Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Процедуры гонадэктомии и забора крови в малогабаритной модели Teleost японской медаки (Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

В статье описан быстрый протокол гонадетомизации и отбора проб крови у маленьких телеостных рыбок, используя японскую медаку(Oryzias latipes)в качестве модели, для исследования роли половых стероидов в физиологии животных.

Abstract

Половые стероиды, вырабатываемые гонадами, играют важную роль в пластичности мозга и тканей гипофиза и в нейроэндокринном контроле размножения у всех позвоночных, обеспечивая обратную связь с мозгом и гипофизом. Телеостные рыбы обладают более высокой степенью тканевой пластичности и вариации репродуктивных стратегий по сравнению с млекопитающими и, по-видимому, являются полезными моделями для изучения роли половых стероидов и механизмов, с помощью которых они действуют. Удаление основного источника производства половых стероидов с помощью гонадэктомии вместе с забором крови для измерения уровня стероидов было хорошо установлено и довольно осуществимо у более крупных рыб и является мощным методом исследования роли и эффектов половых стероидов. Однако эти методы вызывают проблемы при реализации в моделях телеоста небольшого размера. Здесь мы описываем пошаговые процедуры гонадэктомии как у мужчин, так и у женщин японской медаки с последующим забором крови. Показано, что эти протоколы весьма осуществимы в медаке, о чем свидетельствует высокая выживаемость, безопасность для продолжительности жизни и фенотипа рыбы, а также воспроизводимость с точки зрения клиренса половых стероидов. Использование этих процедур в сочетании с другими преимуществами использования этой модели малого телеоста значительно улучшит понимание механизмов обратной связи в нейроэндокринном контроле репродукции и пластичности тканей, обеспечиваемых половыми стероидами у позвоночных.

Introduction

У позвоночных половые стероиды, которые в основном вырабатываются гонадами, играют важную роль в регуляции оси Мозг-Гипофиз-Гонад (БПГ) через различные механизмы обратной связи1,2,3,4,5. Кроме того, половые стероиды влияют на пролиферацию и активность нейронов в головном мозге6,7,8 и эндокринных клеток, включая гонадотропы, в гипофизе9,10,и таким образом играют решающую роль в пластичности мозга и гипофиза. Несмотря на относительно хорошие знания млекопитающих, механизм регуляции оси BPG, опосредованный половыми стероидами, далек от понимания у видов, не являющихся млекопитающими, что приводит к плохому пониманию эволюционных законсервированных принципов11. По-прежнему существует ограниченное число исследований, документирующих роль половых стероидов в пластичности мозга и гипофиза, что повышает необходимость дальнейших исследований роли и влияния половых стероидов на различные виды позвоночных.

Среди позвоночных телеосты стали мощными образцовыми животными в решении многочисленных биологических и физиологических вопросов, включая реакцию на стресс12,13,рост14,15,физиологию питания16,17 и размножение2. Телеосты, в которых половые стероиды в основном представлены эстрадиолом (Е2) у самок и 11-кетотестостероном (11-КТ) у самцов18,19лет, уже давно являются надежными экспериментальными моделями для исследования общего принципа размножения между видами. Телеосты проявляют уникальность в своих гипоталамо-гипофизарных соединениях20,21 и отчетливых гонадотропных клетках22,которые иногда удобны для выяснения регуляторных механизмов. Более того, благодаря своей пригодности как к лабораторным, так и к полевым экспериментам, телеосты предлагают много преимуществ по сравнению с другими организмами. Их относительно недорого приобрести и обслуживать23,24. В частности, небольшие модели телеоста, такие как рыбкиданио (Danio rerio)и японская медака(Oryzias latipes),являются видами с очень высокой плодовитостью и относительно коротким жизненным циклом, позволяющим быстро анализировать функцию генов и механизмы заболевания23,что обеспечивает еще большие преимущества в решении множества биологических и физиологических вопросов, учитывая многочисленные хорошо разработанные протоколы и генетический инструментарий, доступные для этих видов25.

