sie das mikrofluidische Steuerungssystem
HINWEIS: Alle Teile des Systems, wie Z. B. Blasenfangchip, Reservoir, Rohre und Steckverbinder, werden nach der Autoklavensterilisation verwendet, mit Ausnahme von elektronischen Geräten. Montieren Sie die mikrofluidische Steuerung auf einer sauberen Bank.- Zur Montage des mikrofluidischen Steuerungssystems bereiten Sie zwei Polytetrafluorethylen-Röhren, zwei kurze Silikonröhren, drei lange Silikonröhren, einen Stachelbuchsen-Luer-Adapter, einen Y-Steckverbinder und drei L-Steckverbinder vor.
HINWEIS: Der Vorteil von Polytetrafluorethylen-Rohr ist eine geringe Elastizität, daher wird weniger Medien in Derpipeline benötigt. Silikonrohr dagegen hat eine hohe Elastizität, daher eignet es sich für das Pinch-Ventil und die Peristaltikpumpe. - Füllen Sie die Spritze mit 10 ml vorgeheiztem (37 °C) ECM Medium.
HINWEIS: Die Vorwärmung hilft dem Medium, gelöstes Gas freizusetzen. - Verbinden Sie ein Polytetrafluorethylen-Rohr mit der Spritze durch einen Stachelweibchen Luer-Adapter. Schließen Sie dann das andere Ende des Polytetrafluorethylenrohrs an einen Y-Steckverbinder an.
- Als nächstes verbinden Sie zwei lange Silikonrohre mit den anderen beiden Enden des Y-Steckers mit einem Rohr, das mit dem Reservoir verbunden ist, und dem anderen Rohr, das mit dem Blasenfalle-Chip verbunden ist.
- Schließen Sie ein weiteres langes Silikonrohr an das Reservoir an.
- Verwenden Sie als Nächstes zwei kurze Silikonrohre, um alle Ein- und Auslasslöcher auf der obersten Schicht des Blasenfalle-Chips zu verbinden. Schließen Sie ein Polytetrafluorethylen-Rohr an das Backend des Chips an.
- Fixieren Sie die Spritze anschließend auf die Mikrospritzenpumpe.
- Clip zwei lange Silikonrohre in das elektromagnetische Kneifventil.
- Schalten Sie als Nächstes das elektromagnetische Pinch-Ventil ein, um die Rohrleitung zwischen der Spritze und dem Reservoir zu öffnen. Injizieren Sie das Medium mit einer Mikrospritzenpumpe in das Reservoir, um die Luft im Rohr abzuschöpfen.
- Wechseln Sie dann das Ventil erneut, um die Rohrleitung zwischen der Spritze und dem Blasenfalle-Chip zu öffnen. Injizieren Sie das Medium, um die Flüssigkeitskammer und das Backend-Rohr des Blasenfallenchips zu füllen.
- Zur Montage des mikrofluidischen Steuerungssystems bereiten Sie zwei Polytetrafluorethylen-Röhren, zwei kurze Silikonröhren, drei lange Silikonröhren, einen Stachelbuchsen-Luer-Adapter, einen Y-Steckverbinder und drei L-Steckverbinder vor.
7. Endotheliale Sprossen-Assay
HINWEIS: Ein mit Phasenkontrastmikroskop montierter Bühnen-Inkubator wird in dieser Studie verwendet, um den Prozess des Keimens in Echtzeit zu beobachten. Der Bühnen-Top-Inkubator kann die Temperatur, Feuchtigkeit undCO2-Steuerung auf Mikroskopstufen beibehalten, was gut für die Live-Zell-Bildgebung ist. Aber die Ausrüstung ist nicht notwendig für den Test. Die hier bereitgestellten Protokolle können auch in einem einfachen Zellinkubator bearbeitet werden.
- Nehmen Sie endotheliale Spriegungschips aus dem Zellinkubator heraus.
- Entfernen Sie dann Luer-Adapter auf der Zellkulturseite. Stecken Sie zwei Rohrstecker in die Hydrogel-Injektionsöffnungen des mikrofluidischen Keimchips.
HINWEIS: Die Stecker können von Nadeln transformieren und ihre Hauptfunktion besteht darin, ein Auslaufen von Medien zu verhindern. - Schließen Sie das Backend-Rohr des Blasenfangchips an einen Port des Zellkulturkanals an.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich vor dem Anschluss keine Blasen im Rohr befinden. - Setzen Sie einen T-Stecker an den anderen Anschluss und verbinden Sie ihn mit einem langen Silikonrohr, das mit dem Reservoir verbunden ist.
