Summary
هذا البروتوكول تفاصيل تقنية لإزالة دماغ الخنزير في مجملها وتشريح العديد من مناطق الدماغ درس عادة في علم الأعصاب.
Abstract
وقد تم توثيق وقبول استخدام الخنزير كنموذج حيواني قبل السريرية والترجمة بشكل جيد من قبل مجالات البحث التي تحقق في أنظمة القلب والأوعية الدموية ، وأنظمة الجهاز الهضمي ، والتغذية ، ويتم استخدام الخنزير بشكل متزايد كنموذج حيواني كبير في علم الأعصاب. وعلاوة على ذلك، الخنزير هو نموذج مقبول لدراسة النمو العصبي لأنه يعرض نمو الدماغ وأنماط التنمية مماثلة لما يحدث في البشر. كنموذج حيواني أقل شيوعا في علم الأعصاب ، قد لا تكون الإجراءات الجراحية والتشريح على الخنازير مألوفة أو تمارس بشكل جيد بين الباحثين. لذلك ، قد يكون البروتوكول البصري الموحد الذي يفصل طرق الاستخراج والتشريح المتسقة قيما للباحثين الذين يعملون مع الخنزير. يعرض الفيديو التالي تقنية لإزالة دماغ الخنزير مع الحفاظ على القشرة و جذع الدماغ سليمين ويستعرض طرق تشريح العديد من مناطق الدماغ التي يتم التحقيق فيها بشكل شائع بما في ذلك جذع الدماغ والمخيخ ومنتصف الدماغ وفرس النهر والمرحلة والمهاد والقشرة الجبهية الوسطى. الغرض من هذا الفيديو هو تزويد الباحثين بالأدوات والمعرفة اللازمة لإجراء عملية استخراج الدماغ وتشريحه باستمرار على الخنزير البالغ من العمر أربعة أسابيع.
Introduction
وقد تم توثيق الخنازير بشكل جيد وقبلت كنموذج حيواني قابل للترجمة للأبحاث فيأنظمةالقلب والأوعية الدموية 1 ، نظم الجهاز الهضمي2، التغذية3،4، السكري5،السموم 6، والتقنيات الجراحية7. استخدام الخنزير في علم الأعصاب هو بداية لزيادة، كما PubMed البحث عن الكلمات الرئيسية نموذج الدماغ الخنازير يؤدي إلى أربع مرات أكثر النتائج من 1996-2005 من فترة السنوات ال 10 السابقة8،وحتى المزيد من النتائج في الوقت الحاضر. السبب الرئيسي الذي يجعل شعبية نموذج الخنزير آخذة في التوسع يرجع إلى أوجه التشابه في النمو والهيكل ووظيفة الدماغ بالمقارنة مع البشر. بالمقارنة مع الدماغ البشري ، يعرض دماغ الخنزير نمطا جيراليا مماثلا ، والأوعية الدموية وتوزيع المادة الرمادية والبيضاء9. وعلاوة على ذلك، تم استخدام دماغ الخنزير في إجراءات التصوير العصبي، أثار التسجيل المحتملة، وفي إنشاء تقنيات جراحة الأعصاب8،9. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى ، ومع ذلك ، فإن الخنازير والإنسان تجربة نمو الدماغ في الفترة المحيطة بالولادة طفرات ، بدلا من طفرات النمو قبل أو بعد الولادة. عند الولادة، يزن دماغ الإنسان والخنزير ما يقرب من 27 و 25 في المئة من وزن دماغهما البالغ، على التوالي، مقارنة بأدمغة الفئران التي تزن 12 في المئة من وزن دماغها البالغ ومخ ريسوس بنسبة 76 في المئة من وزن البالغين10.