В многочисленных исследованиях удаление гонад (гонадэктомия) наряду с методами забора крови были использованы в качестве метода для исследования многих физиологических вопросов, в том числе его влияния на репродуктивную физиологию позвоночных у млекопитающих26,27,28,птиц29 и амфибий30. Хотя влияние гонадэктомии на репродуктивную физиологию может быть альтернативно имитировано антагонистами половых стероидов, такими как тамоксифен и кломифен, эффект препаратов, по-видимому, непоследователен из-за бимодальных эффектов31,32. Хроническое воздействие антагониста половых стероидов может привести к увеличению яичников33,34,что может отключить наблюдение за его эффектами в долгосрочных целях из-за нездорового фенотипа. Кроме того, невозможно провести восстановительный эксперимент после лечения половыми стероидами, чтобы оправдать специфический эффект определенных половых стероидов. Наряду с вышеупомянутыми моментами, другие компромиссы использования секс-стероидных антагонистов были широко рассмотрены31,32. Поэтому гонадэктомия все еще появляется сегодня как мощный метод исследования роли половых стероидов.

В то время как методы гонадэктомии и забора крови относительно легко выполнять у более крупных видов, таких как европейский морской окунь(Dicentrarchus labrax)35,синеголовый крапивник(Thalassoma bifasciatum)36,собачья рыба(Scyliorhinus canicula)37 и сом(Heteropneustes fossilis и Clarias bathracus)38,39,они вызывают проблемы при применении к мелким рыбам в качестве медака. Например, использование системы доставки рыбной анестезии (FADS)40 менее осуществимо и, по-видимому, подвержено чрезмерному физическому повреждению мелких рыб. Кроме того, процедура гонадэктомии, которая обычно используется для более крупных рыб40, не подходит для мелких рыб, что требует высокой точности, чтобы избежать чрезмерных повреждений. Наконец, забор крови является сложной задачей из-за ограниченного доступа к кровеносных сосудам и небольшого количества крови у этих животных. Поэтому важен четкий протокол, демонстрирующий каждый шаг гонадэктомии и забора крови в небольшом телеосте.

Этот протокол демонстрирует пошаговые процедуры гонадэктомии с последующим забором крови у японской медаки, небольшой пресноводной рыбы, произрастающих в Восточной Азии. Японские медаки имеют секвенированный геном, несколько молекулярных и генетических инструментов, доступных25,и генетическую систему определения пола, позволяющую проводить исследование половых различий до того, как вторичные половые признаки или гонады будут хорошо развиты41. Интересно, что японские медаки обладают сросшейся гонадой в отличие от многих других видов телеостов42. Эти два метода в совокупности занимают всего 8 минут и завершат список видеопротегов, уже существующих для этого вида, которые включают маркировку кровеносных сосудов43,зажим патча на участках44 гипофиза и нейронах мозга45и первичную культуру клеток46. Эти методы позволят исследовательской общине исследовать и лучше понять роль половых стероидов в механизмах обратной связи, а также пластичность мозга и гипофиза в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты и обращение с животными проводились в соответствии с рекомендациями по благополучию экспериментальных животных в Норвежском университете естественных наук. Эксперименты с использованием гонадэктомии были одобрены Норвежским управлением по безопасности пищевых продуктов (FOTS ID 24305).

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с использованием взрослого мужчины и самки (6-7 месяцев, вес около 0,35 г, длина около 2,7 см) японской медаки. Пол определяли путем различения вторичных половых признаков, таких как размер и форма спинного и анального плавников, как описано в42,47.

1. Подготовка приборов и растворов

  1. Готовят раствор анестетика (0,6% трикаин).
    1. Развести 0,6 г трикаина (MS-222) в 100 мл 10x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
    2. Распределите 1 мл раствора трикаина в несколько пластиковых пробирок по 1,5 мл и храните при -20 °C до использования.
  2. Подготовьте рекуперационную воду (0,9% раствор NaCl), добавив 18 г NaCl в 2 л аквариумной воды. Хранить раствор при комнатной температуре до использования.
  3. Подготовьте инструменты разреза, разбив бритву по диагонали, чтобы получить острую точку(рисунок 1А).
  4. Готовят раствор антикоагулянта в крови (0,05 Ед/мкл гепарина натрия) путем разведения 25 мкл гепарина натрия в 500 мкл 1x PBS. Хранить антикоагулянтный раствор при 4 °C до использования.
  5. Подготовьте две стеклянные иглы из стеклянного капилляра длиной 90 мм, потянув стеклянный капилляр с помощью съемника иглы(рисунок 1B)в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наружный диаметр стеклянной иглы составляет 1 мм, а внутренний диаметр - 0,6 мм.
  6. Подготовьте пластиковую крышку трубки объемом 1,5 мл, разрезав крышку и сделайте отверстие, которое подходит к наружному диаметруиглы (рисунок 1С). Чтобы сделать отверстие, нагрейте один конец стеклянного капилляра толщиной 9 мм и протрите нагретый стеклянный капилляр через крышку. В качестве альтернативы, используйте иглу, чтобы пробить через крышку, пока диаметр отверстия не примыкает к 9-миллиметровому стеклянному капилляру.

