Summary
Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.
Abstract
L’exposition aux particules fines ambiantes (PM2,5)peut entraîner une toxicité pour le développement cardiaque, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas encore clairs. La 8-hydroxy-2'désoxygénase (8-OHdG) est un marqueur des dommages oxydatifs à l’ADN et γH2AX est un marqueur sensible pour les cassures double brin de l’ADN. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter les changements 8-OHdG etγH2AXinduits par les PM 2,5 au cœur des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un test d’immunofluorescence. Les embryons de poisson-zèbre ont été traités avec des matières organiques extractibles (EOM) de PM2,5 à 5 μg/mL en présence ou en l’absence d’antioxydant n-acétyl-L-cystéine (NAC, 0,25 μM) à 2 h après la fécondation (HPF). Le DMSO a été utilisé comme contrôle du véhicule. À 72 hpf, les cœurs ont été disséqués à partir d’embryons à l’aide d’une aiguille de seringue et fixés et perméabilisés. Après avoir été bloqués, les échantillons ont été sondés avec des anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX. Les échantillons ont ensuite été lavés et incubés avec des anticorps secondaires. Les images résultantes ont été observées en microscopie à fluorescence et quantifiées à l’aide d’ImageJ. Les résultats montrent que la MOE des PM2,5 a significativement amélioré les signaux 8-OHdG et γH2AX au cœur des embryons de poissons-zèbres. Cependant, le NAC, agissant comme un piégeur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), a partiellement contrecarré les dommages à l’ADN induits par la MOE. Ici, nous présentons un protocole d’immunofluorescence pour étudier le rôle des dommages à l’ADN dans les malformations cardiaques induites par les PM2,5qui peuvent être appliqués à la détection des changements d’expression protéique induits par des produits chimiques environnementaux dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.
Introduction
La pollution de l’air est aujourd’hui un grave problème environnemental auquel le monde est confronté. Les particules fines ambiantes (PM2,5),qui sont l’un des indicateurs les plus importants de la qualité de l’air, peuvent transporter un grand nombre de substances nocives et pénétrer dans le système circulatoire sanguin, causant de graves dommages à la santé humaine1. Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux PM2,5 peut entraîner un risque accru de malformations cardiaques congénitales (CHD)2,3. Les preuves provenant d’expériences animales ont également montré que les PM2,5 peuvent provoquer un développement cardiaque anormal chez les embryons de poisson-zèbre et la progéniture de souris, mais les mécanismes moléculaires de la toxicité pour le développement cardiaque des PM2,5 sont encore largement inconnus4,5,6.
Les dommages à l’ADN peuvent provoquer l’arrêt du cycle cellulaire et induire l’apoptose, ce qui peut détruire considérablement le potentiel des cellules progénitaires et, par conséquent, nuire au développement cardiaque7). Il a été bien documenté que les polluants environnementaux, y compris les PM2,5,ont le potentiel d’attaquer l’ADN par des mécanismes de stress oxydatif8,9. Le développement cardiaque humain et le poisson-zèbre sont sensibles au stress oxydatif10,11,12. Le 8-OHdG est un marqueur oxydatif de dommages à l’ADN, et le signal γH2AX est un marqueur des cassures double brin de l’ADN. La N-acétyl-L-cystéine (NAC), un précurseur synthétique de la cystéine intracellulaire et du glutathion, est largement utilisée comme composé antioxydant. Dans cette étude, nous utilisons le NAC pour étudier le rôle du stress oxydatif dans les dommages à l’ADN induits par les PM2,513.
Le poisson-zèbre en tant que vertébré modèle a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque et les maladies cardiovasculaires humaines, car les mécanismes du développement cardiaque sont très conservés chez les vertébrés14,15. Les avantages de l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle comprennent leur petite taille, leur forte capacité de reproduction et leur faible coût d’alimentation. D’un intérêt particulier pour ces études, les embryons de poisson zèbre ne dépendent pas du système circulatoire au cours du développement précoce et peuvent survivre à une malformation cardiaque grave14. De plus, leur transparence permet d’observer directement l’ensemble du corps au microscope. Ainsi, les embryons de poisson zèbre offrent une occasion exceptionnelle d’évaluer les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de la toxicité pour le développement cardiaque à la suite de l’exposition à divers produits chimiquesenvironnementaux 5,16,17. Nous avons précédemment rapporté que le stress oxydatif induit par les PM2,5entraîne des dommages à l’ADN et l’apoptose, entraînant des malformations cardiaques chez le poisson-zèbre18. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.
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Protocol
Le poisson-zèbre de type sauvage (AB) utilisé dans cette étude a été obtenu auprès du National Zebrafish Resource Center de Wuhan, en Chine. Toutes les procédures animales décrites ici ont été examinées et approuvées par l’Établissement de soins aux animaux du Comité d’éthique de l’Université Soochow.
