Summary
यह प्रोटोकॉल आमतौर पर तंत्रिका विज्ञान में अध्ययन किए गए कई मस्तिष्क क्षेत्रों की संपूर्णता और विच्छेदन में सुअर मस्तिष्क को हटाने की तकनीक का विवरण देता है।
Abstract
एक पूर्व नैदानिक और अनुवादयोग्य पशु मॉडल के रूप में सुअर का उपयोग अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है और हृदय प्रणालियों, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिस्टम, और पोषण की जांच अनुसंधान क्षेत्रों द्वारा स्वीकार किए जाते हैं, और सुअर तेजी से तंत्रिका विज्ञान में एक बड़े पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है । इसके अलावा, सुअर न्यूरोडेवलपमेंट का अध्ययन करने के लिए एक स्वीकार्य मॉडल है क्योंकि यह मनुष्यों में होने वाले मस्तिष्क के विकास और विकास पैटर्न को प्रदर्शित करता है। तंत्रिका विज्ञान में एक कम आम पशु मॉडल के रूप में, सूअरों पर शल्य चिकित्सा और विच्छेदन प्रक्रियाओं के रूप में परिचित या अच्छी तरह से शोधकर्ताओं के बीच अभ्यास नहीं किया जा सकता है । इसलिए, एक मानकीकृत दृश्य प्रोटोकॉल लगातार निष्कर्षण और विच्छेदन विधियों का ब्यौरा सुअर के साथ काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान साबित हो सकता है । निम्नलिखित वीडियो में कॉर्टेक्स और ब्रेनस्टेम को बरकरार रखते हुए सुअर मस्तिष्क को हटाने की तकनीक प्रदर्शित की गई है और ब्रेनस्टेम, सेरिबैलम, मिडब्रेन, हिप्पोकैम्पस, स्ट्राटम, थैलेसीमिया और मध्यपूर्व प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स सहित कई आमतौर पर जांच किए जाने वाले मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदन करने के तरीकों की समीक्षा की जाती है। इस वीडियो का उद्देश्य शोधकर्ताओं को चार सप्ताह पुराने सुअर पर लगातार मस्तिष्क निष्कर्षण और विच्छेदन करने के लिए आवश्यक उपकरण और ज्ञान प्रदान करना है।
Introduction
सुअर को हृदय प्रणालियों 1 , गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिस्टम2, पोषण3,4, मधुमेह5,विष विज्ञान 6 और शल्य चिकित्सातकनीकोंमें अनुसंधान के लिए एक अनुवादयोग्य पशु मॉडल के रूप में अच्छीतरहसे प्रलेखित और स्वीकार किया गयाहै। तंत्रिका विज्ञान में सुअर का उपयोग बढ़ने लगा है, क्योंकि कीवर्ड "सूअर मस्तिष्क पशु मॉडल" के लिए PubMed खोजों के परिणामस्वरूप पिछले 10 वर्ष की अवधि8की तुलना में 1996-2005 से चार गुना अधिक परिणाम होते हैं, और वर्तमान में और भी अधिक परिणाम होते हैं। एक प्राथमिक कारण है कि सुअर मॉडल की लोकप्रियता का विस्तार हो रहा है विकास, संरचना में अपनी समानताओं के कारण है, और मस्तिष्क के कार्य जब मनुष्यों के साथ तुलना में । मानव मस्तिष्क की तुलना में, सुअर मस्तिष्क इसी तरह के जाइरल पैटर्निंग, संवहनी और ग्रे और सफेद पदार्थ9के वितरण को प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, सुअर मस्तिष्क का उपयोग न्यूरोइमेजिंग प्रक्रियाओं में किया गया है, संभावित रिकॉर्डिंग पैदा की गई है, और न्यूरोसर्जरी तकनीकों की स्थापना में8,9। अन्य पशु मॉडलों के विपरीत, हालांकि, सुअर और मानव अनुभव प्रसवकालीन मस्तिष्क विकास में तेजी आती है, जैसा कि पूर्व या प्रसव के बाद की वृद्धि के विपरीत तेजी से होता है। जन्म के समय, मानव और सुअर मस्तिष्क का वजन क्रमशः उनके वयस्क मस्तिष्क के वजन का लगभग 27 और 25 प्रतिशत है, चूहे के मस्तिष्क की तुलना में जो अपने वयस्क मस्तिष्क के वजन का 12 प्रतिशत और वयस्क वजन10के ७६ प्रतिशत पर रीसस बंदर मस्तिष्क का वजन करता है ।
