Summary
Dit protocol beschrijft de techniek voor verwijdering van het varkensbrein in zijn geheel en dissectie van verschillende hersengebieden die vaak in de neurowetenschappen worden bestudeerd.
Abstract
Het gebruik van het varken als een preklinisch en vertaalbaar diermodel is goed gedocumenteerd en geaccepteerd door onderzoeksgebieden die cardiovasculaire systemen, gastro-intestinale systemen en voeding onderzoeken, en het varken wordt steeds vaker gebruikt als een groot diermodel in de neurowetenschappen. Bovendien is het varken een geaccepteerd model om neuroontwikkeling te bestuderen, omdat het hersengroei- en ontwikkelingspatronen vertoont die vergelijkbaar zijn met wat er bij mensen gebeurt. Als een minder gebruikelijk diermodel in de neurowetenschappen, zijn chirurgische en dissectieprocedures bij varkens misschien niet zo bekend of goed geoefend onder onderzoekers. Daarom kan een gestandaardiseerd visueel protocol met consistente extractie- en dissectiemethoden waardevol zijn voor onderzoekers die met het varken werken. De volgende video toont een techniek om de varkenshersenen te verwijderen terwijl de cortex en hersenstam intact blijven en bekijkt methoden om verschillende algemeen onderzochte hersengebieden te ontleden, waaronder de hersenstam, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus en mediale prefrontale cortex. Het doel van deze video is om onderzoekers de tools en kennis te bieden die nodig zijn om consequent een hersenextractie en dissectie uit te voeren op het vier weken oude varken.
Introduction
Het varken is goed gedocumenteerd en geaccepteerd als een vertaalbaar diermodel voor onderzoek in cardiovasculaire systemen1, gastro-intestinale systemen2, voeding3,4, diabetes5, toxicologie6, en chirurgische technieken7. Het gebruik van het varken in de neurowetenschappen begint toe te nemen, omdat PubMed zoekt naar de trefwoorden "varkensbreindiermodel" resulteert in vier keer meer resultaten van 1996-2005 dan de voorgaande periode van 10 jaar8, en momenteel nog meer resultaten. Een primaire reden dat de populariteit van het varkensmodel toeneemt, is vanwege de overeenkomsten in groei, structuur en functie van de hersenen in vergelijking met mensen. In vergelijking met het menselijk brein vertoont het varkensbrein vergelijkbare gyrale patronen, vascularisatie en distributie van grijze en witte stof9. Bovendien is het varkensbrein gebruikt bij neuroimagingprocedures, opgeroepen tot potentiële opname en bij het vaststellen van neurochirurgietechnieken8,9. In tegenstelling tot andere diermodellen, echter, het varken en de menselijke ervaring perinatale hersengroei spurt, in tegenstelling tot pre- of postnatale groei spurts. Bij de geboorte wegen het menselijk en varkensbrein respectievelijk ongeveer 27 en 25 procent van hun volwassen hersengewicht, vergeleken met het rattenbrein dat 12 procent van zijn volwassen hersengewicht weegt en het rhesusapenbrein op 76 procent van het volwassen gewicht10.
Een reden waarom het varken slechts langzaam is aangenomen als een diermodel voor neurowetenschappen, is omdat veel onderzoekers in deze context onbekend zijn met het dier. Onderzoekers zijn zich mogelijk niet bewust van het mogelijke gebruik ervan in het veld of kennen mogelijk niet de juiste technieken die nodig zijn om een dergelijk model te gebruiken. Aangezien het gebruik van het varken als biomedisch en preklinisch model aandacht en gebruik in de neurowetenschappen krijgt, is het noodzakelijk om gestandaardiseerde procedures voor weefselverwijdering vast te stellen om een nauwkeurige vergelijking van gegevens tussen studies te garanderen. Hoewel dissectie en chirurgische technieken met betrekking tot het varkensbrein elders zijn gepubliceerd11,12,13, is er behoefte aan eenvoudige en gestandaardiseerde protocollen om varkenshersenweefsel te verzamelen, vooral voor gebruik in biochemische assays. Als zodanig is het doel van deze video om de kennis te bieden die nodig is om onderzoekers in staat te stellen een gestandaardiseerde hersenextractie en dissectie uit te voeren. Deze video illustreert een goede techniek om de varkenshersenen te verwijderen terwijl de cortex en hersenstam intact blijven, en vervolgens methoden te bekijken om verschillende belangrijke hersengebieden te ontleden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dieronderwerpen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign
OPMERKING: Voorafgaand aan euthanasie werd het varken verdoofd via intramusculaire injectie met een combinatie van telazol:ketamine:xylazine (50,0 mg tiletamine HCl plus 50,0 mg zolazepam HCl gereconstitueerd met 2,50 ml ketamine HCl (100 g/L) en 2,50 ml xylazine (100 g/L). Eenmaal verdoofd, werd het varken geëuthanaseerd via intracardiale toediening van natriumpentobarbital (390 mg/ml toegediend bij 1 ml/5 kg LICHAAMSGEWICHT). Voor hersendissectie wordt aanbevolen om de methode van euthanasie te kiezen op basis van de gewenste analytische procedure van het weefsel. De methode van euthanasie moet zo min mogelijk schade aan de hersenen veroorzaken.