1. Échantillonnage des PM2,5 et extraction des composés organiques
REMARQUE : Les PM2,5 ont été collectées dans une zone urbaine à Suzhou, en Chine, du 1er au 7 août 2015, comme décrit précédemment5.
- Cuire des filtres à membrane de quartz de 47 mm dans un four à moufle à 500 °C pendant 2 h pour éliminer les composants organiques.
- Placez un filtre dans un échantillonneur PM2,5 pour 24 h d’échantillonnage ininterrompu.
- Retirez le filtre et séchez-le pendant 24 h à température ambiante.
- Quantifiez le filtre avec une balance analytique.
- Extraire les composants organiques du filtre par extraction Soxhlet en utilisant le dichlorométhane comme solvant19.
- Sécher la MOE par évaporation rotative dans un bain-marie à 60 °C et un flux d’azote. Dissoudre la MOE dans le DMSO et conserver à -20 °C.
2. Collecte et traitement des embryons de poisson-zèbre
- Maintenir le poisson-zèbre à 28,5 ± 0,5 °C dans un système d’aquaculture à recirculation avec un cycle de photopériode clair de 14 h et de photopériode sombre de 10 h.
- Placez le poisson-zèbre adulte en bonne santé dans un aquarium à un ratio mâle/femelle de 2:1.
- Le lendemain, recueillez les embryons et lavez-les avec de l’eau du système (c.-à-d. de l’eau de reproduction du poisson-zèbre).
- Sélectionnez et divisez au hasard les embryons de poisson zèbre démontrant un développement normal (taille uniforme, grains pleins et pas de coagulation des œufs) en 4 groupes dans des boîtes de Petri en verre individuelles d’un diamètre de 7 cm (environ 50 embryons par plat).
- Traiter les embryons avec des PM2,5 (5 mg/L) en présence ou en l’absence de NAC à 0,25 μM de 2 hpf à 72 hpf. Utiliser le DMSO comme témoin du véhicule jusqu’à une concentration finale à 0,1 % (v/v).
3. Observation morphologique des embryons de poisson zèbre et dissection cardiaque
- À 72 hpf, transférez les embryons sur des lames de verre et observez-les au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, la modification de l’anse et la diminution de la taille.
- Calculer les taux de malformation (le pourcentage d’embryons atteints de malformations cardiaques par rapport au total des embryons vivants) et analyser les différences entre les groupes en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de la Turquie (p < 0,05 = statistiquement significatif).
- Anesthésier les embryons avec 0,6 mg/mL de MS-222 pour les immobiliser sur des lames de verre.
- Enregistrez les battements cardiaques pendant 30 s et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel ImageJ5,20.
- Disséquez les cœurs d’embryons de poisson zèbre avec une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Attention : Évitez de détruire la forme du cœur.
4. Dosage d’immunofluorescence
- Pour utiliser un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5 dans le cœur des embryons de poisson-zèbre, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur un côté en verre propre.
- Ajouter 50 μL de paraformaldéhyde à 4 % à 1,25 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour en faire une solution fixative.
- Placez 3 cœurs disséqués dans un cercle de stylo barrière hydrophobe et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.
- Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins 5 minutes, de sorte que les cœurs se fixent complètement aux lames de verre.
- Lavez les lames trois fois en PBS avec 0,1% Tween 20 (PBST) pendant 5 min par lavage.
- Ajouter 50 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1000 μL de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5% et incuber les lames dans une chambre humide pendant 1 h pour bloquer la liaison aux anticorps non spécifiques.
- Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage.
- Diluer 2 μL d’anticorps monoclonal de souris contre le 8-OHdG et 2 μL d’anticorps polyclonaux de lapin contre l’γH2AX dans 296 μL de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.
- Incuber les échantillons cardiaques avec 50 μL de la solution cocktail d’anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C (l’incubation pendant la nuit peut augmenter l’intensité du signal).
- Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage.
- Diluer 1 μL d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué FITC et 1 μL d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre cy3 dans 498 μL de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle et incuber les échantillons avec les anticorps secondaires (1:500 dans PBST) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
- Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 5 min par lavage à l’abri de la lumière.
- Ajouter 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) aux échantillons pour la coloration nucléaire pendant 30 min à température ambiante.
- Appliquez un couvercle pour glisser et scellez avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et le mouvement. Ensuite, imagez les échantillons sous un microscope à fluorescence et quantifiez le signal de fluorescence de la région cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculez les changements relatifs avec la moyenne des échantillons de contrôle DMSO. Déterminer la signification statistique des données comme à l’étape 3.2.
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Representative Results
Ce test d’immunofluorescence est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements d’expression des protéines dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés à des produits chimiques environnementaux.
