Summary
Detta protokoll beskriver tekniken för avlägsnande av grishjärnan i sin helhet och dissekering av flera hjärnregioner som ofta studeras i neurovetenskap.
Abstract
Användningen av grisen som en preklinisk och översättningsbar djurmodell har dokumenterats väl och accepterats av forskningsområden som undersöker kardiovaskulära system, gastrointestinala system och näring, och grisen används alltmer som en stor djurmodell inom neurovetenskap. Dessutom är grisen en accepterad modell för att studera neuroutveckling eftersom den visar hjärntillväxt och utvecklingsmönster som liknar vad som förekommer hos människor. Som en mindre vanlig djurmodell inom neurovetenskap kan kirurgiska och dissekeringsprocedurer på grisar inte vara lika välbekanta eller väl praktiserade bland forskare. Därför kan ett standardiserat visuellt protokoll som beskriver konsekventa extraktions- och dissekeringsmetoder visa sig vara värdefullt för forskare som arbetar med grisen. Följande video visar en teknik för att ta bort grishjärnan samtidigt som cortex och hjärnstammen förblir intakt och granskar metoder för att dissekera flera vanliga undersökta hjärnregioner inklusive hjärnstammen, lillhjärnan, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus och mediala prefrontala cortex. Syftet med denna video är att ge forskare de verktyg och den kunskap som krävs för att konsekvent utföra en hjärnutvinning och dissekering på den fyra veckor gamla grisen.
Introduction
Grisen har dokumenterats väl och accepterats som en översättningsbar djurmodell för forskning i kardiovaskulära system1,gastrointestinalasystem 2,näring 3,4,diabetes5,toxikologi6och kirurgiska tekniker7. Användningen av grisen i neurovetenskap börjar öka, eftersom PubMed söker efter nyckelorden "svinhjärndjursmodell" resulterar i fyra gånger fler resultat från 1996-2005 än föregående 10-årsperiod8, och ännu fler resultat för närvarande. En primär anledning till att grismodellens popularitet expanderar beror på dess likheter i tillväxt, struktur och funktion i hjärnan jämfört med människor. I jämförelse med den mänskliga hjärnan uppvisar grishjärnan liknande gyralmönster, vaskularisering och fördelning av grå och vit materia9. Dessutom har grishjärnan använts i neuroimaging förfaranden, framkallat potentiell inspelning, och för att fastställa neurokirurgi tekniker8,9. Till skillnad från andra djurmodeller upplever dock grisen och människan perinatala hjärntillväxtspurts, i motsats till pre- eller postnatala tillväxtspurts. Vid födseln väger den mänskliga hjärnan och grishjärnan cirka 27 respektive 25 procent av sin vuxna hjärnvikt jämfört med råtthjärnan som väger 12 procent av sin vuxna hjärnvikt och rhesusapans hjärna vid 76 procent avvuxenvikten 10.
En anledning till att grisen bara långsamt har antagits som en djurmodell för neurovetenskap är att många forskare inte känner till djuret i detta sammanhang. Forskare kanske inte är medvetna om dess potentiella användningsområden på fältet eller kanske inte känner till de lämpliga tekniker som krävs för att använda en sådan modell. Eftersom användningen av grisen som en biomedicinsk och preklinisk modell får uppmärksamhet och användning i neurovetenskap, är det nödvändigt att fastställa standardiserade förfaranden för vävnadsborttagning för att säkerställa korrekt jämförelse av data mellan studier. Även om dissekering och kirurgiska tekniker som involverar grishjärnan har publiceratsnågon annanstans 11,12,13, finns det ett behov av enkla och standardiserade protokoll för att samla grishjärnvävnad, särskilt för användning i biokemiska analyser. Som sådan är syftet med denna video att ge den kunskap som krävs för att forskare ska kunna utföra en standardiserad hjärnuttag och dissekering. Denna video illustrerar en korrekt teknik för att ta bort grishjärnan samtidigt som cortex och hjärnstammen förblir intakt, och därefter granska metoder för att dissekera flera viktiga hjärnregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Illinois i Urbana-Champaign
OBS: Före dödshjälp, grisen bedövades via intramuskulär injektion med en kombination av telazol:ketamin:xylazin (50,0 mg tiletamine HCl plus 50,0 mg zolazepam HCl rekonstituerat med 2,50 ml ketamin HCl (100 g/L) och 2,50 ml xylazin (100 g/L) och administreras vid 0,06 mg/kg BW). När bedövas avlivades grisen via intracardiac administration av natrium pentobarbital (390 mg/mL administreras vid 1 mL/5 kg BW). För hjärndesektion rekommenderas att metoden för dödshjälp väljs baserat på det önskade analytiska förfarandet i vävnaden. Metoden för dödshjälp bör orsaka så lite skada på hjärnan som möjligt.