एक कारण सुअर केवल धीरे से तंत्रिका विज्ञान के लिए एक पशु मॉडल के रूप में अपनाया गया है क्योंकि कई शोधकर्ताओं ने इस संदर्भ में जानवर के साथ अपरिचित हैं । शोधकर्ताओं को क्षेत्र में इसके संभावित उपयोगों के बारे में पता नहीं हो सकता है या इस तरह के एक मॉडल का उपयोग करने के लिए आवश्यक उचित तकनीकों पता नहीं हो सकता है । एक जैव चिकित्सा और पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में सुअर के उपयोग के रूप में ध्यान और तंत्रिका विज्ञान में उपयोग लाभ, यह अध्ययन भर में डेटा की सटीक तुलना सुनिश्चित करने के लिए ऊतक हटाने की मानकीकृत प्रक्रियाओं को स्थापित करने के लिए आवश्यक है । यद्यपि सुअर मस्तिष्क को शामिल करने वाली विच्छेदन और शल्य चिकित्सा तकनीकों को कहीं और प्रकाशित किया गया है11,12,13,विशेष रूप से जैव रासायनिक परख में उपयोग के लिए सुअर मस्तिष्क के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए सरल और मानकीकृत प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। जैसे, इस वीडियो का उद्देश्य शोधकर्ताओं को एक मानकीकृत मस्तिष्क निष्कर्षण और विच्छेदन करने की अनुमति देने के लिए आवश्यक ज्ञान प्रदान करना है। यह वीडियो कॉर्टेक्स और ब्रेनस्टेम को बरकरार रखते हुए सुअर मस्तिष्क को हटाने के लिए एक उचित तकनीक दिखाता है, और बाद में कई प्रमुख मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदन करने के तरीकों की समीक्षा करता है।
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Protocol
उर्बाना-चंपावन में इलिनोइस विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई है
नोट: इच्छामृत्यु से पहले, सुअर को इंटाजोल के संयोजन के साथ इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के माध्यम से एनेस्थेटाइज्ड किया गया था: केटामाइन: जाइलाज़ीन (50.0 मिलीग्राम टिलेटामाइन एचसीएल प्लस 50.0 मिलीग्राम जोलाज़ेपम एचसीएल पुनर्गठन केटामाइन एचसीएल (100 ग्राम/एल) के 2.50 एमएल और 2.50 एमएल जाइलाज़ीन (100 ग्राम/एल) के साथ और 0.06 मिलीग्राम/किलो बीडब्ल्यू पर प्रशासित) के साथ। एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद सुअर को सोडियम पेंटोबार्बिटल (390 मिलीग्राम/एमएल 1 एमएल/5 किलो बीडब्ल्यू) पर प्रशासित इंट्राकार्डिएक प्रशासन के माध्यम से इच्छामृत्यु दी गई थी। मस्तिष्क विच्छेदन के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि इच्छामृत्यु की विधि ऊतक की वांछित विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के आधार पर चुनी जाए। इच्छामृत्यु की विधि संभव के रूप में मस्तिष्क को थोड़ा नुकसान के रूप में कारण होना चाहिए।
1. सुअर मस्तिष्क की निकासी
- मानवीय इच्छामृत्यु के बाद, गर्दन के नाप से ऊपर काटकर सुअर को काटें, पहले और दूसरे कशेरुका (एटलस और धुरी, क्रमशः) के बीच।
- स्पाइक्स को शामिल करने के लिए संशोधित एक स्थिर बेंच शिकंजा में सिर को सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले सिर पूरी तरह से स्थिर है।
- एक स्केलपेल का उपयोग करके, खोपड़ी के मिडलाइन के साथ एक धनुली कटौती करें जो सिर के पीछे जारी है।
