Summary
В этом протоколе подробно техника удаления свиного мозга в полном объеме и вскрытия нескольких областей мозга обычно изучается в неврологии.
Abstract
Использование свиньи в качестве доклинической и переводимой модели животных было хорошо задокументировано и принято научно-исследовательскими областями, исследуя сердечно-сосудистые системы, желудочно-кишечные системы и питание, и свинья все чаще используется в качестве крупной модели животных в неврологии. Кроме того, свинья является принятой моделью для изучения нейроразвития, поскольку она отображает рост мозга и модели развития, аналогичные тому, что происходит в организме человека. Как менее распространенная модель животных в неврологии, хирургические и рассечения процедур на свиней не может быть, как знакомые или хорошо практикуется среди исследователей. Таким образом, стандартизированный визуальный протокол с подробным описанием последовательных методов экстракции и вскрытия может оказаться ценным для исследователей, работающих со свиньей. Следующее видео демонстрирует технику для удаления свиного мозга, сохраняя при этом коры головного мозга нетронутыми и обзоры методов, чтобы вскрыть несколько широко исследованных областей мозга, включая ствол мозга, мозжечок, мидбрин, гиппокамп, стриатум, таламус, и медиальной префронтальной коры. Цель этого видео заключается в том, чтобы предоставить исследователям инструменты и знания, необходимые для последовательного выполнения извлечения мозга и вскрытия на четырехнедельной свиньи.
Introduction
Свинья была хорошо документирована и принята в качестве переводимой модели животных для исследованийв сердечно-сосудистой системы 1,желудочно-кишечные системы 2,питание 3,4,диабет 5, токсикология6, и хирургическиеметоды 7. Использование свиньи в неврологии начинает увеличиваться, как PubMed ищет ключевые слова "свиной мозг животных модель" привести к в четыре раза больше результатов с 1996-2005, чем предыдущие 10-летнийпериод 8, и даже больше результатов в настоящее время. Основная причина того, что популярность модели свиньи расширяется из-за его сходства в росте, структуре и функции мозга по сравнению с людьми. По сравнению с человеческим мозгом, свиной мозг демонстрирует аналогичные гиральные узоры, васкуляризации и распределения серого и белого вещества9. Кроме того, свиной мозг был использован в нейровизуаляции процедур, вызвал потенциальную запись, и в создании методовнейрохирургии 8,9. В отличие от других моделей животных, однако, свиньи и человека опыт перинатального роста мозга рывки, в отличие от до- или послеродового рывка роста. При рождении, человека и свиньи мозга весят примерно 27 и 25 процентов их взрослого веса мозга, соответственно, по сравнению с крысиным мозгом, который весит 12 процентов от его взрослого веса мозга и резус обезьяны мозга на 76 процентов взрослоговеса 10.
Одна из причин, свинья была только медленно принята в качестве модели животных для неврологии, потому что многие исследователи не знакомы с животным в этом контексте. Исследователи могут не знать о его потенциальном использовании в полевых условиях или могут не знать надлежащих методов, необходимых для использования такой модели. Поскольку использование свиньи в качестве биомедицинской и доклинной модели привлекает внимание и используется в неврологии, необходимо установить стандартизированные процедуры удаления тканей, чтобы обеспечить точное сравнение данных между исследованиями. Хотя вскрытие и хирургические методы с участием свиного мозгабыли опубликованы в другом месте 11,12,13, есть необходимость в простых и стандартизированных протоколов для сбора ткани мозга свиньи, особенно для использования в биохимических анализов. Таким образом, цель этого видео заключается в предоставлении знаний, необходимых, чтобы позволить исследователям выполнять стандартизированные извлечения мозга и вскрытия. Это видео иллюстрирует один правильный метод для удаления мозга свиньи, сохраняя при этом коры головного мозга нетронутыми, а затем обзор методов, чтобы вскрыть несколько ключевых областей мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Университете Иллинойса в Урбане-Шампейне
ПРИМЕЧАНИЕ: До эвтаназии, свинья была анестезирована с помощью внутримышечной инъекции с комбинацией телазола:кетамин:ксилазин (50,0 мг плиткамин HCl плюс 50,0 мг золазепам HCl восстановлен с 2,50 мл кетамина HCl (100 г/л) и 2,50 мл ксилазина (100 г/л) и вводят при 0,06 мг/кг BW). После анестезии свинью усыпляли с помощью интракардиального введения пентобарбитала натрия (390 мг/мл, вводимого при 1 мл/5 кг BW). Для вскрытия мозга рекомендуется выбрать метод эвтаназии на основе желаемой аналитической процедуры ткани. Метод эвтаназии должен причинить как можно меньше вреда мозгу.
