Summary
פרוטוקול זה מפרט את הטכניקה להסרת מוח החזיר בשלמותו וניתוח של מספר אזורי מוח הנחקרים בדרך כלל במדעי המוח.
Abstract
השימוש בחזיר כמודל חיה פרה-קליני ותרגום תועד היטב והתקבל על ידי תחומי מחקר החוקרים מערכות לב וכלי דם, מערכות במערכת העיכול ותזונה, והחזיר משמש יותר ויותר כמודל חיה גדול במדעי המוח. יתר על כן, החזיר הוא מודל מקובל ללמוד נוירו-פיתוח כפי שהוא מציג את צמיחת המוח ודפוסי התפתחות דומים למה שקורה בבני אדם. כמודל חיה פחות נפוץ במדעי המוח, ניתוח וניתוח הליכים על חזירים לא יכול להיות מוכר או מתורגל היטב בקרב החוקרים. לכן, פרוטוקול חזותי סטנדרטי המפרט שיטות מיצוי וניתוק עקביות עשוי להוכיח ערך לחוקרים העובדים עם החזיר. הסרטון הבא מציג טכניקה להסרת מוח החזיר תוך שמירה על קליפת המוח וגזע המוח ללא פגע וסוקר שיטות לנתח מספר אזורי מוח שנחקרו בדרך כלל, כולל גזע המוח, המוח הקטן, המוח התיכון, ההיפוקמפוס, הסטריאטום, התלמוס וקליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית. מטרת וידאו זה היא לספק לחוקרים את הכלים והידע הדרושים כדי לבצע באופן עקבי מיצוי המוח וניתוח על החזיר בן ארבעה שבועות.
Introduction
החזיר תועד היטב והתקבל כמודל חיה לתרגום למחקר במערכות לב וכלידם 1, מערכות במערכת העיכול2, תזונה3,4,סוכרת5, טוקסיקולוגיה6, וטכניקותכירורגיות 7. השימוש של החזיר במדעי המוח מתחיל לגדול, כמו PubMed מחפש את מילות המפתח "מודל בעלי חיים במוח החזירים" לגרום ארבע פעמים יותר תוצאות מ 1996-2005 מאשר בתקופה הקודמת 10 שנה8, ועוד יותר תוצאות כיום. הסיבה העיקרית לכך שהפופולריות של מודל החזיר מתרחבת נובעת מהדמיון שלו בצמיחה, במבנה ובתפקוד של המוח בהשוואה לבני אדם. בהשוואה למוח האנושי, מוח החזיר מציג דפוסים ג'יראליים דומים, כלי דם והפצה של חומר אפור ולבן9. יתר על כן, מוח החזיר שימש בהליכי דימות מוחי, עורר הקלטה פוטנציאלית, ובקביעת טכניקות נוירוכירורגיה8,9. שלא כמו מודלים אחרים של בעלי חיים, לעומת זאת, החזיר והאנושי חווים פרצי צמיחת מוח פרינטליים, בניגוד להתפרצויות גדילה לפני או אחרי הלידה. בלידה, המוח האנושי והחזירי שוקלים כ -27 ו -25 אחוז ממשקל המוח הבוגר שלהם, בהתאמה, בהשוואה למוח החולדה ששוקל 12 אחוז ממשקל המוח הבוגר שלו ולמוח קוף הרזוס ב -76 אחוז ממשקל הבוגר10.