- Beklemmen Sie das lange Silikonrohr in die mikroperistaltische Pumpe.
- Legen Sie dann einen Luftfilter in das Reservoir ein.
- Als nächstes montieren Sie den mikrofluidischen Keimchip zum Bühnen-Inkubator.
- Als nächstes schließen Sie die Vakuumpumpe mit einem TPU-Rohr an die Löcher in der unteren Schicht des Blasenfalle-Chips an.
- Richten Sie das Zirkulationsvolumen und die Durchflussrate im benutzerdefinierten Programm ein, das die Mikrospritzenpumpe und das elektromagnetische Kneifventil gleichzeitig steuert (Abbildung 2).
HINWEIS: Die Durchflussrate über den Endothelzellkulturkanal wird gemäß der klassischen Gleichung berechnet.
• = 6 q / Wh2
wobei , ist die Scherspannung (dyn/cm2), μ Viskosität des Mediums (8,8 x 10-4 Pa•s), Q die Durchflussrate über den endotheliale Zellkulturkanal (ml/s), h ist Kanalhöhe (70 m) und W die Kanalbreite (1.000 m). Die Viskosität des Mediums wird mit einem koaxialen Zylinder-Rotationsviskometer gemessen. Die Höhe und Breite des Kanals sind vorbestimmt und werden manuell mit einem Phasenkontrastmikroskop bei 4-facher Vergrößerung bestätigt. Das Zirkulationsvolumen beträgt 5 ml und die Durchflussmenge beträgt 85 l/min (durchschnittlich 0,2 m/s im Zellkulturkanal) für 15 dyn/cm2 Scherspannung nach Berechnung. - Als nächstes richten Sie den Durchfluss der mikroperistaltischen Pumpe ein.
HINWEIS: Die Durchflussrate der mikroperistaltischen Pumpe ist etwas höher als bei der Mikrospritzenpumpe, um ein Auslaufen der Medien zu verhindern. - Schalten Sie die Mikrospritzenpumpe ein. Dann wird das Zirkulationskontrollsystem eingerichtet.
8. Datenanalyse
ANMERKUNG: Um die Sprossen zu quantifizieren, wurden die normalisierte Sprossenfläche, die durchschnittliche Sprossenlänge und die längste Sprossenlänge berechnet. Die Ergebnisse stellen einen Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Studien dar. Die statistische Signifikanz (P < 0,05) wird durch den Schüler-t-Testbewertet.
- Fix Zellen und Sprossen im mikrofluidischen Keimchip nach Experimenten mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min. Fleckenkerne mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole-Dihydrochlorid (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) für 10 min und dann Cytoskelett mit TRITC Phalloidin (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) für 1 h. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal in 5 min Intervallen zwischen jedem Schritt.
- Nehmen Sie konfokale Bilder der Chips in einem Kachelmodus auf und nähen Sie sie mit Bildbearbeitungssoftware.
- Zählen Sie die Anzahl der fluoreszierenden Pixel von Z-Projektionsbildern mit einem benutzerdefinierten Code in der Programmiersoftware, um normalisierte Sprossenflächen zu quantifizieren (siehe Ergänzungsdatei).
- Identifizieren und kennzeichnen Sie manuell jede Spitze von Sprossen in Z-Projektionsbildern und berechnen Sie die Entfernungen zwischen den Sprossenspitzen zur ECs-Kellermembran mit einem anderen benutzerdefinierten Code, um die durchschnittliche Sprossenlänge und die längste Sprossenlänge zu quantifizieren (siehe Ergänzende Datei).
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Representative Results
Das hier vorgestellte In-vitro-3D-Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation (MIEN) bestand aus einem mikrofluidischen Keimchip und einem mikrofluidischen Steuerungssystem. Der mikrofluidische Keimchip wurde aus früheren Publikationen22,23,37,40,51,52,53optimiert. Kurz gesagt, enthielt es drei Kanäle und sechs Ports: einen endothelialen Zellkulturkanal und einen Flüssigkeitskanal mit vier Medieninjektionsanschlüssen und einen zentralen Hydrogelkanal mit zwei Hydrogel-Injektionsöffnungen (Abbildung 3). Das mikrofluidische Steuerungssystem bestand aus einer Mikrospritzenpumpe, einem elektromagnetischen Pinch-Ventil, einem Blasenfalle-Chip, einer mikroperistaltischen Pumpe und einem Kulturmedium-Reservoir(Abbildung 4). Ein kundenspezifisches Programm wurde verwendet, um die Mikrospritzenpumpe und das elektromagnetische Kneifventil gleichzeitig zu steuern, mit dem durch die Durchflussmenge und das Zirkulationsvolumen eingestellt werden können. Ein Kompensationsvolumen wurde eingeführt, um die leichte Volumenänderung nach mehreren Zyklen aufgrund eines systemischen Fehlers zu korrigieren. Um das für die Durchfusion verwendete Medium zu minimieren, wurde ein elektromagnetisches Pinch-Ventil für das mittlere Recycling eingeführt. Das elektromagnetische Pinch-Ventil könnte zwischen zwei Zuständen wechseln, um das mikrofluidische System in zwei Phasen in einem Zyklus herzustellen. In der Injektionsphase wurde das Kulturmedium langsam von der Mikrospritzenpumpe in den mikrofluidischen Keimchip injiziert. Während der Recyclingphase wurde das Kulturmedium sehr schnell aus dem Reservoir zurück zur Mikrospritzenpumpe extrahiert.