أحد أسباب اعتماد الخنزير ببطء كنموذج حيواني لعلم الأعصاب هو أن العديد من الباحثين غير معتادين على الحيوان في هذا السياق. قد لا يكون الباحثون على علم باستخداماته المحتملة في هذا المجال أو قد لا يعرفون التقنيات المناسبة المطلوبة لاستخدام مثل هذا النموذج. كما استخدام الخنزير كنموذج الطب الحيوي وقبل السريرية تكتسب الاهتمام والاستخدام في علم الأعصاب، فمن الضروري وضع إجراءات موحدة لإزالة الأنسجة لضمان مقارنة دقيقة للبيانات عبر الدراسات. على الرغم من تشريح والتقنيات الجراحية التي تنطوي على دماغ الخنزير قد نشرت في مكان آخر11،12،13، هناك حاجة لبروتوكولات بسيطة وموحدة لجمع أنسجة الدماغ الخنزير ، وخاصة للاستخدام في المقايسات الكيميائية الحيوية. على هذا النحو ، فإن الهدف من هذا الفيديو هو توفير المعرفة اللازمة للسماح للباحثين بإجراء استخراج الدماغ الموحد وتشريحه. يوضح هذا الفيديو تقنية واحدة مناسبة لإزالة دماغ الخنزير مع الحفاظ على القشرة و جذع الدماغ سليمين ، وبالتالي مراجعة طرق تشريح العديد من مناطق الدماغ الرئيسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات المتعلقة بمواضيع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين
ملاحظة: قبل القتل الرحيم، تم تخدير الخنزير عن طريق الحقن العضلي مع مزيج من التيلازول: الكيتامين: xylazine (50.0 ملغ من بلاط HCl بالإضافة إلى 50.0 ملغ من زولازيبام HCl إعادة تشكيلها مع 2.50 مل من الكيتامين HCl (100 غرام / لتر) و 2.50 مل من xylazine (100 غرام / لتر) وتدار في 0.06 ملغ / كغ BW). وبمجرد تخدير الخنزير، تم قتله عن طريق إعطاء بينتوباربيتال الصوديوم داخل القلب (390 ملغم/مل يعطى عند 1 مل/5 كجم بي دبليو). بالنسبة لتشريح الدماغ ، يوصى باختيار طريقة القتل الرحيم استنادا إلى الإجراء التحليلي المطلوب للأنسجة. طريقة القتل الرحيم يجب أن تسبب أقل قدر ممكن من الضرر للدماغ.
1. استخراج دماغ الخنزير
- بعد القتل الرحيم الإنساني، قطع رأس الخنزير عن طريق قطع فوق مؤخر الرقبة، بين الفقرة الأولى والثانية (أطلس والمحور، على التوالي).
- تأمين الرأس في مقعد مشلول فيس تعديل لتشمل المسامير. تأكد من أن الرأس معطل تماما قبل المتابعة.
- باستخدام مشرط، وجعل قطع القوس على طول خط الوسط من الجمجمة التي لا تزال إلى الجزء الخلفي من الرأس.
- جعل ثانية (عرضية) قطع على الجزء الخلفي من الرأس.
- جعل ثالث (عرضية) قطع على الطرف الخلفي من خطم وتمشيا مع العينين. قطع الجلد بعيدا عن الجمجمة قدر الإمكان لضمان سهولة الوصول إلى الجمجمة.
- باستخدام منشار العظام، وجعل اثنين من التخفيضات الأمامية إلى الخلفية الجانبية إلى خط الوسط، وتمتد من العينين إلى قمة انحناء الجمجمة. شطبة المنشار نحو خط الوسط وقطع عميقة بما يكفي لاختراق الجمجمة.
- كرر العملية المذكورة أعلاه على الجانبين المتعامدة ، وخلق مستطيلة "نافذة" في الجمجمة.
- باستخدام خطاف اللحم، نقب القسم مستطيلة من الجمجمة قبالة. تبدأ بوضع هوك في واحدة من زوايا القسم وتطبيق الضغط التصاعدي لتخفيف قطعة الجمجمة. الحرص على وضع خطاف اللحم فقط على مستوى الجمجمة لمنع اختراق أنسجة الدماغ عن غير قصد.
- إذا بقيت أي طبقات السحايا على الدماغ، استخدم ملقط ومقص حاد (أو بدلا من ذلك، مشرط) لإزالة الطبقات بلطف دون قطع في الدماغ.
- استخدام مشرط لقطع العضلات والدهون في الجزء الخلفي من الرأس، وفضح الجزء الخلفي من الجمجمة.
- جعل اثنين من القطع العرضية على طول الجزء الخلفي من الجمجمة. تأكد من عدم قطع في أنسجة الدماغ.
- تأمين الرأس عن طريق وضع يد ثابتة على خطم وتطبيق الضغط إلى الوراء لسحب الجزء الخلفي من الجمجمة قبالة، وفضح المخيخ.
- إزالة الرأس من نائب مقاعد البدلاء ومكان على حصيرة الجراحية.
