Summary
यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश भ्रूण के विच्छेदित दिलों में पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करता है ।
Abstract
परिवेश ठीक कण पदार्थ (पीएम२.५)जोखिम हृदय विकास विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं । 8-हाइड्रोक्सी-2'डिऑक्सीजेनेज (8-ओएचडीजी) ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति का एक मार्कर है और γH2AX डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक के लिए एक संवेदनशील मार्कर है। इस अध्ययन में, हम प्रधानमंत्री२.५-प्रेरित8-OHdG का पता लगाने और एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग कर जेब्राफिश भ्रूण के दिल में परिवर्तन γH2AX उद्देश्य । जेब्राफिश भ्रूण 2 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) में एंटीऑक्सीडेंट एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी, 0.25 माइक्रोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पीएम2.5 से एक्सट्रैक्टेबल ऑर्गेनिक मैटर्स (ईओएम) के साथ इलाज किया गया। डीएमएसओ को वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ७२ एचपीएफ में, दिल एक सिरिंज सुई का उपयोग कर भ्रूण से विच्छेदित किया गया और तय और permeabilized । अवरुद्ध होने के बाद 8-ओएचडीजी और γH2AX के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों की जांच की गई । इसके बाद नमूनों को धोया गया और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया गया । इसके परिणामस्वरूप छवियों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत देखा गया और इमेजजे का उपयोग करके मात्राकृत किया गया। परिणाम बताते हैं कि पीएम25 से ईओएम ने जेब्राफिश भ्रूण के दिल में 8-ओएचडीजी और γH2AX संकेतों को काफी बढ़ाया। हालांकि, एनएसी, एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) मेहतर के रूप में कार्य, आंशिक रूप से EOM प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया व्यक्त की । यहां, हम पीएम२.५-प्रेरितहृदय दोषों में डीएनए क्षति की भूमिका की जांच के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में पर्यावरणीय रासायनिक प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
वायु प्रदूषण अब दुनिया के सामने एक गंभीर पर्यावरणीय समस्या है । परिवेश ठीक कण पदार्थ (पीएम2.5),जो वायु गुणवत्ता के सबसे महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है, बड़ी संख्या में हानिकारक पदार्थ ले जा सकता है और रक्त संचार प्रणाली में प्रवेश कर सकता है, जिससे मानव स्वास्थ्य को गंभीर नुकसान पहुंच सकता है1। महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला है कि पीएम2.5 के संपर्क में आने से जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) 2,3का खतरा बढ़सकताहै . पशु प्रयोगों से मिले साक्ष्यों से यह भी पता चला है कि पीएम25 जेब्राफिश भ्रूण और चूहों की संतानों में असामान्य हृदय विकास का कारण बन सकता है लेकिन पीएम25 की हृदय विकासात्मक विषाक्तता का आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात है4,5,6.
डीएनए क्षति सेल चक्र की गिरफ्तारी का कारण बन सकती है और एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकती है, जो बड़े पैमाने पर जनक कोशिकाओं की क्षमता को नष्ट कर सकती है और परिणामस्वरूप, हृदय विकास7को ख़राब कर सकतीहै)। यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि पीएम2.5सहित पर्यावरण प्रदूषकों में ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस मैकेनिज्म8,9के माध्यम से डीएनए पर हमला करने की क्षमता है। मानव और जेब्राफिश हृदय दोनों का विकास ऑक्सीडेटिव तनाव 10 ,11,12के प्रति संवेदनशील है . 8- ओएचडीजी एक ऑक्सीडेटिव डीएनए डैमेज मार्कर है, और γH2AX सिग्नल डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक का मार्कर है। एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी), इंट्रासेलुलर सिस्टीन और ग्लूटाथिएक का सिंथेटिक अग्रदूत, व्यापक रूप से एंटी-ऑक्सीडेटिव यौगिक के रूप में उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, हम एनएसी का उपयोग पीएम25में ऑक्सीडेटिव तनाव की भूमिका की जांच करने के लिए करते हैं - प्रेरित डीएनए क्षति13।