- सिर के पीछे पर एक दूसरा (ट्रांसवर्स) कट बना लें।
- थूथन के पीछे के छोर पर और आंखों के साथ इन-लाइन पर एक तिहाई (ट्रांसवर्स) कट करें। खोपड़ी तक आसान पहुंच सुनिश्चित करने के लिए जितना संभव हो सके खोपड़ी से दूर त्वचा को काटें।
- एक हड्डी का उपयोग करना, दो पूर्वकाल से पीछे की कटौती को मिडलाइन तक पार्श्व बनाएं, जो आंखों से खोपड़ी वक्रता के शीर्ष तक फैली हुई है। बेवेल मिडलाइन की ओर देखा और खोपड़ी घुसना करने के लिए बस काफी गहरी कटौती।
- ऊपर की ओर से उपरोक्त प्रक्रिया दोहराएं, खोपड़ी में आयताकार "खिड़की" बनाते हैं।
- एक मांस हुक का उपयोग करना, खोपड़ी के आयताकार खंड को बंद कर दें। अनुभाग के कोनों में से एक में हुक रखकर शुरू करें और खोपड़ी के टुकड़े को ढीला करने के लिए ऊपर की ओर दबाव लागू करें। ध्यान रखें कि मांस हुक को केवल खोपड़ी के स्तर पर रखें ताकि अनजाने में मस्तिष्क के ऊतकों को मर्मज्ञ होने से रोका जा सके।
- यदि मस्तिष्क पर कोई मेनिंगियल परतें रहती हैं, तो मस्तिष्क में काटने के बिना परतों को धीरे-धीरे हटाने के लिए संदंश और कुंद कैंची (या वैकल्पिक रूप से, एक स्केलपेल) का उपयोग करें।
- खोपड़ी के पीछे के हिस्से को उजागर करते हुए सिर के पीछे के हिस्से में मांसपेशियों और वसा को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें।
- खोपड़ी के पीछे के साथ दो ट्रांसवर्स कट्स बनाएं। सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क के ऊतकों में कटौती न करें।
- स्नाउट पर एक फर्म हाथ रखकर सिर को सुरक्षित करें और खोपड़ी के पीछे के हिस्से को खींचने के लिए पीछे की ओर दबाव लागू करें, जिससे सेरिबैलम को उजागर किया जा सके।
- पीठ वाइस से सिर निकालें और एक सर्जिकल चटाई पर जगह है।
- मस्तिष्क को हटाने के लिए एक लंबे पतले उपकरण का उपयोग करें, जैसे कि स्केलपेल का कुंद अंत। सिर को उलटा करें और मस्तिष्क की सतह को नुकसान पहुंचाए बिना खोपड़ी गुहा से मस्तिष्क को मनाना करने के लिए एक सौम्य स्कूपिंग गति का उपयोग करें।
नोट: मस्तिष्क को हटाने के लिए कपाल नसों को तोड़ना आवश्यक होगा। ऐसा धीरे-धीरे करें और जबरदस्ती दिमाग को बाहर निकालने का प्रयास न करें। मस्तिष्क अपने आप बाहर गिर जाएगा जब यह ठीक से और पूरी तरह से खोपड़ी और रीढ़ की हड्डी से अलग है ।
2. सुअर मस्तिष्क का विच्छेदन
नोट: विच्छेदन प्रक्रियाओं के दौरान एक दृश्य प्रतिनिधित्व के रूप में मस्तिष्क एटलस या फाइबर विच्छेदन गाइड14 का उपयोग करना उपयोगी हो सकता है। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूने को हटाने पर परियोजना-विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार विच्छेदित ऊतक नमूनों को ठीक से संग्रहीत किया जाता है (नीचे अधिक विस्तार से वर्णित)। इसके अतिरिक्त, कृपया ध्यान दें कि इस वीडियो के प्रयोजनों के लिए, दिखाए गए सभी मस्तिष्क क्षेत्रों को सही गोलार्द्ध से विच्छेदित किया गया था, लेकिन यह प्रयोगात्मक उद्देश्यों के आधार पर प्रयोगशाला के अनुसार भिन्न हो सकता है।
- ब्रेनस्टेम (मुख्य रूप से मेडुला) को हटाने के लिए, सेरिबैलम को कोरोनल कट कौडल बनाएं।
- सेरिबैलम को हटाने के लिए, कॉर्टेक्स के पीछे एक कोरोनल कट बनाएं। इस नमूने से सेरिबैलम के वांछित क्षेत्रों (जैसे, वर्मिस, फ्लोकुलस, आदि) को अलग करें। सुनिश्चित करें कि इस नमूने में मस्तिष्क स्टेम के किसी भी हिस्से को शामिल न करें।
