Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Technik zur Entfernung des Schweinehirns in seiner Gesamtheit und Diesektion mehrerer Hirnregionen, die häufig in der Neurowissenschaft untersucht werden.
Abstract
Die Verwendung des Schweins als präklinisches und übersetzbares Tiermodell wurde von Forschungsbereichen, die Herz-Kreislauf-Systeme, Magen-Darm-Systeme und Ernährung untersuchen, gut dokumentiert und akzeptiert, und das Schwein wird zunehmend als großes Tiermodell in der Neurowissenschaft eingesetzt. Darüber hinaus ist das Schwein ein akzeptiertes Modell, um Neuroentwicklung zu studieren, da es Gehirnwachstum und Entwicklungsmuster ähnlich dem zeigt, was beim Menschen vorkommt. Als weniger häufiges Tiermodell in der Neurowissenschaft sind chirurgische und sezierende Verfahren an Schweinen unter Forschern möglicherweise nicht so vertraut oder gut praktiziert. Daher kann sich ein standardisiertes visuelles Protokoll, das konsistente Extraktions- und Seziermethoden detailliert aufgibt, für Forscher, die mit dem Schwein arbeiten, als wertvoll erweisen. Das folgende Video zeigt eine Technik, um das Schweinehirn zu entfernen, während der Kortex und Hirnstamm intakt bleiben und überprüft Methoden, um mehrere häufig untersuchte Hirnregionen zu sezieren, einschließlich gehirnstem, Kleinhirn, Midbrain, Hippocampus, Striatum, Thalamus, und mediale präfrontale Kortex. Der Zweck dieses Videos ist es, Forschern die Werkzeuge und das Wissen zur Verfügung zu stellen, die notwendig sind, um konsequent eine Gehirnextraktion und -sektion am vier Wochen alten Schwein durchzuführen.
Introduction
Das Schwein wurde gut dokumentiert und als übersetzbares Tiermodell für die Forschung in Herz-Kreislauf-Systemen1, Magen-Darm-Systeme2, Ernährung3,4, Diabetes5, Toxikologie6und chirurgische Techniken7akzeptiert. Der Einsatz des Schweins in der Neurowissenschaft nimmt zu, da Die Suche nach den Schlüsselwörtern "Schweinehirn-Tiermodell" zu viermal mehr Ergebnissen aus den Jahren 1996-2005 führt als im vorangegangenen 10-Jahres-Zeitraum8, und derzeit noch mehr Ergebnisse. Ein Hauptgrund dafür, dass die Popularität des Schweinemodells wächst, ist aufgrund seiner Ähnlichkeiten in Wachstum, Struktur und Funktion des Gehirns im Vergleich zum Menschen. Im Vergleich zum menschlichen Gehirn weist das Schweinehirn eine ähnliche Kreisstrukturierung, Vaskularisation und Verteilung von grauer und weißer Materieauf 9. Darüber hinaus wurde das Schweinehirn in neuroimaging Verfahren verwendet, evoziert potenzielle Aufzeichnung, und bei der Etablierung von neurochirurgischen Techniken8,9. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen sponsert jedoch das perinatale Wachstum des Schweins und des Menschen im Gegensatz zu prä- oder postnatalen Wachstumsschüben. Bei der Geburt wiegen das Gehirn von Mensch und Schwein etwa 27 bzw. 25 Prozent seines Gehirngewichts für Erwachsene, verglichen mit dem Rattenhirn, das 12 Prozent seines Gehirngewichts für Erwachsene wiegt, und dem Rhesusaffenhirn mit 76 Prozent des Erwachsenengewichts10.
Ein Grund, warum das Schwein nur langsam als Tiermodell für die Neurowissenschaften angenommen wurde, ist, dass viele Forscher mit dem Tier in diesem Zusammenhang nicht vertraut sind. Die Forscher sind sich möglicherweise nicht seiner möglichen Verwendungen auf dem Gebiet bewusst oder kennen nicht die richtigen Techniken, die für die Verwendung eines solchen Modells erforderlich sind. Da die Verwendung des Schweins als biomedizinisches und präklinisches Modell Aufmerksamkeit und Anwendung in der Neurowissenschaft gewinnt, ist es notwendig, standardisierte Verfahren zur Gewebeentfernung festzulegen, um einen genauen Vergleich der Daten über Studien hinweg zu gewährleisten. Obwohl Sezieren und chirurgische Techniken mit dem Schweinehirn an anderer Stelle veröffentlicht wurden11,12,13, gibt es einen Bedarf an einfachen und standardisierten Protokollen, um Schweinehirngewebe zu sammeln, vor allem für den Einsatz in biochemischen Assays. Als solches ist das Ziel dieses Videos, das notwendige Wissen zur Verfügung zu stellen, damit Forscher eine standardisierte Gehirnextraktion und -sektion durchführen können. Dieses Video zeigt eine richtige Technik, um das Schweinehirn zu entfernen, während der Kortex und Hirnstamm intakt bleiben, und anschließend Methoden zu überprüfen, um mehrere wichtige Gehirnregionen zu sezieren.
