Summary
Denne protokol beskriver teknikken til fjernelse af svinehjernen i sin helhed og dissektion af flere hjerneregioner, der almindeligvis studeres i neurovidenskab.
Abstract
Brugen af grisen som en præklinisk og oversættelig dyremodel er veldokumenteret og accepteret af forskningsfelter, der undersøger hjerte-kar-systemer, gastrointestinale systemer og ernæring, og grisen bruges i stigende grad som en stor dyremodel i neurovidenskab. Desuden er grisen en accepteret model til at studere neuroudvikling, da den viser hjernens vækst- og udviklingsmønstre svarende til det, der forekommer hos mennesker. Som en mindre almindelig dyremodel inden for neurovidenskab er kirurgiske og dissektionelle procedurer på svin muligvis ikke så velkendte eller vekerede blandt forskere. Derfor kan en standardiseret visuel protokol, der beskriver konsekvente ekstraktions- og dissektionsmetoder, vise sig værdifuld for forskere, der arbejder med grisen. Følgende video viser en teknik til at fjerne svinehjernen og samtidig holde cortex og hjernestamme intakt og gennemgår metoder til at dissekere flere almindeligt undersøgte hjerneregioner, herunder hjernestammen, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus og mediale præfrontale cortex. Formålet med denne video er at give forskerne de værktøjer og den viden, der er nødvendig for konsekvent at udføre en hjerneudtrækning og dissektion på den fire uger gamle gris.
Introduction
Grisen er veldokumenteret og accepteret som en oversættelig dyremodel til forskning i hjerte-kar-systemer1,gastrointestinale systemer2,ernæring3,4,diabetes5, toksikologi6og kirurgiske teknikker7. Brugen af grisen i neurovidenskab er begyndt at stige, da PubMed søger efter nøgleordene "svinehjernedyrmodel" resulterer i fire gange flere resultater fra 1996-2005 end den foregående 10-årige periode8, og endnu flere resultater på nuværende tidspunkt. En primær grund til, at svinmodellens popularitet udvides, skyldes dens ligheder i vækst, struktur og funktion af hjernen sammenlignet med mennesker. I forhold til den menneskelige hjerne udviser svinehjernen lignende gyralmønstre, vaskulærisering og distribution af gråt og hvidt stof9. Desuden har svinehjernen været brugt i neuroimaging procedurer, fremkaldt potentiel optagelse og i etablering af neurokirurgiteknikker8,9. I modsætning til andre dyremodeller sprøjter grisen og den menneskelige erfaring perinatal hjernevækst imidlertid i modsætning til præ- eller postnatal vækstspurts. Ved fødslen vejer menneske- og svinehjernen ca. 27 og 25 procent af deres voksne hjernevægt sammenlignet med rottehjernen, der vejer 12 procent af sin voksne hjernevægt og rhesus abehjernen ved 76 procent afvoksenvægten 10.
En af grundene til, at grisen kun langsomt er blevet vedtaget som dyremodel for neurovidenskab, er fordi mange forskere ikke er bekendt med dyret i denne sammenhæng. Forskere kan ikke være opmærksomme på dens potentielle anvendelser på området eller måske ikke kender de rigtige teknikker, der kræves for at bruge en sådan model. Da brugen af grisen som en biomedicinsk og præklinisk model får opmærksomhed og brug i neurovidenskab, er det nødvendigt at etablere standardiserede procedurer for fjernelse af væv for at sikre nøjagtig sammenligning af data på tværs af undersøgelser. Selvom dissektion og kirurgiske teknikker, der involverer svinehjernen, er blevet offentliggjort andetsteds11,12,13, er der behov for enkle og standardiserede protokoller til indsamling af svinehjernevæv, især til brug i biokemiske assays. Som sådan er formålet med denne video at give den viden, der er nødvendig for at give forskere mulighed for at udføre en standardiseret hjerneudtrækning og dissektion. Denne video illustrerer en ordentlig teknik til at fjerne svinehjernen og samtidig holde cortex og hjernestamme intakt, og efterfølgende gennemgå metoder til at dissekere flere centrale hjerne regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer vedrørende forsøgspersoner er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Illinois i Urbana-Champaign
BEMÆRK: Før aktiv dødshjælp, grisen blev bedøvet via intramuskulær injektion med en kombination af telazol:ketamin:xylazin (50,0 mg tiletamin HCl plus 50,0 mg zolazepam HCl rekonstitueret med 2,50 mL ketamin HCl (100 g/L) og 2,50 mL xylazin (100 g/l) og indgives ved 0,06 mg/kg BW). Når grisen var bedøvet, blev den aflivet via intrakariac indgift af natriumpentobarbital (390 mg/mL administreret ved 1 mL/5 kg BW). Til hjernedissektion anbefales det, at metoden til aktiv dødshjælp vælges baseret på den ønskede analytiske procedure i vævet. Metoden til aktiv dødshjælp bør forårsage så lidt skade på hjernen som muligt.