Dans cette analyse représentative, les embryons exposés aux PM2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant NAC ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques (Figure 1). Comme observé, l’EOM des PM2,5 a provoqué une augmentation significative de la tératogenèse cardiaque, telle qu’un œdème péricardique, une altération des boucles et une diminution de la taille, par rapport aux cœurs traités par le contrôle du DMSO. Le rythme cardiaque a également diminué de manière significative chez les embryons exposés à la MOE(Figure 1B). L’ajout de NAC a significativement atténué les malformations cardiaques induites par l’EOM (Figure 1).
Ici, le test d’immunofluorescence a été utilisé pour mesurer l’expression de 8-OHdG et γH2AX dans l’embryon de poisson zèbre afin d’évaluer l’étendue des dommages à l’ADN dans les tissus traités par EOM. Comme le montre la figure 2,les niveaux d’expression de 8-OHdG et de γH2AX ont été significativement augmentés dans les cœurs d’embryons de poisson-zèbre traités avec le groupe EOM par rapport au groupe témoin, traités par DMSO, indiquant une augmentation des dommages oxydatifs à l’ADN et des cassures double brin de l’ADN, respectivement. De plus, les dommages à l’ADN induits par la MOE ont été partiellement contrecarrés par la supplémentation en NAC (Figure 2).
Graphique 1. Malformations cardiaques des embryons de poisson zèbre à 72 hpf. (A) Images d’embryons de poisson zèbre à 72 hpf. Les lignes pointillées indiquent les oreillettes (rouges) ou les ventricules (bleus). Barre d’échelle, 200 μm. (B) Malformation cardiaque et rythme cardiaque. Les résultats sont présentés comme des ± moyennes sem. Au moins 50 embryons de chaque groupe ont été examinés. MOE : MOE à 5 mg/L; NAC : NAC à 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Dommages à l’ADN dans le cœur des embryons de poisson zèbre à 72 hpf. A) Coloration par immunofluorescence. Barre d’échelle, 100 μm. B) Résultats quantitatifs. Les résultats ont été présentés comme des ± SEM moyens. Au moins 15 cœurs de chaque groupe ont été examinés. MOE : MOE à 5 mg/L; NAC : NAC à 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; p<0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que le poisson-zèbre soit un excellent modèle de vertébrés pour étudier la toxicité pour le développement cardiaque des produits chimiques environnementaux, en raison de la petite taille du cœur embryonnaire, il est difficile d’obtenir suffisamment de protéines pour l’analyse par transfert de Western. Par conséquent, nous présentons une méthode d’immunofluorescence sensible pour quantifier les niveaux d’expression protéique des biomarqueurs de dommages à l’ADN dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés aux PM2,5.
Pendant la dissection, il est important de garder l’intégrité du cœur intacte. D’après notre expérience, il est relativement facile d’effectuer l’isolation à 72 chf. De plus, le cœur doit être mis en solution de fixation dès que possible après la collecte. Une autre étape critique consiste à sécher les échantillons pour s’assurer que les cœurs disséqués sont complètement attachés à la lame de verre. Sinon, les échantillons peuvent être lavés de la lame pendant l’étiquetage.
Une double coloration par immunofluorescence est effectuée pour détecter les signaux 8-OHdG et γH2AX dans les cœurs isolés. Cette méthode permet non seulement d’économiser de la main-d’œuvre et d’utiliser une taille d’échantillon réduite, mais facilite également la colocalisation des deux signaux. Bien que cette méthode à base d’anticorps ne puisse pas détecter les signaux de fluorescence chez les embryons vivants, ce protocole rapide peut être utilisé pour détecter l’expression des protéines dans les cœurs embryonnaires isolés de poissons-zèbres.
Il a été fréquemment rapporté que le stress oxydatif médie les dommages à l’ADN induits par les PM2,58,9. Une production excessive de ROS peut entraîner des dommages à l’ADN et l’apoptose au cours du développement embryonnaire du poisson-zèbre21,22,23. Comme nous l’avons signalé précédemment18, une augmentation de l’expression du signal 8-OHdG et γH2AX est observée dans le cœur des embryons de poisson zèbre exposés à l’EOM, dont les expressions sont significativement contrecarrées par le traitement par le piégeur de ROS NAC. Il est à noter que le NAC n’inverse pas complètement l’expression du signal de dommages à l’ADN induits par les PM2,5,ce qui indique que le stress oxydatif ne peut contribuer que partiellement aux dommages à l’ADN observés dans le cœur des embryons de poissons-zèbres exposés aux PM2,5.
En conclusion, cette méthode utilise une technique sensible pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5 dans les cœurs intacts des embryons de poisson-zèbre. En outre, la méthode peut être appliquée pour détecter les changements d’expression des protéines dans le cœur des embryons de poisson zèbre exposés à d’autres produits chimiques environnementaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (numéro de subvention: 81870239, 81741005, 81972999) et le développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
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