1. Извлечение свиного мозга
- После гуманной эвтаназии обезглавите свинью, разрезая затылок, между первым и вторым позвонком (атлас и ось, соответственно).
- Закрейте голову в обездвиженой скамейке тизавихи модифицированных включить шипы. Убедитесь, что голова полностью обездвижена перед началом.
- Используя скальпель, сделать sagittal вырезать вдоль средней линии черепа, который продолжается до задней части головы.
- Сделайте второй (поперечный) разрез на задней части головы.
- Сделайте третий (поперечный) разрез на задней части морды и в линии с глазами. Отрежьте кожу как можно далека от черепа, чтобы обеспечить легкий доступ к черепу.
- Используя костную пилу, сделайте два передних к задней разрезы боковой к средней линии, простираясь от глаз до вершины кривизны черепа. Bevel пилы к средней линии и сократить только достаточно глубоко, чтобы проникнуть в череп.
- Повторите вышеуказанный процесс на перпендикулярных сторонах, создавая прямоугольное «окно» в черепе.
- Используя мясной крючок, вырвать прямоугольную часть черепа. Начните с размещения крючка в одном из углов секции и применить повышательное давление, чтобы ослабить кусок черепа. Позаботьтесь, чтобы поместить мясной крючок только на уровне черепа, чтобы предотвратить непреднамеренное проникновение в ткани мозга.
- Если какие-либо менингеальные слои остаются на мозге, используйте миппы и тупые ножницы (или же, скальпель), чтобы аккуратно удалить слои, не врезаясь в мозг.
- Используйте скальпель, чтобы отрезать мышцы и жир в задней части головы, подвергая задней части черепа.
- Сделайте два поперечных разреза вдоль задней части черепа. Будьте уверены, чтобы не нарезать ткани мозга.
- Закрените голову, поставив твердую руку на морду и применить давление назад, чтобы вытащить заднюю часть черепа, подвергая мозжечок.
- Снимите голову со скамейки порока и поместите на хирургический коврик.
- Используйте длинный тонкий инструмент, такой как тупой конец скальпеля, чтобы удалить мозг. Инвертировать голову и использовать нежное движение черпать уговорить мозг из полости черепа, не повреждая поверхность мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо будет разорвать черепные нервы, чтобы удалить мозг. Делайте это осторожно и не пытайтесь силой вытащить мозг. Мозг выпадет сам по себе, когда он правильно и полностью отделен от черепа и позвоночника.
2. Рассечение свиного мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно использовать атлас мозга или волокна вскрытия руководство14 в качестве визуального представления во время процедур вскрытия. Убедитесь, что вскрытые образцы тканей хранятся должным образом в соответствии с проектными потребностями при удалении каждого образца (описано более подробно ниже). Кроме того, обратите внимание, что для целей этого видео, все области мозга показаны были расчленены из правого полушария, но это может отличаться в лаборатории на основе экспериментальных целей.
- Чтобы удалить ствол мозга (преимущественно медулла), сделать корональный разрез caudal к мозжеку.
- Чтобы удалить мозжечок, сделать коронайский разрез задней коры. Изолировать желаемые области (например, вермису, флоккул и т.д.) мозжечка из этого образца. Убедитесь в том, чтобы не включать какие-либо части ствола мозга в этот образец.
- Разделите два полушария мозга, сделав средне-sagittal разрез вдоль продольной трещины. Сделайте этот разрез в качестве непрерывного движения, чтобы предотвратить причинение ущерба коре головного мозга.
- Чтобы удалить средний мозг, вскрыть нужное количество ткани просто брюшной к начальнику и нижней колликулы.
- Чтобы удалить гиппокамп, поместите тупой конец скальпеля в задней части мозоли корпуса и аккуратно раскатать гиппокампа, используя "J" движение, начиная с задней части корпуса мозоли; весь рог гиппокампа имеет форму фасоли.