2. Процедура гонадэктомии

  1. Готовят 0,02% раствора анестетика, разбавляя один тюбик запаса трикаина (0,6%) в 30 мл аквариумной воды.
  2. Подготовьте инструменты для рассечения, включая один ультратонкий и два тонких щипца (один с относительно широким наконечником), небольшие ножницы, нейлоновую нить и бритву, как описано в шаге 1.3.
  3. Обезболить рыбу, поместив ее в 0,02% раствор анестетика на 30-60 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность анестезии зависит от размера и веса рыбы и должна быть адаптирована. Чтобы убедиться, что рыба полностью обезболивается, тело рыбы можно аккуратно зажать с помощью щипцов. Если рыба не реагирует, можно начинать гонадэктомию.
  4. Выньте рыбу из раствора анестетика и поместите рыбу горизонтально на бок, вне воды под рассеченным микроскопом.
  5. Овариэктомия (OVX) у женщин
    1. Удалите яйцекладущие яйца (яйца, свисающие вне тела самки), если таковые вообще есть), и соскоблите чешуйки в области разреза(рисунок 2А).
    2. Аккуратно сделайте разрез длиной около 2-2,5 мм между ребрами, между брюшным и анальным плавниками(рисунок 2А),используя лезвие бритвы. Затем осторожно зажмите брюшко рыбы, вынимая завязки понемногу, используя тонкие щипцы с широким кончиком.
    3. Вырежьте конец яичников с помощью тонких щипцов и отложите яичники в сторону(рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не сломать яичниковый мешок, если это возможно. Если мешок яичника сломан, удалите любые следы гонад как можно полнее, не оставляя даже неовулированных яйцеклеток.
  6. Орхидэктомия у мужчин
    1. Аккуратно сделайте разрез между ребрами над анусом(рисунок 2А)и медленно открывайте разрез с помощью тонких щипцов.
    2. Осторожно возьмите яички с помощью тонких щипцов и медленно вынимайте яички. После этого вырежьте конец яичек, чтобы полностью удалить яички(рисунок 2B). Для мужской орхидэктомии все препараты аналогичны у самок вплоть до разреза части. При захвате яичек иногда получается жир, напоминающий яички. Однако после восстановления жира можно попробовать найти яички еще раз(рисунок 2В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как для мужчин, так и для женщин важно свести к минимуму размер разреза в брюшной полости, чтобы предотвратить чрезмерные повреждения, которые могут привести к смертности. Иногда кишечник может также появляться через разрез вместе с гонадами, поэтому убедитесь, что они правильно возвращены внутрь разреза перед закрытием. Предварительные знания о расположении яичников и яичек в животе медака имеют важное значение.
  7. Зашивают разрез аналогично у мужчин и женщин(рисунок 3).
    1. Поместите нейлоновую нить рядом с областью разреза и проколите кожу с правой стороны разреза через внутреннюю полость тела, используя ультратонкие щипцы, чтобы взять нить тонкими щипцами(рисунок 3;1-2).
    2. Проколоть кожу с левой стороны разреза через внешнюю полость тела, чтобы вывести нить (фиг.3;3-4).
    3. Закройте разрезное отверстие и сделайте два узла и отрежьте лишнюю нить(рисунок 3;4-6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шов должен быть достаточно плотным, а оставшаяся нить на рыбе должна быть достаточно длинной, чтобы предотвратить ослабление шва. Вся процедура от анестезии до наложения швов обычно занимает до 6 минут. Более длительное время может привести к смертности.
    4. Поместите рыбок в рекуперационную воду и оставьте их не менее чем на 24 часа, прежде чем перенести их в аквариумную систему.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гонадэктомированные рыбы обычно демонстрируют нормальное поведение после 1-2 часов в восстановительной воде. Поэтому, в зависимости от цели эксперимента, можно взять пробу рыбы после этого временного интервала.