- استخدام أداة طويلة نحيلة، مثل نهاية حادة من مشرط، لإزالة الدماغ. عكس الرأس واستخدام حركة مغرفة لطيف لاقناع الدماغ للخروج من تجويف الجمجمة دون الإضرار سطح الدماغ.
ملاحظة: سيكون من الضروري قطع الأعصاب القحفية لإزالة الدماغ. القيام بذلك بلطف ولا تحاول سحب الدماغ بقوة. سوف يسقط الدماغ من تلقاء نفسه عندما يكون منفصلا بشكل صحيح وكامل عن الجمجمة والعمود الفقري.
2. تشريح دماغ الخنزير
ملاحظة: قد يكون من المفيد استخدام أطلس الدماغ أو دليل تشريح الألياف14 كتمثيل مرئي أثناء إجراءات التشريح. تأكد من تخزين عينات الأنسجة المشرحة بشكل صحيح وفقا للاحتياجات الخاصة بالمشروع عند إزالة كل عينة (موضحة بمزيد من التفصيل أدناه). بالإضافة إلى ذلك، يرجى ملاحظة أنه لأغراض هذا الفيديو، تم تشريح جميع مناطق الدماغ المعروضة من نصف الكرة الأيمن، ولكن هذا قد يختلف حسب المختبر على أساس الأهداف التجريبية.
- لإزالة جذع الدماغ (في الغالب النخاعي) ، وجعل caudal قطع التاجية إلى المخيخ.
- لإزالة المخيخ، قم بإجراء قطع تاجي خلفي للقشرة. عزل المناطق المرغوبة (مثل الفيرميس والفلوكولوس وما إلى ذلك) من المخيخ عن هذه العينة. تأكد من عدم تضمين أي أجزاء من جذع الدماغ في هذه العينة.
- فصل نصفي الدماغ عن طريق جعل قطع منتصف القوس على طول الشق الطولي. جعل هذا القطع كحركة مستمرة لمنع التسبب في تلف القشرة.
- لإزالة الدماغ المتوسط، تشريح الكمية المطلوبة من الأنسجة البطنية فقط إلى كوليكولي متفوقة وأدنى.
- لإزالة قرن آمون, وضع نهاية حادة من مشرط في الجزء الخلفي من كالوسوم كوربوس ولفة بلطف قرن آمون, باستخدام "J" الحركة بدءا من الجزء الخلفي من كالوسوم الجسم; قرن فرس النهر بأكمله هو "على شكل حبة فول".
- المخطط (تظهر نواة caudate في المقام الأول) هي منطقة مخططة للمادة الرمادية والبيضاء أسفل كالوسوم الجسم والموجهات الأمامية إلى قرن آمون. شطب مشرط وإزالة هذه المنطقة، والكشف عن الأنسجة المخططة عند الإزالة.
- لإزالة قشرة الفص الجبهي الوسطي ، تشريح الأنسجة من الدوران الأمامي إلى كالوسوم الجسم ، وإزالة الجزء الأكثر توسطا من هذا القسم. يجب أن تبقى القشرة اليمنى بعد إزالة قشرة الفص الجبهي الوسطي.
- لإزالة المهاد، قم بإزالة الهيكل الشبيه بالمصباح في وسط سطح الدماغ الأوسط والوردية إلى الدماغ المتوسط. المهاد له شكل كروي وسوف تبدو أكثر قتامة قليلا من الأنسجة المحيطة بها.
3. تشريح ما بعد
- عند الانتهاء من تشريح، والحفاظ على عينات الأنسجة بشكل صحيح للتحليلات اللاحقة. سيؤدي إغفال هذه الخطوة إلى حدوث انحلال تلقائي وتدهور كبيرين في غضون أقل من 20 دقيقة.
- اترك كل منطقة دماغ سليمة في وقت التشريح إذا تم إجراء التحليلات الهيكلية ، أو فرم الأنسجة لإنشاء عينة أنسجة متجانسة قبل الحفظ. تشمل طرق الحفاظ على العينة الشائعة لأنسجة الدماغ الحفاظ على التبريد والتثبيت الكيميائي باستخدام عوامل الربطالمتقاطعة 15.
- بالنسبة إلى المقايسات القياسية للمختبر (مثل التعبير الجيني أو البروتيني)، اغمر في النيتروجين السائل أو المحاليل التي تعمل على تثبيت المواد الوراثية قبل التخزين طويل الأجل عند -80 درجة مئوية لتوفير طرق حفظ مريحة وفعالة من حيث التكلفة.