- Стриатум (хвостовое ядро в первую очередь показано) является серым и белым материей полосатой области чуть ниже корпуса мозоли и передней к гиппокампу. Bevel скальпель и удалить эту область, выявление полосатые ткани при удалении.
- Чтобы удалить медиальной префронтальной коры, вскрыть ткани из лобной извилины в корпус мозоли, удалив наиболее медиальной части этого раздела. Правая кора должна оставаться после удаления медиальной префронтальной коры.
- Чтобы удалить таламус, удалить лампы, как структура в центре midsagittal поверхности мозга и рострального до середины мозга. Таламус имеет сферическую форму и будет выглядеть немного темнее, чем окружающие ткани.
3. После вскрытия
- По завершении вскрытия, сохранить образцы тканей должным образом для последующего анализа. Упущение этого шага приведет к значительному аутолизу и деградации в течение всего 20 минут.
- Оставьте каждую область мозга нетронутой во время вскрытия, если структурный анализ будет выполнен, или фарш тканей для создания однородной образца ткани до сохранения. Общие методы сохранения образцов для тканей мозга включают криоконсервации и химической фиксации с использованием перекрестныхагентов 15.
- Для стандартных лабораторных анализов (например, экспрессии генов или белков), погрузитесь в жидкий азот или растворы, которые стабилизируют генетический материал до длительного хранения при -80 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить удобные и экономически эффективные методы сохранения.
- Если поддержание структуры тканей является приоритетом, сохранить ткани мозга с помощью традиционных методов фиксации (например, с помощью альдегида основе фиксаторов для перекрестного белка), либо без или с перфузией животного или органа интереса до вскрытия тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе описаны примеры результатов, полученных после правильного извлечения и вскрытия 4-недельного свиного мозга. На рисунке 1 излагается форма каждой области мозга для использования в качестве руководства во время вскрытия. Часть ствола мозга может остаться в черепе после удаления мозжечка(рисунок 1B). Это может быть удалено при изоляции желаемой области мозжечка. Таблица 1 отображает средний вес (± стандартной погрешности среднего) для каждой из вскрытых областей мозга (n'5).
Рисунок 1: Извлеченные Свиньи мозга. Очертания областей мозга для использования в качестве руководства во время вскрытия. Показаны регионы из правого полушария. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| область | Вес (г) | СЕМ |
| Целая свинья | 8.006 | 0.545 |
| Мозговтем | 0.829 | 0.132 |
| мозжечок | 5.929 | 0.137 |
| средний мозг | 0.376 | 0.047 |
| птичья шпора | 0.500 | 0.051 |
| Стриатум | 0.410 | 0.115 |
| Таламуса | 0.476 | 0.120 |
| медиальный префронтальный кортекс | 0.459 | 0.122 |
| «Вес, представленный как кг |
Таблица 1: Вес регионов мозга. Средний вес 4-недельного свиного мозга и каждой вскрытой области мозга (n'5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные в настоящем были разработаны для свиней примерно 4 недель. Очень важно выполнить эти шаги сразу же после того, как свинья была гуманно усыплена, чтобы обеспечить целостность структуры тканей мозга поддерживается, особенно при рассмотрении последующих биохимических анализов. Полезно использовать атлас или волокна16 вскрытия руководства при первом изучении методов. Экспериментатору рекомендуется практиковать несколько извлечений и вскрытий мозга до получения образцов для сбора данных. Самый сложный шаг - удаление черепа. Этот шаг станет легче с опытом, как это в значительной степени требует из первых рук практике знать, где на черепе, чтобы пилу и когда череп был прорезано. Эта процедура аналогична описанной Bassi et al.12, хотя она не требует необходимости создания шестиугольного черепного окна и обеспечивает визуальный учебник о том, как выполнить технику.
Ограничение этой техники, что при работе со старыми свиньями, это может занять больше времени, чтобы удалить череп, как она становится значительно толще с возрастом. Если использование пилы является слишком трудоемким или неэффективным для более толстых черепов, может возникнуть необходимость либо использовать молоток и долото, как показано на Bjarkam et al.13, или питание хирургического оборудования (например, костной пилы). Кроме того, этот метод не всегда обеспечивает захват обонятельных луковиц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Джима Knoblauch и Мартин-Бут Ходжес из колледжа сельскохозяйственных, потребительских и экологических наук информационных технологий и коммуникационных услуг за их опыт в стрельбе, записи и редактирования аудио и видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