3. Процедура забора крови

  1. Подготовьте инструменты: стеклянную иглу, силиконовый капилляр, пластиковую трубку с отверстием, пустую пластиковую трубку объемом 1,5 мл, миницентрифугу и ленту.
  2. Обезболить рыбу с помощью 0,02% раствора анестетика, как описано на этапе 2.1, и поместить рыбу под рассеченный микроскоп в вертикальное положение(рисунок 4А). Поместите рыбу на яркую поверхность, чтобы облегчить визуализацию хвостовой проколовой венки.
  3. Установите ящик крови, прикрепив стеклянную иглу к силиконовому капилляру(рисунок 4B). Разбейте кончик иглы широкими щипцами и покрывайте внутреннюю часть иглы антикоагулянтным раствором путем всасывания и продувания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование присоски и силиконового капилляра длиной не менее 50 см рекомендуется для мер безопасности, чтобы избежать любого прямого контакта крови при всасывании. Кроме того, убедитесь, что отверстие кончика иглы достаточно велико, чтобы можно было отвести кровь.
  4. Направьте иглу в область ростки рыбы, направьтесь в вену каудальной чесочка(рисунок 5А)и вытягивайте кровь с помощью рта до тех пор, пока не будет заполнена по крайней мере одна четверть общего объемаиглы (рисунок 5B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно прекратить всасывание перед извлечением иглы из тела рыбы.
  5. Отпустите иглу и положите кусок скотча на близость острой стороны иглы. Поместите крышку с отверстием на трубку для сбора и поместите иглу внутрь трубки через отверстие с наконечником иглы снаружи(рисунок 5C).
  6. Поместите рыбок в рекуперационную воду и оставьте их не менее чем на 24 часа, прежде чем перенести их в аквариумную систему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить второй забор крови у той же рыбы, прочтите кровь через неделю после первого забора крови.
  7. Вспышка вращает собранную кровь в течение 1-2 секунд с 1000 х г при комнатной температуре, чтобы собрать кровь в пробирке.
  8. Переходите непосредственно к последующим применениям или храните кровь при -20 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущему исследованию по извлечению половых стероидов из цельной крови48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот протокол описывает каждый шаг для выполнения гонадэктомии и забора крови в модели малого размера телеоста, японской медаке. Выживаемость рыб после овариэктомии (OVX) у самок составляет 100% (10 из 10 рыб), в то время как 94% (17 из 18 рыб) самцов выжили после орхидэктомии. Между тем, после того, как была проведена процедура забора крови, все (38 рыб) рыбы выжили.

Самки с фиктивной операцией показывают яйцекладку(рисунок 6A),и все яйцеклетки были оплодотворены и допущены к эмбриональному развитию(рисунок 6B). Самцы, оперированные фиктивными, также смогли оплодотворить яйцеклетки всего через 1-2 недели. Две из шести частично гонадэктомированных самок, выращенных с частично гонадетомизированными самцами, также показали яйцекладку со 100% оплодотворенных яйцеклеток через 2 месяца. Напротив, у полностью гонектомизированных рыб не наблюдалось яйцекладки у самок или оплодотворения самцами, даже через 4 месяца.

При правильном выполнении форма тела рыбы незначительно изменяется(рисунок 7А),и после процедуры гонадэктомии не должно остаться ни одного куска гонады(рисунок 7В). Между тем, через 4 недели после гонадэктомии разрез и шов полностью исчезли(рисунок 8),а через 4 месяца все гонадэктомированные рыбы все еще показывали здоровый фенотип, и гонадная ткань не была найдена.

Концентрации E2 в крови у самок(таблица 1),измеренные с помощью ИФА в соответствии с инструкциями производителя, показали, что уровень E2 у рыб OVX значительно ниже, чем у рыб с фиктивной эксплуатацией через 24 часа после операции(p < 0,00001). Через 4 месяца уровень E2 у рыб OVX также значительно ниже, чем у рыб с фиктивным управлением(p < 0,00001) и не показывает существенной разницы по сравнению с таковой через 24 часа после OVX(p > 0,05). Наконец, частично рыбы OVX, где было удалено только от 1/3 до 1/2 гонады, показывают значительно более низкие уровни E2, чем рыба с фиктивной эксплуатацией(p = 0,0437) и значительно более высокие уровни E2, чем полностью OVX-рыбы(p < 0,00001)(рисунок 9A).