- إذا كان الحفاظ على بنية الأنسجة أولوية، فحافظ على أنسجة الدماغ من خلال طرق التثبيت التقليدية (على سبيل المثال، استخدام المثبتات المستندة إلى ألدهيد للبروتينات المتقاطعة)، إما بدون أو مع تغلغل الحيوان أو العضو ذي الأهمية قبل تشريح الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا القسم أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها بعد الاستخراج الصحيح وتشريح دماغ خنزير عمره 4 أسابيع. الشكل 1 يحدد شكل كل منطقة الدماغ لاستخدامها كدليل أثناء تشريح. جزء من جذع الدماغ قد تبقى في الجمجمة بعد إزالة المخيخ (الشكل 1B). يمكن إزالة هذا أثناء عزل المنطقة المطلوبة من المخيخ. يعرض الجدول 1 متوسط الوزن (متوسط ± خطأ قياسي للوسط) لكل منطقة من مناطق الدماغ التي تم تشريحها (n=5).
الشكل 1: استخراج دماغ الخنزير. الخطوط العريضة لمناطق الدماغ لاستخدامها كدليل أثناء التشريح. المناطق المعروضة هي من نصف الكرة الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قطر | الوزن (ز) | SEM |
| خنزير كامل* | 8.006 | 0.545 |
| جذع الدماغ | 0.829 | 0.132 |
| المخيخ | 5.929 | 0.137 |
| ميدبراين | 0.376 | 0.047 |
| قرن آمون | 0.500 | 0.051 |
| المخطط | 0.410 | 0.115 |
| المهاد | 0.476 | 0.120 |
| قشرة ما قبل الجبهية الوسطى | 0.459 | 0.122 |
| *الوزن المقدم ككيلوغرام |
الجدول 1: أوزان مناطق الدماغ. متوسط وزن دماغ الخنزير البالغ من العمر 4 أسابيع وكل منطقة دماغ تشريحية (n=5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم التقنيات الموصوفة هنا للخنازير حوالي 4 أسابيع من العمر. ومن الأهمية بمكان تنفيذ هذه الخطوات مباشرة بعد أن تم قتل الخنزير بطريقة إنسانية لضمان الحفاظ على سلامة بنية أنسجة الدماغ، وخاصة عند النظر في المقايسات الكيميائية الحيوية اللاحقة. من المفيد استخدام أطلس أو أدلة تشريحالألياف 16 عند تعلم التقنيات لأول مرة. من المستحسن أن يقوم المجرب بالعديد من عمليات استخراج الدماغ وتشريحه قبل الحصول على عينات لجمع البيانات. الخطوة الأكثر صعوبة هي إزالة الجمجمة. هذه الخطوة سوف تصبح أسهل مع الخبرة لأنها تتطلب إلى حد كبير الممارسة المباشرة لمعرفة أين على الجمجمة لالمنشار ومتى تم قطع الجمجمة من خلال. يشبه هذا الإجراء الإجراء الذي وصفه باسي وآخرون12، على الرغم من أنه لا يتطلب الحاجة إلى إنشاء نافذة قحف سداسية ويوفر تعليميا مرئيا لكيفية تنفيذ هذه التقنية.
وهناك قيود على هذه التقنية أنه عند العمل مع الخنازير الأكبر سنا، قد يستغرق المزيد من الوقت لإزالة الجمجمة لأنها تصبح أكثر سمكا بكثير مع التقدم في السن. إذا كان استخدام منشار شاقة جدا أو غير فعالة للجماجم سمكا، قد يكون من الضروري إما استخدام مطرقة وإزميل، مثل تلك التي أظهرتها Bjarkam وآخرون.13،أو المعدات الجراحية التي تعمل بالطاقة (على سبيل المثال، منشار العظام). وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية لا تضمن دائما التقاط المصابيح الشمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يعترفا بجيم كنوبلاوتش ومارتن بوث هودجز من كلية تكنولوجيا المعلومات والاتصالات في العلوم الزراعية والاستهلاكية والبيئية لخبرتهما في التصوير والتسجيل وتحرير الصوت والفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C. Swine in cardiovascular research. Laboratory Animal Science. 36 (4), 348-350 (1986).
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H. The minipig in general toxicology. Scandinavian Journal of Laboratory Animal Science. 25, 59-62 (1998).
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 311, 79-83 (1979).
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al. Stereotaxic atlas of the pig brain. Brain Research Bulletin. 49, 1 (1999).