1. Udvinding af svinehjernen
- Efter human aktiv dødshjælp halshugges grisen ved at skære over nakken mellem henholdsvis første og anden hvirvel (atlas og akse).
- Fastgør hovedet i en immobiliseret bænk skruestik modificeret til at omfatte pigge. Sørg for, at hovedet er helt immobiliseret, før du fortsætter.
- Brug en skalpel, lave en sagittal snit langs midterlinjen af kraniet, der fortsætter til posterior af hovedet.
- Lav en anden (tværgående) snit på posterior af hovedet.
- Lav en tredje (tværgående) snit på den bageste ende af snuden og in-line med øjnene. Skær huden så langt væk fra kraniet som muligt for at sikre nem adgang til kraniet.
- Brug en knoglesav, lav to forreste-til-posterior nedskæringer lateral til midterlinjen, der strækker sig fra øjnene til toppen af kraniet krumning. Facet saven mod midterlinjen og skære lige dybt nok til at trænge ind i kraniet.
- Gentag ovenstående proces på vinkelret sider, hvilket skaber et rektangulært "vindue" i kraniet.
- Brug en kødkrog, lirke den rektangulære del af kraniet af. Begynd med at placere krogen i et af hjørnerne af sektionen og påfør opadgående tryk for at løsne kraniestykket. Pas på kun at placere kødkrogen på kraniets niveau for at forhindre utilsigtet at trænge ind i hjernevævet.
- Hvis nogen meningeal lag forbliver på hjernen, skal du bruge pincet og stump saks (eller alternativt en skalpel) til forsigtigt at fjerne lagene uden at skære ind i hjernen.
- Brug en skalpel til at skære væk muskler og fedt på den bageste del af hovedet, udsætter den bageste del af kraniet.
- Lav to tværgående snit langs kraniets bagside. Sørg for ikke at skære i hjernevæv.
- Fastgør hovedet ved at placere en fast hånd på snuden og påfør et baglæns tryk for at trække den bageste del af kraniet af og udsætte lillehjernen.
- Fjern hovedet fra bænken vice og sted på en kirurgisk måtte.
- Brug et langt slankt værktøj, såsom den stumpe ende af en skalpel, til at fjerne hjernen. Vend hovedet og brug en blid scooping bevægelse til at lokke hjernen ud af kraniet hulrum uden at beskadige overfladen af hjernen.
BEMÆRK: Det vil være nødvendigt at afskære kranienerver for at fjerne hjernen. Gør det forsigtigt og forsøg ikke kraftigt at trække hjernen ud. Hjernen vil falde ud på egen hånd, når det er korrekt og helt løsrevet fra kraniet og rygsøjlen.
2. Dissektion af svinehjernen
BEMÆRK: Det kan være nyttigt at bruge en hjerneatlas eller fiberdissektionsvejledning14 som en visuel repræsentation under dissektionsprocedurer. Sørg for, at dissekerede vævsprøver opbevares korrekt i overensstemmelse med projektspecifikke behov ved fjernelse af hver prøve (beskrevet mere detaljeret nedenfor). Derudover skal du være opmærksom på, at i forbindelse med denne video blev alle viste hjerneregioner dissekeret fra højre halvkugle, men dette kan variere pr. laboratorium baseret på eksperimentelle mål.
- For at fjerne hjernestammen (overvejende medulla), lav en koronar skåret kaudale til lillehjernen.
- For at fjerne lillehjernen skal du lave en koronask skåret posterior til cortex. Isoler de ønskede regioner (f.eks. vermis, flocculus osv.) af lillehjernen fra denne prøve. Sørg for ikke at medtage nogen dele af hjernestammen i denne prøve.
- Adskil de to hjernehalvdele i hjernen ved at lave et midt-sagittal snit langs den langsgående revne. Gør dette snit som en kontinuerlig bevægelse for at forhindre at forårsage skade på cortex.
- For at fjerne midbrain, dissekere en ønsket mængde væv bare ventral til den overlegne og ringere colliculi.
- For at fjerne hippocampus skal du placere den stumpe ende af en skalpel i den bageste del af corpus callosum og forsigtigt rulle hippocampus ud ved hjælp af en "J" -bevægelse, der starter fra den bageste del af corpus callosum; et helt hippocampalhorn er 'bønneformet'.
- Striatum (kausate kerne er primært vist) er en grå og hvid stof-stribet region lige under corpus callosum og forreste til hippocampus. Facet skalpellen og fjerne denne region, afslører striated væv ved fjernelse.