Аналогично у самцов(таблица 1)концентрация 11-КТ в орхидектомизированной рыбе значительно ниже, чем у рыб с фиктивной операцией через 24 часа после операции(p < 0,00001). Уровень 11-КТ у орхидектомизированной рыбы через 4 месяца также значительно ниже, чем у рыб с фиктивной эксплуатацией(p < 0,00001) и не показывает разницы по сравнению с 24 часами после орхидектомизированной рыбы(p > 0,05). Наконец, частично орхидектомизированные рыбы показывают значительно более низкие уровни 11-КТ, чем рыба с фиктивной эксплуатацией(p = 0,0428) и значительно более высокие уровни 11-КТ, чем полностью орхидектомизированные рыбы(p < 0,00001)(рисунок 9B).

Figure 1
Рисунок 1. Подготовка приборов. (A)Лезвие бритвы для гонадэктомии,(B)стеклянная игла для извлечения крови и(C)пластиковая трубка вместе с крышкой с отверстием для сбора крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Расположение области разреза. А)Рисунок области разреза, расположенной между ребрами, между брюшным и анальным плавниками у самок (левая панель) и самцов (правая панель); Б)удаление гонад у самок (левая панель) и самцов (правая панель), белые круги, показывающие совместную часть, белая стрелка, показывающая яичко, и черная стрелка, показывающая жир. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Процедура наложения швов. 1) Отверстие делается с правой стороны разреза с помощью ультратонких щипцов. 2) Нейлоновая нить пропускается через кожу с помощью отверстия, сделанного в 1. 3) В левой части разреза делается отверстие. 4) Нейлоновая нить пропускается через отверстие, сделанное в 3. 5) Дважды делается узел над рукой, чтобы закрыть разрез. 6) Лишняя резьба разрезается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Положение рыбы во время забора крови (А), установка стеклянной иглы с силиконовым капилляром (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Область всасывания забора крови (А), взятой крови (В) и этапов забора крови (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6. Рыба, управляемая фикцией, показывает яйцекладку яиц, направленных белой стрелкой (А) и оплодотворенных яиц (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7. Морфологический (А) и анатомический (В) внешний вид интактных и гонодектомизированных рыб. Белые стрелки (верхние панели) показывают след операции на гонадэктомированных рыбах. Черные стрелки (нижние панели) показывают гонады в неповрежденной рыбе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8. Хирургические отметки у самцов и самок рыб через 4 недели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9. Уровни в крови Е2 у женщин (А) и 11-КТ у самцов (В) японской медаки, через 24 ч после фиктивной операции (контроль), частично гонадэктомии или гонадэктомии, и через 4 месяца после гонадэктомии (ОВХ, овариэктомия у женщин; Кас, орхидэктомия у мужчин). Статистический анализ проводился с использованием One Way ANOVA, за которым последовал тест Tukey Post Hoc. Разные буквы (a-c) показывают существенные различия(p-значение < 0,05). Данные на графике представлены в виде среднего + SD, n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Уровни E2 (Женщины) Уровни 11-КТ (мужчины)
Фиктивный 4,15 ± 0,5 (n = 5) 10,38 ± 1,32 (n = 5)
Частично гонадэктомированный 3,37 ± 0,6 (n = 5) 8,37 ± 1,92 (n = 5)
24ч после гонадэктомии 0,36 ± 0,2 (n = 5) 0,4 ± 0,2 (n = 5)
4 месяца после гонадэктомии 0,54 ± 0,28 (n = 5) 0,74 ± 0,22 (n = 5)

Таблица 1. Уровни E2 и 11-KT (ng/mL) у самок и самцов фиктивных и гонодектомизированных и частично гонодектомизированных рыб.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как сообщалось в предыдущей литературе, гонадэктомия и забор крови уже давно используются у других модельных видов для исследования вопросов, связанных с ролью половых стероидов в регуляции оси БПГ. Однако эти методы, по-видимому, поддаются только более крупным животным. Учитывая небольшой размер широко используемой модели телеоста, японской медаки, мы предоставляем подробный протокол для гонадэктомии и забора крови, который возможен для этого вида.