एक मॉडल कशेरुकी के रूप में जेब्राफिश का व्यापक रूप से हृदय विकास और मानव हृदय रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि कशेरुकी विकास के तंत्र14,15कशेरुकी के बीच अत्यधिक संरक्षित होते हैं । एक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करने के फायदे में उनके छोटे आकार, मजबूत प्रजनन क्षमता और कम भोजन लागत शामिल हैं। इन अध्ययनों के लिए विशेष रुचि के, जेब्राफिश भ्रूण प्रारंभिक विकास के दौरान संचार प्रणाली पर निर्भर नहीं करते हैं और गंभीर हृदय विकृति14जीवित रह सकते हैं। इसके अलावा, उनकी पारदर्शिता पूरे शरीर को सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। इस प्रकार, जेब्राफिश भ्रूण विभिन्न पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप हृदय विकासात्मक विषाक्तता के प्रेरण में शामिल आणविक तंत्र का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदानकरतेहैं5,16,17. हमने पहले बताया है कि पीएम२.५-प्रेरितऑक्सीडेटिव स्ट्रेस डीएनए डैमेज और एपोप्टोसिस की ओर ले जाता है, जिसके परिणामस्वरूप जेब्राफिश18में दिल की विकृतियां होती हैं । इस अध्ययन में, हम जेब्राफिश भ्रूण के दिल में पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति की जांच के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
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Protocol
इस अध्ययन में इस्तेमाल किए जाने वाले वाइल्ड टाइप जेब्राफिश (एबी) को चीन के वुहान में नेशनल जेब्राफिश रिसोर्स सेंटर से प्राप्त किया गया था । यहां उल्लिखित सभी पशु प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई है और Soochow विश्वविद्यालय की आचार समिति के पशु देखभाल संस्था द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. पीएम2.5 सैंपलिंग और ऑर्गेनिक कंपाउंड एक्सट्रैक्पन
नोट: प्रधानमंत्री२.५ सूज़ौ, चीन, 1-7 अगस्त, २०१५ में एक शहरी क्षेत्र में एकत्र किया गया था, के रूप में पहले5वर्णित है ।
- कार्बनिक घटकों को हटाने के लिए 2 घंटे के लिए 500 डिग्री सेल्सियस मफल भट्ठी में 47 मिमी क्वार्ट्ज झिल्ली फिल्टर बेक करें।
- निर्बाध नमूने के 24 घंटे के लिए एक पीएम2.5 पारखी में एक फिल्टर रखें।
- फिल्टर निकालें और कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए सूखी ।
- एक विश्लेषणात्मक संतुलन के साथ फिल्टर की मात्रा।
- सॉल्वेंट19के रूप में डाइक्लोरोमेथेन का उपयोग करके सोक्सलेट निष्कर्षण द्वारा फिल्टर से कार्बनिक घटकों को निकालें।
- 60 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान और नाइट्रोजन प्रवाह में रोटरी वाष्पीकरण द्वारा ईओएम को सुखाएं। डीएमओ में ईओएम को भंग करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. ज़ेब्राफ़िश भ्रूण संग्रह और उपचार
- 14 घंटे प्रकाश और 10 घंटे अंधेरे फोटोपीरियोड चक्र के साथ एक पुनः परिसंचारी जलकृषि प्रणाली में 28.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर ज़ेब्राफ़िश बनाए रखें।
- स्वस्थ वयस्क ज़ेब्राफ़िश को 2:1 पुरुष से महिला अनुपात में एक टैंक में रखें।
- अगले दिन, भ्रूण एकत्र करें और उन्हें सिस्टम पानी (यानी, जेब्राफिश प्रजनन पानी) से धोएं।
- 7 सेमी (प्रति डिश लगभग 50 भ्रूण) व्यास के साथ व्यक्तिगत ग्लास पेट्री व्यंजनों में 4 समूहों में एक सामान्य विकास (एक समान आकार, पूर्ण अनाज और कोई अंडा जमावट) का प्रदर्शन करने वाले जेब्राफिश भ्रूण का चयन और बेतरतीब ढंग से विभाजित करें।
- 2 एचपीएफ से72 एचपीएफ तक 0.25 माइक्रोन पर एनएसी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पीएम 2.5 (5 मिलीग्राम/एल) के साथ भ्रूण का इलाज करें। 0.1% (v/v) पर अंतिम एकाग्रता के लिए वाहन नियंत्रण के रूप में डीएमएसओ का उपयोग करें।
3. जेब्राफिश भ्रूण और हृदय विच्छेदन का रूपात्मक अवलोकन
- 72 एचपीएफ में, भ्रूण को ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें और स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत देखें। रिकॉर्ड हृदय विकृतियां, जैसे कि पेरिकार्डियल एडिमा, बदल लूपिंग, और आकार में कमी।
- विकृति दरों की गणना करें (कुल जीवित भ्रूण में से हृदय दोषों के साथ भ्रूण का प्रतिशत) और तुर्की के कई तुलना परीक्षण (पी < ०.०५ = सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण) के बाद एक-तरफा ANOVA का उपयोग करके समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण करें ।
- 0.6 मिलीग्राम/
- रिकॉर्ड दिल 30 एस के लिए धड़कता है और ImageJ सॉफ्टवेयर5,20का उपयोग कर दिल की दरों की मात्रा निर्धारित करते हैं ।
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे एक डिस्पोजेबल सिरिंज सुई के साथ जेब्राफिश भ्रूण से दिल विच्छेदन। सावधानी- दिल के आकार को नष्ट करने से बचें।
4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख
- जेब्राफिश भ्रूण के दिल में पीएम२.५ प्रेरित डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का इस्तेमाल करने के लिए, एक साफ ग्लास साइड पर एक सर्कल खींचने के लिए हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का इस्तेमाल करें ।