- For at fjerne den mediale præfrontale cortex, dissekere væv fra frontal gyrus til corpus callosum, fjerne den mest mediale del af denne sektion. Den rigtige cortex bør forblive efter fjernelse af den mediale præfrontale cortex.
- For at fjerne thalamus skal du fjerne den pærelignende struktur i midten af hjernens midsagittale overflade og rostral til midbrainen. Thalamus har en sfærisk form og vil se lidt mørkere ud end det omgivende væv.
3. Post-dissektion
- Når dissektionen er afsluttet, skal vævsprøverne opbevares korrekt til efterfølgende analyser. Udeladelse af dette trin vil resultere i betydelig autolyse og nedbrydning inden for så lidt som 20 minutter.
- Lad hver hjerneregion være intakt på dissektionstidspunktet, hvis der udføres strukturelle analyser, eller læg vævene i for at skabe en homogen vævsprøve inden konservering. Almindelige metoder til opbevaring af prøver til hjernevæv omfatter kryopræservering og kemisk fiksering ved hjælp af krydsningsmidler15.
- For standardlaboratorieanalyser (f.eks. gen- eller proteinudtryk) nedsænkes i flydende nitrogen eller opløsninger, der stabiliserer genetisk materiale inden langtidsopbevaring ved -80 °C for at give bekvemme og omkostningseffektive konserveringsmetoder.
- Hvis vedligeholdelse af vævsstruktur er en prioritet, skal du bevare hjernevæv gennem traditionelle fikseringsmetoder (f.eks. ved hjælp af aldehydbaserede fikseringsmidler til crosslinkproteiner), enten uden eller med perfusion af dyret eller et organ af interesse forud for vævsdissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit beskriver eksempler på resultater opnået efter korrekt ekstraktion og dissektion af en 4 uger gammel svinehjerne. Figur 1 skitserer formen på hver hjerneregion til brug som vejledning under dissektion. En del af hjernestammen kan forblive i kraniet efter fjernelse af lillehjernen (Figur 1B). Dette kan fjernes, mens det ønskede område af lillehjernen isoleres. Tabel 1 viser gennemsnitsvægten (middelværdi ± standardfejl i middelværdien) for hver af de dissekerede hjerneområder (n=5).
Figur 1:Udvundet svinehjerne. Konturer af hjerneområder til brug som vejledning under dissektion. De viste områder er fra højre halvkugle. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Region | Vægt (g) | Sem |
| Hele grisen* | 8.006 | 0.545 |
| Hjernestammen | 0.829 | 0.132 |
| Lillehjernen | 5.929 | 0.137 |
| Midthjernen | 0.376 | 0.047 |
| Hippocampus | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| Thalamus | 0.476 | 0.120 |
| mediale præfrontale Cortex | 0.459 | 0.122 |
| *Vægt præsenteret som kg |
Tabel 1: Vægte i hjerneregioner. Gennemsnitsvægten af den 4 uger gamle svinehjerne og hver dissekeret hjerneregion (n=5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De teknikker, der er beskrevet heri, er designet til svin, der er ca. 4 uger gamle. Det er afgørende at udføre disse trin umiddelbart efter, at grisen er blevet humant aflivet for at sikre integriteten af hjernevævsstrukturen opretholdes, især når man overvejer efterfølgende biokemiske assays. Det er nyttigt at bruge et atlas eller fiber16 dissektion guider, når først at lære de teknikker. Det anbefales, at eksperimentatoren praktiserer flere hjerneudtrækninger og dissektioner, inden der udtages prøver til dataindsamling. Det sværeste skridt er fjernelse af kraniet. Dette trin bliver lettere med erfaring, da det stort set kræver førstehånds praksis at vide, hvor på kraniet at save, og hvornår kraniet er blevet skåret igennem. Denne procedure svarer til den, der er beskrevet af Bassi et al.12, selvom det ikke kræver behovet for at oprette et sekskantet kranialvindue og giver et visuelt selvstudium om, hvordan man udfører teknikken.
En begrænsning af denne teknik er det, at når man arbejder med ældre grise, kan det tage længere tid at fjerne kraniet, da det bliver betydeligt tykkere med alderen. Hvis det er for besværligt eller ineffektivt at bruge en sav til tykkere kranier, kan det være nødvendigt enten at bruge en hammer og mejsel som den, bjarkam et al.13har vist , eller drevet kirurgisk udstyr (f.eks. knoglesav). Desuden sikrer denne teknik ikke altid indfangning af de olfaktoriske pærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Jim Knoblauch og Martin-Booth Hodges fra College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services for deres ekspertise inden for optagelse, optagelse og redigering af lyd og video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