Тот факт, что выживаемость гонадэктомированных рыб достигла почти 100%, свидетельствует о том, что процедуру гонадэктомии целесообразно применять на медаке. Точно так же процедура забора крови не влияет на выживаемость рыб, о чем свидетельствует 100% выживаемость после прохождения этой процедуры. Кроме того, самки, выращенные вместе с самцами с фиктивным оперированием, показывают яйцекладку и 100% оплодотворенную икру, что указывает на то, что разрез и процедура наложения швов не влияют на размножение рыбы. Другими словами, они были достаточно здоровы, чтобы нереститься. Кроме того, частично гонодектомизированные рыбы демонстрируют концентрации половых стероидов, сопоставимые с рыбами, управляемыми фиктивным управлением, и яйцекладка у некоторых самок, а также оплодотворение яиц самцами наблюдались у этих частично гонодектомизированных рыб. Эти результаты свидетельствуют о том, что процедура гонадэктомии должна быть выполнена с высокой точностью, а это означает, что яичники или яички должны быть полностью удалены.

Как показано на рисунке 8,разрез и след шва на рыбе полностью исчезли через 4 недели после гонадэктомии, а рыбы все еще живы и выглядят здоровыми через 4 месяца после операции. Они свидетельствуют о том, что процедура эксплуатации безопасна для рыбы в долгосрочной перспективе и не влияет на продолжительность жизни рыбы. Кроме того, через 4 месяца гонад не наблюдалось. Это подтверждается низкими уровнями E2 и 11-KT, которые все еще аналогичны тем, которые обнаружены у гонадэктомированных рыб через 24 часа.

Уровни E2 и 11-KT у гонадэктомированных рыб значительно ниже, чем у рыб с фиктивной эксплуатацией, уже через 24 часа после гонадэктомии и остаются ниже у рыб, отобранных через 4 месяца после гонадэктомии. Значительно более низкие уровни половых стероидов у гонодектомизированных рыб по сравнению с контролем наблюдались в предыдущих исследованиях на собачьихрыбах 37,сомах39 и медака48. Эти последовательные данные свидетельствуют о том, что процедура гонадэктомии, описанная в протоколе, является надежным методом очистки циркулирующих половых стероидов.

Поскольку эта процедура не опирается на FADS, как показано в40,гонадэктомия должна быть проведена как можно быстрее, чтобы предотвратить смертность во время операции. Действительно, использование FADS позволяет поддерживать ритм работы, так как этот инструмент обеспечивает непрерывное анестезиологическое состояние рыбы, несмотря на воздействие воздуха. Тем не менее, из-за его меньшей осуществимости в небольшом телеосте, как медака, использование FADS не может быть выполнено с таким размером рыбы. Кроме того, в отличие от предыдущего протокола гонадэктомии у более крупных рыб, который позволяет широкому разрезу достигать гонады, протокол, описанный в этой рукописи, не допускает широкого разреза, чтобы избежать чрезмерного повреждения мелкой рыбы. Поэтому следует быть очень осторожным при попытке доступа к гонаде с помощью щипцов, чтобы предотвратить повреждение других тканей внутри полости тела рыбы.

Протокол опирается на быструю и чистую процедуру. Таким образом, обучение настоятельно рекомендуется до достижения высокого уровня успеха, о чем свидетельствует высокая выживаемость рыб после гонадэктомии, а также полное удаление гонад (см. разницу в морфологическом и анатомическом внешнем виде рыбы до и после успешной гонадэктомии на рисунке 7). На самом деле, многие факторы могут повлиять на успешность процедуры, включая период анестезии, ширину разреза, точность и аккуратность шва и обработку рыбы во время процедуры. Другим важным моментом является то, что следует готовить здоровую рыбу, оптимально поддерживая рыбу до выполнения протокола.

Что касается процедуры забора крови, предыдущие исследования пытались взять кровь у медаки48 и рыбки данио49,50,51,но процедура не позволяет повторно отбирать кровь у одной и той же рыбы, поскольку кровь берется после усыпления рыбы. Повторный забор крови был продемонстрирован с использованием рыбок данио в другом исследовании52,но мы сообщаем об этом типе протокола впервые в медаке.