- एक फिक्सेटिव समाधान बनाने के लिए फॉस्फेट बफर लवीन (पीबीएस) के 1.25 एमएल में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 50 माइक्रोनल जोड़ें।
- एक हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन सर्कल में 3 विच्छेदित दिलों को रखें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- माइक्रोस्कोप के नीचे समाधान को कम से कम 5 मिनट के लिए सूखाएं और नमूनों को कम से कम 5 मिनट तक सुखाएं, ताकि दिल पूरी तरह से ग्लास स्लाइड से जुड़ सकें।
- पीबीएस में तीन बार 0.1% ट्वीन 20 (पीबीएसटी) के साथ 5 मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं।
- 5% बीएसए समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएसए के 1000 माइक्रोन में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 50 माइक्रोन जोड़ें और गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
- समाधान को कम करें और नमूनों को पीबीएएसटी के साथ तीन बार 5 मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं।
- एक काम प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल समाधान प्राप्त करने के लिए पीबीएसएल के 296 माइक्रोन में γH2AX के खिलाफ 8-ओएचडीजी के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 2 माइक्रोन और खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के 2 माइक्रोनल को पतला करें।
- 8-OHdG के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल समाधान के 50 माइक्रोन के साथ दिल के नमूनों को इनक्यूबेट करें और कमरे के तापमान पर कम से कम एक घंटे या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्रीकृत कक्ष में γH2AX (रात भर इनक्यूबेशन संकेत तीव्रता बढ़ा सकते हैं)।
- समाधान को कम करें और नमूनों को पीबीएएसटी के साथ तीन बार 5 मिनट प्रति वॉश के लिए धोएं।
- फिटसी के 1 μL-लेबल बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी और cy3 बकरी विरोधी खरगोश द्वितीयक एंटीबॉडी के 1 μL PBST के ४९८ माइक्रोन में एक काम माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल समाधान प्राप्त करने के लिए और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट (PBST में 1:500) अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ।
- समाधान को डिकेंट करें और प्रकाश से संरक्षित प्रति वॉश 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार नमूनों को धोएं।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए परमाणु धुंधला के लिए नमूनों के लिए DAPI (4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडल) के 20 μL जोड़ें ।
- सुखाने और आंदोलन को रोकने के लिए नेल पॉलिश के साथ स्लाइड और सील करने के लिए एक कवरस्लिप लागू करें। फिर एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों की छवि और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दिल क्षेत्र के फ्लोरेसेंस संकेत मात्रा । DMSO नियंत्रण नमूनों के औसत के साथ सापेक्ष परिवर्तन की गणना करें। डेटा के सांख्यिकीय महत्व को चरण 3.2 में निर्धारित करें।
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Representative Results
यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में आने वाले जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को मापने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट विधि है।
इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, एंटीऑक्सीडेंट एनएसी की अनुपस्थिति या उपस्थिति में पीएम2.5 के संपर्क में आने वाले भ्रूणों का मूल्यांकन हृदय विकृतियों की उपस्थिति(चित्र 1)की उपस्थिति के लिए किया गया था। जैसा कि देखा गया, पीएम2.5 से ईओएम ने डीएमएसओ नियंत्रण-उपचारित दिलों की तुलना में कार्डियक टेराटोजेनेसिस में उल्लेखनीय वृद्धि की, जैसे कि पेरिकार्डियल एडीमा, परिवर्तित लूपिंग और आकार में कमी आई। ईओएम(चित्रा 1B)के संपर्क में आने वाले भ्रूणों में दिल की धड़कन की दर में भी काफी कमी आई थी। एनएसी के अलावा काफी तनु EOM प्रेरित हृदय दोष(चित्रा 1)।
यहां इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग ईओएम-उपचारित ऊतकों में डीएनए क्षति की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए जेब्राफिश भ्रूण में 8-ओएचडीजी और γH2AX अभिव्यक्ति को मापने के लिए किया गया था। जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, नियंत्रण की तुलना में ईओएम समूह के साथ इलाज किए गए जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में 8-ओएचडीजी और γH2AX अभिव्यक्ति के स्तर में काफी वृद्धि हुई, जो क्रमशः ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति और डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक में वृद्धि का संकेत है । इसके अलावा, ईओएम-प्रेरित डीएनए क्षति को एनएसी अनुपूरण(चित्रा 2)द्वारा आंशिक रूप से प्रतिकार किया गया था।