אחת הסיבות לכך שהחזיר אומץ באיטיות כמודל חייתי למדעי המוח היא שחוקרים רבים אינם מכירים את החיה בהקשר זה. החוקרים עשויים שלא להיות מודעים לשימושים הפוטנציאליים שלה בתחום או לא יכול לדעת את הטכניקות הנכונות הנדרשות כדי להשתמש במודל כזה. כמו השימוש בחזיר כמודל ביו-רפואי פרה-קליפיני זוכה לתשומת לב ושימוש במדעי המוח, יש צורך לקבוע נהלים סטנדרטיים של הסרת רקמות כדי להבטיח השוואה מדויקת של נתונים על פני מחקרים. למרות ניתוח וטכניקות כירורגיות מעורבים המוח חזיר פורסמו במקומות אחרים11,12,13, יש צורך פרוטוקולים פשוטים סטנדרטיים כדי לאסוף רקמת מוח חזיר, במיוחד לשימוש מבחנים ביוכימיים. ככזה, המטרה של וידאו זה היא לספק את הידע הדרוש כדי לאפשר לחוקרים לבצע מיצוי מוח סטנדרטי וניתוח. וידאו זה ממחיש טכניקה נכונה אחת כדי להסיר את מוח החזיר תוך שמירה על קליפת המוח ואת גזע המוח שלם, ולאחר מכן לסקור שיטות לנתח כמה אזורי מוח מרכזיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים העוסקים בנושאים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין
הערה: לפני המתת חסד, החזיר היה מורדם באמצעות הזרקה תוך שרירית עם שילוב של טלזול:קטמין:xylazine (50.0 מ"ג של טילטמין HCl בתוספת 50.0 מ ג של zolazepam HCl מכון מחדש עם 2.50 מ"ל של קטמין HCl (100 גרם / L) ו 2.50 מ"ל של xylazine (100 גרם / L) ומנוהל ב 0.06 מ"ג / קילוגרם BW). לאחר שהורדם, החזיר היה מורדם באמצעות ניהול intracardiac של נתרן pentobarbital (390 מ"ג / מ"ל מנוהל ב 1 מ"ל / 5 ק"ג BW). עבור ניתוח המוח, מומלץ כי שיטת המתת חסד להיבחר בהתבסס על ההליך האנליטי הרצוי של הרקמה. שיטת המתת החסד אמורה לגרום לנזק מועט ככל האפשר למוח.
1. מיצוי מוח החזיר
- לאחר המתת חסד הומנית, ערפו את ראשו של החזיר על ידי חיתוך מעל עורף הצוואר, בין החוליה הראשונה והשנייה (אטלס וציר, בהתאמה).
- אבטחו את הראש בספסל משותק שונה כך שיכלול קוצים. ודא כי הראש משותק לחלוטין לפני שתמשיך.
- באמצעות אזמל, לעשות חתך קשת לאורך קו האמצע של הגולגולת שממשיך לחלק האחורי של הראש.
- הפוך חתך שני (רוחבי) על החלק האחורי של הראש.
- הפוך שלישי (רוחבי) לחתוך על הקצה האחורי של האף בשורה עם העיניים. חותכים את העור רחוק ככל האפשר מהגולגולת כדי להבטיח גישה קלה לגולגולת.
- באמצעות מסור עצם, לעשות שני חתכים מהקצה האחורי לרוחב לקו האמצע, המשתרע מהעיניים לשיא של עקמומיות הגולגולת. לרתק את המסור לכיוון קו האמצע ולחתוך רק עמוק מספיק כדי לחדור את הגולגולת.
- חזור על התהליך הנ"ל בצדדים הניצבים, יצירת "חלון" מלבני בגולגולת.
- באמצעות וו בשר, חטט את החלק המלבני של הגולגולת. התחל על ידי הצבת הוו לתוך אחת הפינות של החלק ולהפעיל לחץ כלפי מעלה כדי לשחרר את חתיכת הגולגולת. יש להקפיד למקם את וו הבשר רק ברמת הגולגולת כדי למנוע חדירה בשוגג של רקמת המוח.
- אם שכבות קרום המוח נשארות על המוח, השתמש במלקחיים ומספריים קהים (או לחילופין, אזמל) כדי להסיר בעדינות את השכבות מבלי לחתוך למוח.
- השתמש אזמל כדי לחתוך את השריר והשומן בחלק האחורי של הראש, חושף את החלק האחורי של הגולגולת.
- לעשות שני חתכים רוחביים לאורך החלק האחורי של הגולגולת. הקפד לא לחתוך לתוך רקמת המוח.
- לאבטח את הראש על ידי הנחת יד מוצקה על האף ולהפעיל לחץ לאחור כדי למשוך את החלק האחורי של הגולגולת, חושף את המוח הקטן.