1. Extractie van het varkensbrein
- Na humane euthanasie onthoofdt u het varken door boven de nek van de nek te snijden, tussen de eerste en tweede wervel (respectievelijk atlas en as).
- Zet het hoofd vast in een geïmmobiliseerde bankschroef die is aangepast om spikes op te nemen. Zorg ervoor dat het hoofd volledig geïmmobiliseerd is voordat u verder gaat.
- Maak met behulp van een scalpel een sagittale snede langs de middellijn van de schedel die doorgaat naar de achterste van het hoofd.
- Maak een tweede (dwarse) snede op de achterste van het hoofd.
- Maak een derde (dwars)snede op het achterste uiteinde van de snuit en in lijn met de ogen. Snijd de huid zo ver mogelijk van de schedel af om een gemakkelijke toegang tot de schedel te garanderen.
- Maak met behulp van een botzaag twee voorste tot achterste sneden zijwaarts naar de middellijn, die zich uitstrekt van de ogen tot de top van de schedelkromming. Schuine de zaag naar de middellijn en snijd net diep genoeg om de schedel te penetreren.
- Herhaal het bovenstaande proces aan de loodrechte zijden, waardoor een rechthoekig "venster" in de schedel ontstaat.
- Wring met een vleeshaak het rechthoekige deel van de schedel eraf. Begin met het plaatsen van de haak in een van de hoeken van de sectie en oefen opwaartse druk uit om het schedelstuk los te maken. Zorg ervoor dat u de vleeshaak alleen op het niveau van de schedel plaatst om te voorkomen dat het hersenweefsel onbedoeld doordringt.
- Als er meningeale lagen op de hersenen achterblijven, gebruik dan een tang en een stompe schaar (of als alternatief een scalpel) om de lagen voorzichtig te verwijderen zonder in de hersenen te snijden.
- Gebruik een scalpel om spieren en vet aan het achterste deel van het hoofd weg te snijden, waardoor het achterste deel van de schedel wordt blootgelegd.
- Maak twee dwarssneden langs de achterste van de schedel. Zorg ervoor dat je niet in hersenweefsel snijdt.
- Zet het hoofd vast door een stevige hand op de snuit te plaatsen en oefen een achterwaartse druk uit om het achterste deel van de schedel eraf te trekken, waardoor het cerebellum bloot komt te staan.
- Verwijder het hoofd van de bankschroef en plaats het op een chirurgische mat.
- Gebruik een lang slank hulpmiddel, zoals het stompe uiteinde van een scalpel, om de hersenen te verwijderen. Keer het hoofd om en gebruik een zachte schepbeweging om de hersenen uit de schedelholte te halen zonder het oppervlak van de hersenen te beschadigen.
OPMERKING: Het zal nodig zijn om schedelzenuwen te doorsnijden om de hersenen te verwijderen. Doe dit voorzichtig en probeer de hersenen er niet met geweld uit te trekken. De hersenen vallen vanzelf uit als ze goed en volledig los zijn van de schedel en wervelkolom.
2. Dissectie van het varkensbrein
OPMERKING: Het kan nuttig zijn om een hersenatlas of vezeldissectiegids14 te gebruiken als visuele weergave tijdens dissectieprocedures. Zorg ervoor dat ontlede weefselmonsters correct worden opgeslagen volgens projectspecifieke behoeften bij het verwijderen van elk monster (hieronder in meer detail beschreven). Houd er bovendien rekening mee dat voor de doeleinden van deze video alle getoonde hersengebieden zijn ontleed vanaf de rechterhersenhelft, maar dit kan per laboratorium verschillen op basis van experimentele doelstellingen.
- Om de hersenstam (voornamelijk de medulla) te verwijderen, maakt u een coronale snee in het cerebellum.
- Om het cerebellum te verwijderen, maak je een coronale snee in de cortex. Isoleer de gewenste gebieden (bijv. vermis, flocculus, enz.) van het cerebellum uit dit monster. Zorg ervoor dat u geen delen van de hersenstam in dit monster opneemt.
- Scheid de twee hersenhelften door een mid-sagittale snede te maken langs de longitudinale spleet. Maak deze snede als een continue beweging om schade aan de cortex te voorkomen.
- Om de middenhersenen te verwijderen, ontleedt u een gewenste hoeveelheid weefsel gewoon ventrale naar de superieure en inferieure colliculi.
- Om de hippocampus te verwijderen, plaatst u het stompe uiteinde van een scalpel in het achterste deel van het corpus callosum en rolt u de hippocampus voorzichtig uit, met behulp van een "J"-beweging vanaf het achterste deel van het corpus callosum; een hele hippocampale hoorn is 'boonvormig'.