1. Extraktion av grishjärnan
- Efter human dödshjälp halshugger du grisen genom att skära över nackens nacke, mellan den första respektive andra ryggkotan (atlas respektive axel).
- Säkra huvudet i en immobiliserad bänk vise modifierad för att inkludera spikar. Se till att huvudet är helt orörligt innan du fortsätter.
- Använd en skalpell, gör ett sagittalt snitt längs skallens mittlinje som fortsätter till huvudets bakre del.
- Gör ett andra (tvärgående) snitt på huvudets bakre del.
- Gör ett tredje (tvärgående) snitt på nosens bakre ände och i linje med ögonen. Skär huden så långt bort från skallen som möjligt för att säkerställa enkel åtkomst till skallen.
- Använd en bensåg, gör två främre till bakre skär laterala till mittlinjen, sträcker sig från ögonen till toppen av skallkrökningen. Fasa sågen mot mittlinjen och skär tillräckligt djupt för att penetrera skallen.
- Upprepa ovanstående process på vinkelräta sidor, vilket skapar ett rektangulärt "fönster" i skallen.
- Bänd av den rektangulära delen av skallen med hjälp av en köttkrok. Börja med att placera kroken i ett av hörnen av sektionen och tryck uppåt för att lossa skallbiten. Var noga med att placera köttkroken endast på skallens nivå för att förhindra att oavsiktligt penetrera hjärnvävnaden.
- Om några meningealskikt finns kvar på hjärnan, använd tång och trubbig sax (eller alternativt en skalpell) för att försiktigt ta bort lagren utan att skära in i hjärnan.
- Använd en skalpell för att skära bort muskler och fett vid den bakre delen av huvudet och exponera den bakre delen av skallen.
- Gör två tvärgående snitt längs skallens bakre del. Var noga med att inte skära i hjärnvävnad.
- Säkra huvudet genom att placera en fast hand på nosen och applicera ett bakåttryck för att dra av den bakre delen av skallen och exponera lillhjärnan.
- Ta bort huvudet från bänkskruven och placera på en kirurgisk matta.
- Använd ett långt smalt verktyg, till exempel den trubbiga änden av en skalpell, för att ta bort hjärnan. Vänd huvudet och använd en mild skopa rörelse för att koaxera hjärnan ur skallhålan utan att skada hjärnans yta.
OBS: Det kommer att vara nödvändigt att skära av hjärnnerverna för att ta bort hjärnan. Gör det försiktigt och försök inte kraftfullt dra ut hjärnan. Hjärnan kommer att falla ut på egen hand när den är ordentligt och helt lossnad från skallen och ryggraden.
2. Dissekering av grishjärnan
OBS: Det kan vara till hjälp att använda en hjärnatlas eller fiber dissekering guide14 som en visuell representation under dissekering förfaranden. Se till att dissekerade vävnadsprover lagras korrekt enligt projektspecifika behov vid avlägsnande av varje prov (beskrivs närmare nedan). Observera dessutom att för den här videon dissekerades alla hjärnregioner som visades från rätt halvklot, men detta kan skilja sig per laboratorium baserat på experimentella mål.
- För att ta bort hjärnstammen (främst medulla), gör en koronalskuren caudal till lillhjärnan.
- För att ta bort lillhjärnan, gör en koronala skärning bakre till cortex. Isolera önskade regioner (t.ex. vermis, flocculus, etc.) av lillhjärnan från detta prov. Var noga med att inte inkludera några delar av hjärnstammen i detta prov.
- Separera hjärnans två halvklot genom att göra ett mellansagitalt snitt längs den längsgående sprickan. Gör detta snitt som en kontinuerlig rörelse för att förhindra att orsaka skador på cortex.
- För att ta bort midbrain, dissekera en önskad mängd vävnad bara ventral till överlägsen och sämre kollikuli.
- För att ta bort hippocampus, placera den trubbiga änden av en skalpell i den bakre delen av corpus callosum och rulla försiktigt hippocampus ut, med en "J" rörelse som börjar från den bakre delen av corpus callosum; ett helt hippocampalhorn är "bönformat".
- Striatum (caudate kärnan visas främst) är en grå och vit materia-randig region strax under corpus callosum och främre till hippocampus. Fasa skalpellen och ta bort denna region, avslöjar strimmad vävnad vid avlägsnande.