- מוציאים את הראש מהספסל ומניחים על מחצלת כירורגית.
- השתמש בכלי דק ארוך, כגון הקצה הקהה של אזמל, כדי להסיר את המוח. הפוך את הראש והשתמש בתנועת סקופים עדינה כדי לפתות את המוח לצאת מחלל הגולגולת מבלי לפגוע בפני השטח של המוח.
הערה: יהיה צורך לנתק עצבי גולגולת כדי להסיר את המוח. עשו זאת בעדינות ואל תנסו למשוך בכוח את המוח החוצה. המוח ייפול מעצמו כאשר הוא מנותק לחלוטין מהגולגולת ומעמוד השדרה.
2. ניתוח מוח החזיר
הערה: זה עשוי להיות מועיל להשתמש אטלס במוח או מדריך ניתוח סיבים14 כייצוג חזותי במהלך הליכי ניתוח. ודא שדגימות רקמה מנותח מאוחסנות כראוי בהתאם לצרכים הספציפיים לפרויקט בעת הסרת כל דגימה (המתוארת בפירוט רב יותר להלן). בנוסף, שים לב כי לצורך וידאו זה, כל אזורי המוח המוצגים נותחו מחצי הכדור הימני, אבל זה עשוי להיות שונה לכל מעבדה המבוססת על מטרות ניסיוניות.
- כדי להסיר את גזע המוח (בעיקר medulla), להפוך caudal לחתוך קורנל למוח הקטן.
- כדי להסיר את המוח הקטן, להפוך את החלק האחורי לחתוך קורנל לקליפת המוח. לבודד את האזורים הרצויים (למשל, vermis, flocculus, וכו ') של המוח הקטן מדגם זה. הקפד לא לכלול כל חלקים של גזע המוח במדגם זה.
- להפריד את שתי ההמיספרות של המוח על ידי ביצוע חתך באמצע קשת לאורך סדק האורך. הפוך את החתך הזה כתנועה רציפה כדי למנוע נזק לקליפת המוח.
- כדי להסיר את midbrain, לנתח כמות רצויה של רקמה רק גחוני קוליקולי מעולה ונחות.
- כדי להסיר את ההיפוקמפוס, מניחים את הקצה הקהה של אזמל בחלק האחורי של כפיס המוח ומגלגלים בעדינות את ההיפוקמפוס החוצה, באמצעות תנועת "J" החל מהחלק האחורי של כפיס המוח; קרן היפוקמפוס שלמה היא 'בצורת שעועית'.
- הסטריאטום (גרעין caudate מוצג בעיקר) הוא אזור אפור ולבן מפוספס חומר ממש מתחת לכוס המוח ואת אצטרורי ההיפוקמפוס. משופע את האזמל ולהסיר את האזור הזה, חושף רקמה מפוספסת בעת ההסרה.
- כדי להסיר את קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית, לנתח רקמה מהג'ירואים הקדמיים לכוס המוח הקורפוס, תוך הסרת החלק המדיאלי ביותר של סעיף זה. קליפת המוח הימנית צריכה להישאר לאחר הסרת קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית.
- כדי להסיר את התלמוס, להסיר את המבנה דמוי הנורה במרכז המשטח midsagittal של המוח rostral כדי midbrain. התלמוס יש צורה כדורית ייראה מעט כהה יותר מאשר הרקמה שמסביב.
3. לאחר הניתוח
- עם השלמת הניתוח, לשמר דגימות רקמה כראוי לניתוחים הבאים. השמטת שלב זה תגרום לאוקוליזה והשפלה משמעותיות בתוך 20 דקות בלבד.
- השאר כל אזור במוח שלם בזמן הניתוח אם יתבצעו ניתוחים מבניים, או טחן את הרקמות כדי ליצור דגימת רקמה הומוגנית לפני השימור. שיטות שימור מדגם נפוצות עבור רקמות המוח כוללות cryopreservation וקיבעון כימי באמצעות סוכני crosslinking15.