- Het striatum (caudate nucleus wordt voornamelijk getoond) is een grijs en witte stof gestreept gebied net onder het corpus callosum en voorste aan de hippocampus. Schuiner de scalpel en verwijder dit gebied, waardoor gerigeerd weefsel bij verwijdering wordt onthuld.
- Om de mediale prefrontale cortex te verwijderen, ontleedt u weefsel van de frontale gyrus naar het corpus callosum en verwijdert u het meest mediale deel van die sectie. De rechterschors moet blijven na verwijdering van de mediale prefrontale cortex.
- Om de thalamus te verwijderen, verwijdert u de bolachtige structuur in het midden van het midnatale oppervlak van de hersenen en rostrale naar de middenhersenen. De thalamus heeft een bolvorm en ziet er iets donkerder uit dan het omliggende weefsel.
3. Post-dissectie
- Bewaar na afloop van de dissectie weefselmonsters goed voor latere analyses. Het weglaten van deze stap zal binnen slechts 20 minuten resulteren in significante autolyse en degradatie.
- Laat elk hersengebied intact op het moment van dissectie als structurele analyses zullen worden uitgevoerd, of gehakt de weefsels om een homogeen weefselmonster te maken voorafgaand aan conservering. De gemeenschappelijke methodes van de steekproefbehoud voor hersenenweefsels omvatten cryopreservation en chemische fixatie gebruikend crosslinking agenten15.
- Voor standaard laboratoriumtests (bijv. gen- of eiwitexpressie) moet u zich onderdompelen in vloeibare stikstof of oplossingen die genetisch materiaal stabiliseren vóór langdurige opslag bij -80 °C om handige en kosteneffectieve conserveringsmethoden te bieden.
- Als het handhaven van de weefselstructuur een prioriteit is, behoud dan hersenweefsels door middel van traditionele fixatiemethoden (bijv. met behulp van op aldehyde gebaseerde fixatieven om eiwitten te kruisen), zonder of met perfusie van het dier of orgaan van belang voorafgaand aan weefseldissectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie beschrijft voorbeelden van resultaten verkregen na de juiste extractie en dissectie van een 4 weken oud varkensbrein. Figuur 1 schetst de vorm van elk hersengebied voor gebruik als leidraad tijdens dissectie. Een deel van de hersenstam kan in de schedel achterblijven na verwijdering van het cerebellum (figuur 1B). Dit kan worden verwijderd tijdens het isoleren van het gewenste gebied van het cerebellum. Tabel 1 geeft het gemiddelde gewicht (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde) weer voor elk van de ontlede hersengebieden (n=5).
Figuur 1: Geëxtraheerd varkensbrein. Contouren van hersengebieden voor gebruik als leidraad tijdens dissectie. De getoonde regio's komen van de rechterhersenhelft. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Regio | Gewicht (g) | Sem |
| Heel varken* | 8.006 | 0.545 |
| Brainstem | 0.829 | 0.132 |
| Cerebellum | 5.929 | 0.137 |
| Middenhersenen | 0.376 | 0.047 |
| Hippocampus | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| Thalamus | 0.476 | 0.120 |
| mediale prefrontale cortex | 0.459 | 0.122 |
| *Gewicht gepresenteerd als kg |
Tabel 1: Gewichten van hersengebieden. Gemiddeld gewicht van de 4 weken oude varkenshersenen en elk ontleed hersengebied (n=5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven technieken zijn ontworpen voor varkens van ongeveer 4 weken oud. Het is van cruciaal belang om deze stappen onmiddellijk uit te voeren nadat het varken op humane wijze is geëuthanaseerd om ervoor te zorgen dat de integriteit van de hersenweefselstructuur behouden blijft, vooral bij het overwegen van latere biochemische assays. Het is handig om een atlas of vezel16 dissectiegidsen te gebruiken bij het eerste leren van de technieken. Het wordt aanbevolen dat de experimenteerder verschillende hersenextracties en dissecties oefent voordat monsters worden verkregen voor het verzamelen van gegevens. De moeilijkste stap is het verwijderen van de schedel. Deze stap zal gemakkelijker worden met ervaring, omdat het grotendeels uit de eerste hand oefening vereist om te weten waar op de schedel te zagen en wanneer de schedel is doorgesneden. Deze procedure is vergelijkbaar met die beschreven door Bassi et al.12, hoewel het niet de noodzaak vereist om een zeshoekig schedelvenster te maken en een visuele tutorial biedt over hoe de techniek uit te voeren.
Een beperking van deze techniek is dat het bij het werken met oudere varkens meer tijd kan kosten om de schedel te verwijderen omdat deze aanzienlijk dikker wordt met de leeftijd. Als het gebruik van een zaag te arbeidsintensief of ineffectief is voor dikkere schedels, kan het nodig zijn om een hamer en beitel te gebruiken, zoals die van Bjarkam et al.13,of aangedreven chirurgische apparatuur (bijv. botzaag). Bovendien zorgt deze techniek niet altijd voor het vangen van de olfactorische bollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Jim Knoblauch en Martin-Booth Hodges van het College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services erkennen voor hun expertise in het opnemen, opnemen en bewerken van audio en video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