- För att ta bort den mediala prefrontala cortex, dissekera vävnad från frontal gyrus till corpus callosum, ta bort den mest mediala delen av det avsnittet. Rätt cortex bör förbli efter avlägsnande av den mediala prefrontala cortex.
- För att ta bort thalamus, ta bort den glödlampaliknande strukturen i mitten av hjärnans midsagittala yta och rostral till midbrain. Thalamus har en sfärisk form och kommer att se något mörkare ut än den omgivande vävnaden.
3. Efter dissekering
- När dissekeringen är klar, bevara vävnadsproverna ordentligt för efterföljande analyser. Utelämnande av detta steg kommer att resultera i betydande autolys och nedbrytning inom så lite som 20 minuter.
- Lämna varje hjärnregion intakt vid dissekeringen om strukturella analyser kommer att utföras, eller hacka vävnaderna för att skapa ett homogent vävnadsprov före konservering. Vanliga provtagning konserveringsmetoder för hjärnvävnader inkluderar kryopreservation och kemisk fixering med hjälp av korslänkningsmedel15.
- För standardlabbanalyser (t.ex. gen- eller proteinuttryck), fördjupa dig i flytande kväve eller lösningar som stabiliserar genetiskt material före långtidslagring vid -80 °C för att ge praktiska och kostnadseffektiva konserveringsmetoder.
- Om upprätthållande av vävnadsstrukturen är en prioritet, bevara hjärnvävnader genom traditionella fixeringsmetoder (t.ex. använda aldehydbaserade fixeringar för att korsa samman proteiner), antingen utan eller med perfusion av djuret eller organet av intresse före vävnadsdesektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt beskriver exempel på resultat som erhållits efter korrekt extraktion och dissekering av en 4 veckor gammal grishjärna. Figur 1 beskriver formen på varje hjärnregion för användning som vägledning under dissekering. En del av hjärnstammen kan finnas kvar i skallen efter avlägsnande av lillhjärnan (Figur 1B). Detta kan tas bort medan isolera den önskade regionen av lillhjärnan. Tabell 1 visar medelvikten (medelvärdet ± standardfelet) för var och en av de dissekerade hjärnregionerna (n=5).
Figur 1: Extraherad grishjärna. Konturer av hjärnregioner för användning som guide under dissekering. Regionerna som visas kommer från höger halvklot. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Regionen | Vikt (g) | Sem |
| Hela grisen* | 8.006 | 0.545 |
| Hjärnstammen | 0.829 | 0.132 |
| Lillhjärnan | 5.929 | 0.137 |
| Mellanhjärnan | 0.376 | 0.047 |
| Hippocampus | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| Thalamus | 0.476 | 0.120 |
| medial prefrontal cortex | 0.459 | 0.122 |
| *Vikt presenterad som kg |
Tabell 1: Hjärnregioner Vikter. Medelvikten för den 4 veckor gamla grishjärnan och varje dissekerad hjärnregion (n=5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tekniker som beskrivs häri var utformade för grisar som var ungefär 4 veckor gamla. Det är viktigt att utföra dessa steg omedelbart efter att grisen har avlivats på ett humant sätt för att säkerställa att integriteten hos hjärnvävnadsstrukturen upprätthålls, särskilt när man överväger efterföljande biokemiska analyser. Det är bra att använda en atlas eller fiber16 dissekeringsguider när du först lär dig teknikerna. Det rekommenderas att experimenteraren övar flera hjärnuttag och dissekeringar innan de får prover för datainsamling. Det svåraste steget är avlägsnande av skallen. Detta steg kommer att bli lättare med erfarenhet eftersom det till stor del kräver förstahandspraxis för att veta var på skallen att såga och när skallen har skurits igenom. Denna procedur liknar den som beskrivs av Bassi et al.12, även om det inte kräver behovet av att skapa ett sexkantigt hjärnskålsfönster och ger en visuell handledning om hur man utför tekniken.
En begränsning av denna teknik det att när man arbetar med äldre grisar kan det ta längre tid att ta bort skallen eftersom det blir betydligt tjockare med åldern. Om det är för mödosamt eller ineffektivt att använda en såg för tjockare skallar, kan det vara nödvändigt att antingen använda en hammare och mejsel, som den som bjarkam et al.13visar , eller driven kirurgisk utrustning (t.ex. bensåg). Dessutom säkerställer denna teknik inte alltid fångsten av luktlökarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma Jim Knoblauch och Martin-Booth Hodges från College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services för sin expertis inom fotografering, inspelning och redigering av ljud och video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