चित्रा 1। 72 एचपीएफ में जेब्राफिश भ्रूण के हृदय दोष। (क) 72 एचपीएफ में जेब्राफिश भ्रूण की छवियां। बिंदीदार रेखाएं अटरिया (लाल) या वेंट्रिकल (नीला) का संकेत देती हैं। स्केल बार, 200 माइक्रोन। (ख) हृदय विकृति और दिल की धड़कन की दरें । परिणाम मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । प्रत्येक समूह में कम से ५० भ्रूणों की जांच की गई । EOM: 5 मिलीग्राम/एल पर EOM; नैक: 0.25 μM पर एनएसी.. **, पी < 0.01; , पी<0.001 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। 72 एचपीएफ में जेब्राफिश भ्रूण के दिल में डीएनए क्षति। ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। स्केल बार, 100 माइक्रोन। ख) मात्रात्मक परिणाम। परिणाम मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत किए गए थे । हर ग्रुप से कम से कम 15 दिलों की जांच की गई। EOM: 5 मिलीग्राम/एल पर EOM; नैक: 0.25 माइक्रोनएम पर एनएसी। **; पी < 0.01; ***; पी<0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हालांकि ज़ेब्राफ़िश पर्यावरणीय रसायनों की हृदय विकासात्मक विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट कशेरुकी मॉडल है, भ्रूण हृदय के छोटे आकार के कारण, पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन प्राप्त करना मुश्किल है। इसलिए, हम पीएम2.5के संपर्क में आने वाले जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में डीएनए क्षति बायोमार्कर के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक संवेदनशील इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि प्रस्तुत करते हैं।
विच्छेदन के दौरान, दिल की अखंडता को बरकरार रखना महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव में, 72 एचपीएफ में अलगाव करना अपेक्षाकृत आसान है। इसके अलावा, संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके दिल को फिक्सेशन समाधान में लगाने की आवश्यकता है। एक और महत्वपूर्ण कदम नमूनों को सुखाने के लिए सुनिश्चित करें कि विच्छेदित दिल पूरी तरह से कांच स्लाइड से जुड़े हुए हैं । अन्यथा, लेबलिंग के दौरान नमूनों को स्लाइड से धोया जा सकता है।
अलग-थलग दिलों में 8-ओएचडीजी और γH2AX संकेतों दोनों का पता लगाने के लिए दोहरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला किया जाता है। यह विधि न केवल श्रम बचाती है और कम नमूना आकार के उपयोग की अनुमति देती है, बल्कि दो संकेतों के सह-स्थानीयकरण की सुविधा भी प्रदान करती है। हालांकि इस एंटीबॉडी आधारित विधि जीवित भ्रूण में फ्लोरेसेंस संकेतों का पता नहीं लगा सकते हैं, इस तेजी से प्रोटोकॉल अलग जेब्राफिश भ्रूण दिलों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
अक्सर यह बताया जाता रहा है कि ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस पीएम2.5प्रेरित डीएनए क्षति8,9मध्यस्थता करता है । अत्यधिक आरओएस उत्पादन से जेब्राफिश भ्रूणीय विकास21 , 22,23केदौरानडीएनए क्षति और एपोप्टोसिस हो सकता है । जैसा कि हमने पहले18की सूचना दी है, एक बढ़ी हुई 8-OHdG और γH2AX संकेत अभिव्यक्ति EOM के संपर्क में जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में मनाया जाता है, जिनमें से अभिव्यक्ति काफी ROS मेहतर एनएसी के साथ उपचार के द्वारा प्रतिक्रिया कर रहे हैं । यह उल्लेखनीय है कि एनएसी पूरी तरह से पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति संकेत अभिव्यक्ति रिवर्स नहीं है, यह दर्शाता है कि ऑक्सीडेटिव तनाव केवल पीएम२.५के संपर्क में जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में मनाया डीएनए क्षति के लिए आंशिक रूप से योगदान कर सकते हैं ।
अंत में, इस विधि ज़ेब्राफिश भ्रूण के बरकरार दिलों में पीएम२.५ प्रेरित डीएनए क्षति का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तकनीक का उपयोग करता है । इसके अलावा, अन्य पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में आने वाले जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का पता लगाने के लिए विधि लागू की जा सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल नेचर साइंसेज फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर: 81870239, 81741005, 81972999) और जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों की प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम विकास द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
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