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Protocol
Verfahren mit tierischen Gegenständen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Illinois at Urbana-Champaign genehmigt.
ANMERKUNG: Vor der Euthanasie das Schwein wurde durch intramuskuläre Injektion mit einer Kombination von Telazol:Ketamin:Xylazin (50,0 mg Tiletamiin HCl plus 50,0 mg Zolazepam HCl rekonstituierend mit 2,50 ml Ketamin HCl (100 g/L) und 2,50 ml Xylazin (100 g/L) verabreicht und mit 0,06 mg/kg BW verabreicht. Nach der Anästhesitherisation wurde das Schwein durch intrakardiale Verabreichung von Natriumpentobarbital eingeschläfert (390 mg/ml verabreicht bei 1 ml/5 kg BW). Für die Hirnsektion wird empfohlen, die Methode der Euthanasie auf der Grundlage des gewünschten analytischen Verfahrens des Gewebes zu wählen. Die Methode der Euthanasie sollte dem Gehirn so wenig Schaden wie möglich zufügen.
1. Extraktion des Schweinehirns
- Enthaupten Sie das Schwein nach humaner Euthanasie, indem Sie zwischen dem ersten und zweiten Wirbel (Atlas bzw. Achse) über den Nacken schneiden.
- Sichern Sie den Kopf in einer immobilisierten Bank Visier modifiziert, um Spikes enthalten. Stellen Sie sicher, dass der Kopf vollständig immobilisiert ist, bevor Sie fortfahren.
- Mit einem Skalpell, machen Sie einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels, die bis zum Hinterteil des Kopfes fortbesteht.
- Machen Sie einen zweiten (quer) Schnitt auf dem Hinterteil des Kopfes.
- Machen Sie einen dritten (quer) Schnitt am hinteren Ende der Schnis und in-line mit den Augen. Schneiden Sie die Haut so weit wie möglich vom Schädel entfernt, um einen einfachen Zugang zum Schädel zu gewährleisten.
- Mit einer Knochensäge, machen sie zwei vordere zu posterior Schnitte seitlich zur Mittellinie, die sich von den Augen bis zur Spitze der Schädelkrümmung erstrecken. Verschrägen Sie die Säge in Richtung der Mittellinie und schneiden Sie gerade tief genug, um den Schädel zu durchdringen.
- Wiederholen Sie den obigen Vorgang auf den senkrechten Seiten, wodurch ein rechteckiges "Fenster" im Schädel entsteht.
- Mit einem Fleischhaken, hebeln Sie den rechteckigen Abschnitt des Schädels ab. Beginnen Sie, indem Sie den Haken in eine der Ecken des Abschnitts legen und nach oben Druck ausüben, um das Schädelstück zu lockern. Achten Sie darauf, den Fleischhaken nur auf der Ebene des Schädels zu platzieren, um zu verhindern, dass versehentlich in das Gehirngewebe eindringt.
- Wenn Meningealschichten im Gehirn verbleiben, verwenden Sie Zangen und stumpfe Scheren (oder alternativ ein Skalpell), um die Schichten sanft zu entfernen, ohne in das Gehirn zu schneiden.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um Muskeln und Fett am hinteren Teil des Kopfes zu schneiden, den hinteren Teil des Schädels freizulegen.
- Machen Sie zwei Querschnitte entlang des Hinterteils des Schädels. Achten Sie darauf, nicht in Hirngewebe zu schneiden.
- Sichern Sie den Kopf, indem Sie eine feste Hand auf die Schnarbe legen und einen Rückwärtsdruck ausüben, um den hinteren Teil des Schädels abzuziehen, indem Sie das Kleinhirn freisetzen.
- Entfernen Sie den Kopf vom Bank-Laster und legen Sie ihn auf eine chirurgische Matte.
- Verwenden Sie ein langes schlankes Werkzeug, wie das stumpfe Ende eines Skalpells, um das Gehirn zu entfernen. Invertieren Sie den Kopf und verwenden Sie eine sanfte Schaufelbewegung, um das Gehirn aus der Schädelhöhle zu kataaxen, ohne die Oberfläche des Gehirns zu beschädigen.
HINWEIS: Es wird notwendig sein, Schädelnerven zu trennen, um das Gehirn zu entfernen. Tun Sie dies sanft und versuchen Sie nicht, das Gehirn gewaltsam herauszuziehen. Das Gehirn fällt von selbst aus, wenn es richtig und vollständig von Schädel und Wirbelsäule gelöst ist.
2. Zerlegung des Schweinehirns
HINWEIS: Es kann hilfreich sein, einen Hirnatlas oder eine Fasersektionsanleitung14 als visuelle Darstellung während der Seziervorgänge zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass sezierte Gewebeproben bei der Entfernung jeder Probe ordnungsgemäß gemäß den projektspezifischen Bedürfnissen gelagert werden (siehe unten). Bitte beachten Sie außerdem, dass für die Zwecke dieses Videos alle gezeigten Hirnregionen von der rechten Hemisphäre seziert wurden, dies jedoch je nach Labor aufgrund experimenteller Ziele unterschiedlich sein kann.
- Um den Hirnstamm (vorwiegend die Medulla) zu entfernen, machen Sie einen koronalen Schnitt kaudal zum Kleinhirn.
- Um das Kleinhirn zu entfernen, machen Sie einen koronalen Schnitt nach der Stelle des Kortex. Isolieren Sie die gewünschten Bereiche (z. B. Vermis, Flocculus usw.) des Kleinhirns aus dieser Probe. Achten Sie darauf, keine Teile des Hirnstamms in diese Probe aufzunehmen.
- Trennen Sie die beiden Hemisphären des Gehirns, indem Sie einen mittel-sagittalen Schnitt entlang der Längsspalte machen. Machen Sie diesen Schnitt als kontinuierliche Bewegung, um schäden am Kortex zu verhindern.
- Um das Mittelhirn zu entfernen, sezieren Sie eine gewünschte Menge an Gewebe nur ventral zu den überlegenen und minderwertigen Colliculi.
- Um den Hippocampus zu entfernen, legen Sie das stumpfe Ende eines Skalpells in den hinteren Teil des Corpus callosum und rollen Sie den Hippocampus sanft heraus, indem Sie eine "J"-Bewegung verwenden, die vom hinteren Teil des Corpus callosum ausgeht; ein ganzes Hippocampushorn ist 'bohnenförmig'.
- Das Striatum (hauptsächlich der Caudate-Kern wird gezeigt) ist ein grau-weißer materiestreifender Bereich direkt unterhalb des Corpus callosum und vor dem Hippocampus. Beschrägen Sie das Skalpell und entfernen Sie diese Region, offenbaren gestreiftes Gewebe bei der Entfernung.
- Um den medialen präfrontalen Kortex zu entfernen, sezieren Sie Gewebe vom frontalen Gyrus in den Corpus callosum, wodurch der medialste Teil dieses Abschnitts entfernt wird. Der rechte Kortex sollte nach der Entfernung des medialen präfrontalen Kortex erhalten bleiben.
- Um den Thalamus zu entfernen, entfernen Sie die birnenartige Struktur in der Mitte der mittelsagittalen Oberfläche des Gehirns und rostral zum Mittelhirn. Der Thalamus hat eine kugelförmige Form und sieht etwas dunkler aus als das umgebende Gewebe.
3. Nach-Sezierung
- Nach Abschluss der Zerlegung Gewebeproben für nachfolgende Analysen richtig aufbewahren. Das Weglassen dieses Schritts führt innerhalb von nur 20 Minuten zu einer signifikanten Autolyse und Verschlechterung.
- Lassen Sie jede Hirnregion zum Zeitpunkt der Zerlegung intakt, wenn Strukturanalysen durchgeführt werden, oder zerkleinern Sie das Gewebe, um eine homogene Gewebeprobe vor der Konservierung zu erstellen. Häufige Probenkonservierungsmethoden für Hirngewebe sind Kryokonservierung und chemische Fixierung mit Vernetzungsmitteln15.
- Für Standard-Labor-Assays (z. B. Gen- oder Proteinexpression) tauchen Sie in flüssigen Stickstoff oder Lösungen ein, die genetisches Material vor der Langzeitlagerung bei -80 °C stabilisieren, um bequeme und kostengünstige Konservierungsmethoden zu bieten.
- Wenn die Aufrechterhaltung der Gewebestruktur eine Priorität ist, bewahren Sie Hirngewebe durch traditionelle Fixierungsmethoden (z. B. Verwendung von aldehydbasierten Fixativen zum Vernetzen von Proteinen), entweder ohne oder mit Perfusion des Tieres oder des von Interesse sindden Organs vor der Gewebesektion.
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Representative Results
Dieser Abschnitt beschreibt Beispiele für Ergebnisse, die nach korrekter Extraktion und Zerlegung eines 4 Wochen alten Schweinehirns erzielt wurden. Abbildung 1 zeigt die Form jeder Hirnregion für die Verwendung als Leitfaden während der Zerlegung. Ein Teil des Hirnstamms kann nach Entfernung des Kleinhirns im Schädel verbleiben (Abbildung 1B). Dies kann entfernt werden, während der gewünschte Bereich des Kleinhirns isoliert wird. Tabelle 1 zeigt das Durchschnittsgewicht (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts) für jede der sezierten Hirnregionen (n=5).
Abbildung 1:Extrahiertes Schweinehirn. Umrisse von Hirnregionen zur Verwendung als Leitfaden während der Zerlegung. Die dargestellten Regionen stammen von der rechten Hemisphäre. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Region | Gewicht (g) | Sem |
| Ganzes Schwein* | 8.006 | 0.545 |
| Hirnstamm | 0.829 | 0.132 |
| Kleinhirn | 5.929 | 0.137 |
| Midbrain | 0.376 | 0.047 |
| Hippocampus | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| Thalamus | 0.476 | 0.120 |
| medialer Präfrontaler Cortex | 0.459 | 0.122 |
| *Gewicht als kg dargestellt |
Tabelle 1: Gewichte der Gehirnregionen. Durchschnittliches Gewicht des 4 Wochen alten Schweinehirns und jeder sezierten Hirnregion (n=5).
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Discussion
Die hier beschriebenen Techniken wurden für Schweine entwickelt, die etwa 4 Wochen alt sind. Es ist wichtig, diese Schritte sofort durchzuführen, nachdem das Schwein human eingeschläfert wurde, um sicherzustellen, dass die Integrität der Hirngewebestruktur erhalten bleibt, insbesondere wenn nachfolgende biochemische Tests in Betracht gezogen werden. Es ist hilfreich, einen Atlas oder Faser16 Sezieranleitungen zu verwenden, wenn sie zum ersten Mal die Techniken erlernen. Es wird empfohlen, dass der Experimentator mehrere Gehirnextraktionen und -sektionen vor der Beschaffung von Proben für die Datensammlung praktiziert. Der schwierigste Schritt ist die Entfernung des Schädels. Dieser Schritt wird mit der Erfahrung einfacher, da er weitgehend Übung aus erster Hand erfordert, um zu wissen, wo auf dem Schädel zu sägen und wann der Schädel durchgeschnitten wurde. Dieses Verfahren ähnelt dem von Bassi et al.12beschriebenen, obwohl es nicht die Notwendigkeit erfordert, ein sechseckige Sitchenfenster zu erstellen und bietet ein visuelles Tutorial, wie man die Technik ausführt.
Eine Einschränkung dieser Technik es, dass bei der Arbeit mit älteren Schweinen, kann es mehr Zeit dauern, um den Schädel zu entfernen, wie es mit dem Alter deutlich dicker wird. Wenn die Verwendung einer Säge zu mühsam oder unwirksam für dickere Schädel ist, kann es notwendig sein, entweder einen Hammer und Meißel zu verwenden, wie von Bjarkam et al.13gezeigt, oder angetriebene chirurgische Geräte (z. B. Knochensäge). Darüber hinaus gewährleistet diese Technik nicht immer die Erfassung der Olfaktor-Glühbirnen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen Jim Knoblauch und Martin-Booth Hodges vom College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services für ihre Expertise in den Bereichen Aufnahme, Aufnahme und Bearbeitung von Audio und Video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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