- לתרגילי מעבדה סטנדרטיים (למשל, ביטוי גנים או חלבונים), יש לטבול בחנקן נוזלי או בפתרונות המייצבים חומר גנטי לפני אחסון ארוך טווח ב-80°C (80°C) כדי לספק שיטות שימור נוחות וחסכוניות.
- אם שמירה על מבנה הרקמות היא בראש סדר העדיפויות, לשמר את רקמות המוח באמצעות שיטות קיבוע מסורתיות (למשל, באמצעות קיבועים מבוססי אלדהיד כדי crosslink חלבונים), ללא או עם זלוף של החיה או איבר של עניין לפני ניתוח רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מתאר דוגמאות של תוצאות שהושגו לאחר מיצוי נכון וניתוח של מוח חזיר בן 4 שבועות. איור 1 מתאר את הצורה של כל אזור במוח לשימוש כקו עזר במהלך הניתוח. חלק מגזע המוח עשוי להישאר בגולגולת לאחר הסרת המוח הקטן(איור 1B). זה יכול להיות מוסר תוך בידוד האזור הרצוי של המוח הקטן. טבלה 1 מציגה את המשקל הממוצע (כלומר ± שגיאת תקן של הממוצע) עבור כל אחד מאזורי המוח המנותחים (n= 5).
איור 1: מוח חזיר שחולץ. קווי מתאר של אזורי מוח לשימוש כמדריך במהלך הניתוח. האזורים המוצגים הם מחצי הכדור הימני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| אזור | משקל (ז) | Sem |
| חזיר שלם* | 8.006 | 0.545 |
| גזע המוח | 0.829 | 0.132 |
| המוח הקטן | 5.929 | 0.137 |
| מידברין | 0.376 | 0.047 |
| ההיפוקמפוס | 0.500 | 0.051 |
| סטריאום (סטריאטום) | 0.410 | 0.115 |
| התלמוס (תלמוס) | 0.476 | 0.120 |
| קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית | 0.459 | 0.122 |
| *משקל מוצג כק"ג |
טבלה 1: משקולות אזורי המוח. המשקל הממוצע של מוח החזיר בן 4 השבועות וכל אזור מוח מנותח (n = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקות המתוארות בזאת עוצבו עבור חזירים כ 4 שבועות של גיל. זה קריטי לבצע שלבים אלה מיד לאחר החזיר כבר מורדם באופן אנושי כדי להבטיח את השלמות של מבנה רקמת המוח נשמר, במיוחד כאשר בוחנים מבחנים ביוכימיים הבאים. זה מועיל להשתמש אטלס או סיבים16 מדריכי ניתוח כאשר הראשון ללמוד את הטכניקות. מומלץ כי הנסיין לתרגל כמה עקירות מוח ו dissections לפני קבלת דגימות לאיסוף נתונים. הצעד הקשה ביותר הוא הסרת הגולגולת. שלב זה יהיה קל יותר עם ניסיון כפי שהוא דורש בעיקר תרגול ממקור ראשון כדי לדעת איפה על הגולגולת כדי לראות ומתי הגולגולת נחתכה דרך. הליך זה דומה לזה המתואר על ידי Bassi et al.12, אם כי זה אינו דורש את הצורך ליצור חלון גולגולת משושה ומספק הדרכה חזותית כיצד לבצע את הטכניקה.
מגבלה של טכניקה זו זה כי בעת עבודה עם חזירים מבוגרים, זה עלול לקחת יותר זמן כדי להסיר את הגולגולת כפי שהוא הופך להיות עבה באופן משמעותי עם הגיל. אם השימוש במסור הוא מייגע מדי או לא יעיל עבור גולגולות עבות יותר, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בפטיש ואזמל, כמו זה המוצג על ידי Bjarkam et al.13, או ציוד כירורגי מופעל (למשל, מסור עצם). יתר על כן, טכניקה זו לא תמיד להבטיח את לכידת נורות חוש הריח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר ג'ים Knoblauch ומרטין-בות הודג'ס של המכללה לחקלאות, הצרכן ומדעי הסביבה טכנולוגיית מידע ושירותי תקשורת על המומחיות שלהם ירי, הקלטה, ועריכה אודיו ווידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