Die Barrierefunktion des Mikrogefäßes in unserem MIEN-Modell wurde durch Messung des Diffusionsdurchlässigkeitskoeffizienten (Pd) von 40 kDa FITC-dextran bewertet. Wie in Abbildung 5dargestellt, beträgt der Pd des statisch kultivierten Chips mit Zellauskleidung 0,1 ± 0,3 m/s, und der Pd des leeren Kanals ohne Zellauskleidung beträgt 5,4 ± 0,7 m/s. Anschließend wurde im MIEN-Modell ein endotheliader Keimungstest unter statischer und perfusionierter Test durchgeführt. Unter statischen Bedingungen trat die Endothelsprossierung etwa 4 h nach der Aussaat auf und die Sprossen wanderten etwa 48 h über den zentralen Hydrogelkanal auf die andere Seite. Die Sprossen abgebaut sich nach 48 h allmählich. Während nach 24 h Exposition gegenüber 5 oder 15 Dyn/cm2 Scherspannung (durchschnittlich 0,07 oder 0,2 m/s im Zellkulturkanal) ECs, die in der Strömungsrichtung ausgerichtet sind, sich von der polygonalen, kopfsteinpflasterförmigen Form in Fusiform änderten und der Keimgrad mit der Erhöhung der Scherspannung abnahm(Abbildung 6). Die Sprossen unter Scherbedingungen waren jedoch stabiler als unter statischen Kulturbedingungen. Sie konnten über 48 h unter Perfusion aufrechterhalten. Quantitative Statistiken zeigten, dass die Endothelsprossen in Bezug auf die Sprossenfläche, die durchschnittliche Sprossenlänge und die längste Sprossenlänge signifikant zurückgingen(Abbildung 7).
Abbildung 1:Endothelzellen schichten sich um die innere Oberfläche des Zellkulturkanals. HUVECs werden im Zellkulturkanal 2 h nach der Zellaussaat gleichmäßig dispergiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Das benutzerdefinierte Programm zur gleichzeitigen Steuerung der Mikrospritzenpumpe und des elektromagnetischen Pinch-Ventils. Hauptseite (nach oben) und Unterseite (nach unten) des benutzerdefinierten Programms, mit dem die Durchflussmenge und das Zirkulationsvolumen eingerichtet werden können. Ein Kompensationsvolumen wurde eingeführt, um die leichte Volumenänderung nach mehreren Zyklen aufgrund eines systemischen Fehlers zu korrigieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Der Schaltplan des mikrofluidischen Keimchips. Der Chip enthält drei Kanäle und sechs Anschlüsse: einen endothelialen Zellkulturkanal und einen Flüssigkeitskanal mit vier Medieninjektionsanschlüssen und einen zentralen Hydrogelkanal mit zwei Hydrogel-Injektionsöffnungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Der Schaltplan des mikrofluidischen Steuerungssystems. Das mikrofluidische Steuerungssystem besteht aus einer Mikrospritzenpumpe, einem elektromagnetischen Pinch-Ventil, einem Blasenfalle-Chip, einer mikroperistaltischen Pumpe und einem Kulturmedium-Reservoir. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Diffusionsdurchlässigkeit ( Pd) von 40 kDa FITC-dextran. Der Pd des statisch kultivierten Chips mit Zellfutter beträgt 0,1 ± 0,3 m/s, und der Pd des leeren Kanals ohne Zellauskleidung beträgt 5,4 ± 0,7 m/s. **, p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Bilder von Endothelkeimen unter verschiedenen Scherbedingungen. Nach 24 h statischer Kultivierung dringen HUVECs durch Mikropfosten und eine große Anzahl von Sprossen im Hydrogel vom Zellkulturkanal in den angrenzenden Hydrogelkanal ein. Während nach 24 h Exposition gegenüber 5 oder 15 Dyn/cm2 Scherspannung, nimmt der Grad der Keimung offensichtlich ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Quantifizierte Sprossenfläche, durchschnittliche Sprossenlänge und längste Sprossenlänge. Nach 24 h statischer Kultur (S0) oder Exposition gegenüber 5 (S5) oder 15 (S15) Dyn/cm2 Scherspannung nimmt der Keimgrad mit der Erhöhung der Scherspannung ab. *, p < 0,05; **, p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Lange Zeit ist die Echtzeitbeobachtung der Neovaskularisation ein Problem. In letzter Zeit wurden mehrere Ansätze entwickelt, um durchlässige Gefäße zu erzeugen, die