Оценка концентраций половых стероидов обычно проводится с использованием набора иммуноферментного анализа (ИФА), и существует множество наборов ИФА, коммерчески доступных для различных типов половых стероидов. Из-за низкого количества крови, собранной во время забора крови, последующие анализы предназначены для цельной крови. Предыдущие исследования показали, что существует разница в измеренном уровне циркулирующих стероидных уровней, извлеченных из цельной крови иплазмы 53,54. Поэтому разница в уровнях половых стероидов от цельной крови и плазмы должна быть проверена до проведения реального эксперимента с использованием протокола.

Как было задокументировано в предыдущих исследованиях на различных животных моделях, протокол, описанный здесь, позволит исследовать вопросы, связанные с репродуктивной физиологией, используя в качестве модели телеост небольшого размера. Фактически, эти методы уже внесли свой вклад в ответы на вопросы, касающиеся регуляции оси BPG и ее механизмов обратной связи, таких как вовлечение kiss1 (ген киспептина типа 1), экспрессирующих нейроны в петлях положительной обратной связи55,эстроген-опосредованную регуляцию kiss1, экспрессирующую нейроны в ядре ventralis tuberis (NVT) и kiss2 (ген кисспептина типа 2), экспрессирующую нейроны в преоптической области (POA)56, 57,возможное вовлечение рецептора эстрогена β1 (Esr2a) в снижение регуляции уровня экспрессии ФСГ у самок японской медаки58, а также профиль циркадного ритма Е2 у самок рыб48. Кроме того, поскольку предыдущие исследования показали, что половые стероиды также влияют на пролиферацию гонадотропных клеток в гипофизе телеостов59,60,интересно исследовать влияние клиренса половых стероидов после гонадэктомии на пластичность гипофиза.

Методика забора крови может быть использована не только для анализа половых стероидов, но и для другого анализа содержания крови, включая уровень глюкозы в крови. Действительно, протокол также может быть применен для измерения уровня глюкозы в крови, как показано в рыбке данио52 и медаке61. Поэтому этот метод может быть расширен для решения исследовательских вопросов в других областях физиологии.

Наконец, протоколы, описанные здесь, предназначены и оптимизированы для взрослой японской медаки, и результаты из-за разного размера рыбы и материалов, используемых во время процедур, могут варьироваться. Кроме того, поскольку левый и правый яичники / яички медака слиты, что может обеспечить важное преимущество для гонадэктомии, этот протокол может потребовать нескольких адаптаций перед использованием у других видов, где это не так, например, у рыбок данио. Таким образом, перед тестированием этих протоколов следует учитывать оптимизацию в соответствии с выбором лабораторного оборудования и размеров рыб.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят г-жу Лурдес Карреон Г Тан за ее помощь в рыбоводстве. Эта работа финансировалась NMBU, Grants-in-Aid от Японского общества содействия развитию науки (JSPS) (грант No 18H04881 и 18K19323) и грантом на исследовательские проекты в области фундаментальных наук от Фонда Сумитомо в S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  2. Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
  3. Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
  4. Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
  5. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
  6. Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
  7. Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
  8. Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
  9. Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
  10. Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
  11. Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
  12. Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
  13. Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
  14. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
  15. Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
  16. MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
  17. Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
  18. Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
  19. Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
  20. Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
  21. Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
  22. Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
  23. Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
  24. Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
  25. Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
  26. Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
  27. Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
  28. Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
  29. Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
  30. McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
  31. Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
  32. Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
  33. Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
  34. Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
  35. Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
  36. Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
  37. Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
  38. Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
  39. Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
  40. Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
  41. Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
  42. Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
  43. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  44. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  45. Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
  46. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  47. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
  48. Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
  49. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  50. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  51. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
  52. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
  53. Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
  54. Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
  55. Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
  56. Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
  57. Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
  58. Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
  59. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
  60. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
  61. Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).

Tags

Биология Выпуск 166 Гонадэктомия овариэктомия орхидэктомия кастрация медака кровь стероиды рыба размножение пластичность эстрадиол 11-кетотестостерон
Процедуры гонадэктомии и забора крови в малогабаритной модели Teleost японской медаки (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D.,… More

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter