Summary
Denne protokollen bruker en immunfluorescensanalyse for å oppdage PM2,5-indusertDNA-skade i dissekerte hjerter av sebrafiskembryoer.
Abstract
Omgivende fint svevestøv (PM2.5) eksponering kan føre til hjerteutviklingstoksisitet, men de underliggende molekylære mekanismene er fortsatt uklare. 8-hydroksy-2'deoksygenase (8-OHdG) er en markør for oksidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. I denne studien hadde vi som mål å oppdage PM2,5-induserte8-OHdG- og γH2AX-endringer i hjertet av sebrafiskembryoer ved hjelp av en immunfluorescensanalyse. Sebrafiskembryoer ble behandlet med ekstraherbare organiske stoffer (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær av antioksidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timers etterbefruktning (hpf). DMSO ble brukt som kjøretøykontroll. Ved 72 hkf ble hjerter dissekert fra embryoer ved hjelp av en sprøytenål og festet og permeabilisert. Etter å ha blitt blokkert, ble prøver undersøkt med primære antistoffer mot 8-OHdG og γH2AX. Prøver ble deretter vasket og inkubert med sekundære antistoffer. De resulterende bildene ble observert under fluorescensmikroskopi og kvantifisert ved hjelp av ImageJ. Resultatene viser at EOM fra PM2,5 signifikant forbedret 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet av sebrafiskembryoer. Nac, som fungerer som en reaktiv oksygenart (ROS) scavenger, motvirket imidlertid delvis den EOM-induserte DNA-skaden. Her presenterer vi en immunfluorescence protokoll for å undersøke rollen som DNA-skade i PM2.5-induserte hjertefeil som kan brukes på påvisning av miljøkjemisk-indusert protein uttrykk endringer i hjertene til sebrafisk embryoer.
Introduction
Luftforurensning er nå et alvorlig miljøproblem verden står overfor. Omgivende fint svevestøv (PM2.5), som er en av de viktigste indikatorene for luftkvalitet, kan bære et stort antall skadelige stoffer og komme inn i blodsirkulasjonssystemet, noe som forårsaker alvorlig skade på menneskers helse1. Epidemiologi studier har vist at PM2.5 eksponering kan føre til økt risiko for medfødte hjertefeil (CHDs)2,3. Bevis fra dyreforsøk viste også at PM2.5 kan forårsake unormal hjerteutvikling i sebrafiskembryoer og avkom av mus, men de molekylære mekanismene for hjerteutviklingstoksisiteten til PM2.5 er fortsatt stort sett ukjent4,5,6.
DNA-skade kan forårsake cellesyklusstans og indusere apoptose, noe som i stor grad kan ødelegge potensialet til stamceller og dermed svekkehjerteutviklingen 7). Det er godt dokumentert at miljøgifter, inkludert PM2.5, har potensial til å angripe DNA gjennom oksidative stressmekanismer8,9. Både menneskelig og sebrafisk hjerteutvikling er følsom for oksidativt stress10,11,12. 8-OHdG er en oksidativ DNA-skademarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk forløper for intracellulær cystein og glutathione, er mye brukt som en antioksidantforbindelse. I denne studien bruker vi NAC til å undersøke rollen som oksidativt stress i PM2.5- indusert DNA-skade13.
Sebrafisk som modell vertebrat har blitt mye brukt til å studere hjerteutvikling og menneskelige kardiovaskulære sykdommer fordi mekanismer for hjerteutvikling er høyt bevart blant vertebrater14,15. Fordelene ved å bruke sebrafisk som modell inkluderer deres lille størrelse, sterke reproduktive evne og lave fôringskostnader. Av spesiell interesse for disse studiene er sebrafisk embryoer ikke avhengige av sirkulasjonssystemet under tidlig utvikling og kan overleve alvorlighjertefeildannelse 14. Videre tillater deres gjennomsiktighet hele kroppen å bli direkte observert under et mikroskop. Dermed gir sebrafiskembryoer en enestående mulighet til å vurdere molekylære mekanismer som er involvert i induksjon av hjerteutviklingstoksisitet som følge av eksponering for ulike miljøkjemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapportert at PM2,5-indusertoksidativt stress fører til DNA-skade og apoptose, noe som resulterer i hjerte misdannelser i sebrafisk18. I denne studien gir vi en detaljert protokoll for undersøkelse av PM2,5-indusertDNA-skade i hjertet av sebrafiskembryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vill type sebrafisk (AB) som ble brukt i denne studien ble hentet fra National Zebrafish Resource Center i Wuhan, Kina. Alle dyreprosedyrer som er skissert her, er gjennomgått og godkjent av Dyrepleieinstitusjonen ved Etikkutvalget ved Soochow University.
1. PM2.5 prøvetaking og organisk sammensatt ekstraksjon
MERK: PM2.5 ble samlet inn i et urbant område i Suzhou, Kina, 1-7 august 2015, som beskrevet tidligere5.
- Stek 47 mm kvartsmembranfiltre i en 500 °C muffelovn i 2 timer for å fjerne de organiske komponentene.
- Plasser et filter i en PM2.5-prøvetaker i 24 timer uavbrutt prøvetaking.
- Fjern filteret og tørk i 24 timer ved romtemperatur.
- Kvantifisere filteret med en analytisk balanse.
- Trekk ut organiske komponenter fra filteret ved Soxhlet ekstraksjon ved hjelp av dichloromethane som et løsningsmiddel19.
- Tørk EOM ved en roterende fordampning i et 60 °C vannbad og nitrogenstrøm. Løs opp EOM i DMSO og oppbevar ved -20 °C.
2. Zebrafish embryo innsamling og behandling
- Vedlikehold sebrafisken ved 28,5 ± 0,5 °C i et re-sirkulerende akvakultursystem med 14 timers lys og 10 timers mørk fotoperiodsyklus.
- Plasser sunn voksen sebrafisk i en tank med et forhold mellom 2:1 mann og kvinne.
- Neste dag samler du embryoene og vasker dem med systemvann (dvs. sebrafiskavl).
- Velg og del sebrafiskembryoer tilfeldig som demonstrerer en normal utvikling (jevn størrelse, fullkorn og ingen eggkoagulasjon) i 4 grupper i individuelle glass Petri-retter med en diameter på 7 cm (ca. 50 embryoer per tallerken).
- Behandle embryoene med PM2,5 (5 mg/l) i nærvær eller fravær av NAC ved 0,25 μM fra 2 hkf til 72 hkf. Bruk DMSO som en kjøretøykontroll til en endelig konsentrasjon på 0,1% (v / v).
3. Morfologisk observasjon av sebrafiskembryoer og hjerte disseksjon
- Ved 72 hkf overfører du embryoer til glasssklier og observerer under et stereomikroskop. Registrer hjertefeil, for eksempel perikardødem, endret løkke og redusert størrelse.
- Beregn misdannelsesrater (prosentandelen embryoer med hjertefeil ut av de totale levende embryoene) og analyser forskjeller mellom grupper ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tyrkias Multiple Comparison Test (p < 0,05 = statistisk signifikant).
- Bedøv embryoene med 0,6 mg/ml MS-222 for å immobilisere dem på glasssklier.
- Registrer hjerteslag for 30 s og kvantifiser hjertefrekvensen ved hjelp av ImageJ-programvare5,20.
- Disseker hjerter fra sebrafiskembryoer med en engangs sprøytenål under et stereomikroskop. Forsiktig: Unngå å ødelegge hjerteformen.
4. Immunfluorescence Analyse
- For å bruke en immunfluorescensanalyse for å oppdage PM2,5 indusert DNA-skade i hjertet av sebrafiskembryoer, bruk en hydrofob barrierepenn for å tegne en sirkel på en ren glassside.
- Tilsett 50 μL 4% paraformaldehyd til 1,25 ml fosfatbufret saltvann (PBS) for å lage en fikseringsløsning.
- Plasser 3 dissekerte hjerter i en hydrofob barrierepennsirkel og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- Dekanter løsningen under mikroskopet og tørk prøvene ved romtemperatur i minst 5 min, slik at hjertene helt festes til glasssklier.
- Vask lysbildene tre ganger i PBS med 0,1 % Tween 20 (PBST) i 5 minutter per vask.
- Tilsett 50 μL bovint serumalbumin (BSA) til 1000 μL PBST for å oppnå en 5% BSA-løsning og inkuber lysbildene i et fuktig kammer i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding.
- Dekanter oppløsningen og vask prøvene tre ganger med PBST i 5 min per vask.
- Fortynn 2 μL musmonoklonalt antistoff mot 8-OHdG og 2 μL kaninpolyklonalt antistoff mot γH2AX i 296 μL PBST for å oppnå en fungerende primær antistoffcocktailløsning.
- Inkuber hjerteprøvene med 50 μL av den primære antistoffcocktailløsningen mot 8-OHdG og γH2AX i et fuktet kammer i minst en time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C (inkubasjon over natten kan øke signalintensiteten).
- Dekanter oppløsningen og vask prøvene tre ganger med PBST i 5 min per vask.
- Fortynn 1 μL FITC-merket geit antimus sekundært antistoff og 1 μL cy3 geit anti-kanin sekundært antistoff i 498 μL PBST for å oppnå en fungerende sekundær antistoffcocktailløsning og inkubere prøvene med sekundære antistoffer (1:500 i PBST) i 1 time ved romtemperatur i mørket.
- Dekanter oppløsningen og vask prøvene tre ganger med PBS i 5 minutter per vask beskyttet mot lys.
- Tilsett 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole) til prøvene for kjernefysisk farging i 30 minutter ved romtemperatur.