mit ECs auskleidung und an die extrazelluläre Matrix angrenzen, um22,32,40,46,54, aber die mechanische Mikroumgebung ist immer noch schwer zu pflegen. Es bleibt ein schwieriges Thema, die anfängliche biomechanische Mikroumgebung von ECs nachzuahmen, die einer hohen Luminalscherspannung und einer geringen Geschwindigkeit des transendothelialen Flusses ausgesetzt sind. Hier präsentierten wir ein MIEN-Modell, das zunächst das anfangse Ereignis der Neovaskularisation in der minimischen physiologischen Mikroumgebung simuliert. Mit dem MIEN-Modell wird eine automatische, effiziente und blasenfreie Langzeitperfusion erreicht. Die Luminal-Scherspannung auf ECs konnte optional jederzeit während der Experimente mit dem transendothelialen Fluss verändert werden, der auf physiologischer Ebene bleibt.
Der Schlüssel des MIEN-Modells besteht darin, den Effekt des Luminalflusses auf ECs vom transendothelialen Fluss zu entkoppeln. Zu diesem Zweck wird ein T-Typ-Anschluss kreativ in den Auslassanschluss des EC-Kulturkanals eingefügt. Ein Ende des Steckverbinders ist über die mikroperistaltische Pumpe mit dem Reservoir verbunden. Das andere Ende des Steckverbinders ist der Luft des Inkubators ausgesetzt. Es hält den Druck innerhalb des Endothelzellkulturkanals genauso wie der atmosphärische Druck, da es weder überschüssige Medien sammelt, um den Druck zu erhöhen, noch überschüssige Medien weggezogen werden, um unterdruck im Kanal zu bilden. Auf diese Weise ist der Strömungswiderstand nach mikrofluidischem Sprossensehr sehr gering, so dass der transendotheliale Durchfluss auch bei hoher Luminalscherspannung im physiologischen Bereich gehalten werden kann.
Ein entscheidender Schritt innerhalb des Protokolls ist die erfolgreiche Injektion von Hydrogel in den zentralen Hydrogelkanal. Huang et al. schlugen vor, dass eine erfolgreiche Füllung der Gele vom Ausgleich der Kapillarkräfte und der Oberflächenspannung innerhalb des mikrofluidischen Gelkanals55abhängt. Sie fanden drei verschiedene Variablen, um das Gleichgewicht zu steuern: den Abstand zwischen Mikropfosten, die Oberflächeneigenschaften des Geräts und die Viskosität der Hydrogel-Vorläuferlösungen. Im vorliegenden Modell wird das Design des mikrofluidischen Keimchips aus früheren Werkenoptimiert 22,23,37,40,51,52,53. Die Geometrie und der Abstand von Mikropfosten zur Trennung von drei Kanälen werden auf DerGrundlage früherer Berechnungen und zahlreicher Experimente bestimmt. Darüber hinaus werden PDL-Beschichtung und Hochtemperaturbacken durchgeführt, um die PDMS-Oberfläche zu modifizieren; daher das Gleichgewicht zwischen Hydrophilie und Hydrophobie vor der Hydrogelinjektion anpassen.
Der andere kritische Schritt des Protokolls ist die Entfernung von Blasen. Eine große Menge an Luft löst sich während des Experiments aufgrund des T-Typ-Steckverbinders und der mikroperistalischen Pumpe in Zirkulationsmedium auf, was zu Blasen im Umlauf führt und die Funktion der Endothelzellen stark beeinträchtigt. Um Blasen zu entfernen, wird ein Blasenfalle-Chip vor dem mikrofluidischen Keimchip eingeführt. Es arbeitet auf der Grundlage der hohen Gasdurchlässigkeit der PDMS-Membran. Wenn Blasen in die Falle gelangen, werden sie durch die kleine und dichte Gitterstruktur dispergiert und aufgrund des von der Vakuumpumpe erzeugten Unterdrucks eingeschlossen, so dass sie sich nicht in den mikrofluidischen Keimchip bewegen. Weiterhin transportieren die Blasen durch die PDMS-Membran in das an die Vakuumpumpe angeschlossene Unterdruckloch und verschwinden schließlich. Dennoch sollte der Bildung von Blasen während des Experiments große Aufmerksamkeit geschenkt werden. Sobald Blasen vor dem mikrofluidischen Keimchip in der Pipeline gefunden werden, stoppen Sie die Mikrospritzenpumpe sofort. Zucken Sie vorsichtig die Pipeline mit dem Finger, damit sich die Blasen zum Blasenfangchip bewegen und entfernt werden.
Obwohl die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation teilweise rekapituliert ist, gibt es einige Einschränkungen für dieses MIEN-Modell. Die mechanischen Mikroumgebungen von Endothelzellen wie blutinduzierte Scherspannung und extrazelluläre Matrixsteifigkeit verändern sich während der Neovaskularisationsprozesse. Vor der Neovaskularisation ist die endotheliale Kellermembran noch intakt mit vollständiger Barrierefunktion, was zu einer hohen Luminalscherspannung mit geringer Geschwindigkeit des transendothelialen Durchflusses und interstitiellen Durchflusses8,9führt. Zu Beginn der Angiogenese und Arteriogenese ist ein markantes Ereignis die Matrix-Metalloproteasen(MMPs)-Vermittlung des Kellerabbaus, die die Durchlässigkeit der ECs erhöhen und die Matrix umgestalten wird, was zu Veränderungen in mechanischen Mikroumgebungen wie blutinduzierter Scherspannung und extrazellulärer Matrixsteifigkeit führt. In der vorliegenden Arbeit konzentrieren wir uns auf die Einleitung der Neovaskularisation, so dass die mechanischen Umgebungen innerhalb des mikrofluidischen Keimchips so konzipiert sind, dass sie stabil bleiben, um die physiologischen Bedingungen zu simulieren. Allerdings werden Änderungen der mechanischen Mikroumgebungen auftreten, wenn die ECs sprießen, genau wie in vivo. Außerdem, ähnlich wie viele frühere Studien34,53,56, nimmt das vorliegende Modell Kollagenhydrogel als extrazelluläre Matrix. Da wir uns auf die Wirkung von strömungsinduzierter Scherspannung konzentrieren, wird nur ein Steifigkeitshydrogel verwendet. Unter Berücksichtigung der wichtigen Wirkung der Matrixsteifigkeit auf das Zellverhalten und die Neovaskularisation sollten jedoch verschiedene Steifigkeiten von Kollagen untersucht werden und können durch Regulierung des pH-Werts von Kollagen erreicht werden, da die mechanischen Eigenschaften von Kollagen von seinem pH49abhängen. Aber es ist wichtig zu beachten, dass das Hydrogel gründlich mit PBS abspült werden muss, um Restsäuren oder Basen vor der Zellaussaat zu entfernen, um Schäden an den Zellen zu verhindern. Um die komplexen Komponenten von ECM in vivonachzuahmen, sollten in Zukunft verschiedene Hydrogele wie Matrigel, Hyaluronsäure (HA) und Fibrinogen usw. verwendet werden, um das gegenwärtige Modell zu verbessern. Blutdruckinduzierte zyklische Belastung ist eine weitere wichtige hämodynamische Kraft, die die Morphologie und Funktionen der Gefäßzellen moduliert57. Frühere Studien haben gezeigt, dass Zugstamm verbesserte Expression von angiogenen Faktoren in menschlichen mesenchymalen Stammzellen58 und induzierte Angiogenese durch Abbau von Typ IV Kollagen in der vaskulären endotheliale Kellermembran59. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass blutdruckinduzierte Belastung auch die Neovaskularisation beeinflussen kann. Das vorliegende Modell konzentriert sich auf die Wirkung von strömungsinduzierter Scherspannung, so dass es nicht anwendbar ist, um Dehnung einzuführen, da das Hydrogel nicht fest genug am Kanal klebt und abfällt, wenn es gedehnt wird. Wir werden darauf achten, diese Schwierigkeit in zukünftigen Arbeiten zu überwinden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (Grant-Nr. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 und 32071311), Nationales Forschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (Grant-Nr. 2016YFC1101101 und 2016YFC1102202), das 111-Projekt (B13003) und die Beijing Natural Science Foundation (4194079).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
| Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
| Image editing software | PhotoShop | NA | |
| Image processing program | ImageJ | NA | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
| Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
| Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
| Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
| Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
| Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
| Program software | MATLAB | NA | |
| Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
| Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
| SU-8 developer | Microchem | NA | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |
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