- Påfør en dekslelip for å skyve og forsegle med neglelakk for å forhindre tørking og bevegelse. Deretter kan du se for deg prøvene under et fluorescensmikroskop og kvantifisere fluorescenssignalet til hjerteområdet ved hjelp av ImageJ-programvare. Beregn de relative endringene med gjennomsnittet av DMSO-kontrolleksempler. Bestemme dataenes statistiske signifikans som i trinn 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne immunfluorescensanalysen er en sensitiv og spesifikk metode for måling av proteinuttrykksendringer i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for miljøkjemikalier.
I denne representative analysen ble embryoer utsatt for PM2.5 i fravær eller tilstedeværelse av antioksidanten NAC evaluert for tilstedeværelsen av hjertefeil (figur 1). Som observert forårsaket EOM fra PM2.5 en betydelig økning i hjerteteatogenese, for eksempel perikardødem, endret looping og redusert størrelse, sammenlignet med DMSO kontrollbehandlede hjerter. Hjerterytmen ble også signifikant redusert i embryoer eksponert for EOM (figur 1B). Tilsetningen av NAC betydelig svekket EOM-induserte hjertefeil (figur 1).
Her ble immunfluorescensanalysen brukt til å måle 8-OHdG- og γH2AX-uttrykk i sebrafiskembryo for å evaluere omfanget av DNA-skade i EOM-behandlet vev. Som vist i figur 2ble nivåene av 8-OHdG- og γH2AX-uttrykk betydelig økt i hjertene til sebrafiskembryoer behandlet med EOM-gruppen sammenlignet med kontrollen, DMSO-behandlede hjerter, noe som indikerer en økning i henholdsvis oksidativ DNA-skade og DNA-dobbeltstrengbrudd. Videre ble den EOM-induserte DNA-skaden delvis motvirket av NAC-tilskudd (figur 2).
Figur 1. Hjertefeil av sebrafisk embryoer ved 72 hkf. (A) Bilder av sebrafiskembryoer ved 72 hkf. Stiplede linjer angir atria (rød) eller ventrikler (blå). Skalastang, 200 μm. (B) Hjerte misdannelse og hjerterytme. Resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Minst 50 embryoer i hver gruppe ble undersøkt. EOM: EOM ved 5 mg/l; NAC: NAC ved 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. DNA-skade i hjertet av sebrafiskembryoer ved 72 hkf. A) Immunfluorescensfarging. Skalastang, 100 μm. B) Kvantitative resultater. Resultatene ble presentert som gjennomsnittlige ± SEM. Minst 15 hjerter fra hver gruppe ble undersøkt. EOM: EOM ved 5 mg/l; NAC: NAC ved 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; p<0.001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om sebrafisk er en utmerket virveldyrmodell for å studere hjerteutviklingstoksisiteten til miljøkjemikalier, på grunn av den lille størrelsen på embryohjertet, er det vanskelig å skaffe nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor presenterer vi en sensitiv immunfluorescensmetode for å kvantifisere proteinuttrykksnivåene av DNA-skadebiomarkører i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for PM2.5.
Under disseksjonen er det viktig å holde hjertets integritet intakt. Vår erfaring er at det er relativt enkelt å utføre isolasjonen på 72 hkf. I tillegg må hjertet settes i fikseringsløsning så snart som mulig etter innsamling. Et annet kritisk skritt er å tørke prøvene for å sikre at de dissekerte hjertene er helt festet til glasssklie. Ellers kan prøvene vaskes av fra lysbildet under merking.
Dobbelt immunfluorescensfarging utføres for å oppdage både 8-OHdG- og γH2AX-signaler i de isolerte hjertene. Denne metoden sparer ikke bare arbeidskraft og tillater bruk av redusert utvalgsstørrelse, men letter også samlokalisering av de to signalene. Selv om denne antistoffbaserte metoden ikke kan oppdage fluorescenssignaler i levende embryoer, kan denne raske protokollen brukes til å oppdage proteinuttrykk i isolerte sebrafisk embryohjerter.
Det har ofte blitt rapportert at oksidativt stress formidler PM2,5-indusert DNA-skade8,9. Overdreven ROS-produksjon kan føre til DNA-skade og apoptose under sebrafisk embryonal utvikling21,22,23. Som vi tidligere har rapportert18, observeres et økt 8-OHdG- og γH2AX-signaluttrykk i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for EOM, hvis uttrykk motvirkes betydelig ved behandling med ROS-scavenger NAC. Det er bemerkelsesverdig at NAC ikke helt reverserer PM2.5-indusert DNA-skadesignaluttrykk, noe som indikerer at oksidativt stress bare kan bidra delvis til DNA-skaden som observeres i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for PM2.5.
Til slutt bruker denne metoden en sensitiv teknikk for å oppdage PM2.5 indusert DNA-skade i de intakte hjertene til sebrafiskembryoer. I tillegg kan metoden brukes til å oppdage proteinuttrykksendringer i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for andre miljøkjemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Nature Sciences Foundation of China (Grant number: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