- अनुदैर्ध्य फिशर के साथ मध्य सैगिटल कट बनाकर मस्तिष्क के दो गोलार्द्धों को अलग करें। कॉर्टेक्स को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए इस कट को निरंतर गति के रूप में बनाएं।
- मिडब्रेन को हटाने के लिए, ऊतक की एक वांछित मात्रा को बेहतर और अवर कोलिकुली में सिर्फ वेंट्रल को काटना।
- हिप्पोकैम्पस को हटाने के लिए, कॉर्पस कैलोसम के पीछे के हिस्से में एक स्केलपेल के कुंद अंत को रखें और धीरे-धीरे हिप्पोकैम्पस को रोल आउट करें, कॉर्पस कैलोसम के पीछे के हिस्से से शुरू होने वाली "जे" गति का उपयोग करके; एक संपूर्ण हिप्पोकैम्पल सींग 'बीन के आकार का' है।
- स्ट्राटम (कॉडेट न्यूक्लियस मुख्य रूप से दिखाया गया है) कॉरपस कैलोसम और हिप्पोकैम्पस के पूर्वकाल के ठीक नीचे एक ग्रे और सफेद पदार्थ धारीदार क्षेत्र है। स्केलपेल को छोड़ दें और इस क्षेत्र को हटा दें, हटाने पर स्ट्रेटेड ऊतक का खुलासा करें।
- मध्यकालीन प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स को हटाने के लिए, ललाट जाइरस से कॉर्पस कैलोसम तक ऊतक को काटना, उस खंड के सबसे मध्यीय भाग को हटाना। एंडिल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स को हटाने के बाद सही कॉर्टेक्स रहना चाहिए।
- थैलेसीमिया को दूर करने के लिए, मस्तिष्क की मिडसगिटटल सतह के केंद्र में बल्ब जैसी संरचना को हटा दें और मिडब्रेन को रोस्ट्रल करें। थैलेसीमिया का आकार गोलाकार होता है और यह आसपास के ऊतकों की तुलना में थोड़ा गहरा दिखेगा।
3. विच्छेदन के बाद
- विच्छेदन के पूरा होने पर, बाद के विश्लेषण के लिए ऊतक के नमूनों को ठीक से संरक्षित करें। इस कदम की चूक के रूप में छोटे रूप में 20 मिनट के भीतर महत्वपूर्ण ऑटोलिसिस और गिरावट में परिणाम होगा ।
- विच्छेदन के समय प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र को बरकरार छोड़ दें यदि संरचनात्मक विश्लेषण किए जाएंगे, या संरक्षण से पहले एक समरूप ऊतक नमूना बनाने के लिए ऊतकों कीमा बनाएं। मस्तिष्क के ऊतकों के लिए सामान्य नमूना संरक्षण विधियों में क्रॉसलिंकिंगएजेंटोंका उपयोग करके क्रायोप्रिजर्वेशन और रासायनिक निर्धारण शामिल हैं ।
- मानक प्रयोगशाला परख (जैसे, जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति) के लिए, तरल नाइट्रोजन या समाधानों में विसर्जित हो जाते हैं जो सुविधाजनक और लागत प्रभावी संरक्षण विधियों को प्रदान करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण से पहले आनुवंशिक सामग्री को स्थिर करते हैं।
- यदि ऊतक संरचना को बनाए रखना एक प्राथमिकता है, तो पारंपरिक निर्धारण विधियों के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों को संरक्षित करें (उदाहरण के लिए, प्रोटीन को क्रॉसलिंक करने के लिए एल्डिहाइड-आधारित फिक्सेटिव का उपयोग करके), ऊतक विच्छेदन से पहले जानवर या ब्याज के अंग के परफ्यूजन के बिना या साथ।
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Representative Results
यह खंड 4 सप्ताह पुराने सुअर मस्तिष्क के सही निष्कर्षण और विच्छेदन के बाद प्राप्त परिणामों के उदाहरणों का वर्णन करता है। चित्रा 1 विच्छेदन के दौरान एक गाइड के रूप में उपयोग के लिए प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र के आकार को रेखांकित करता है। ब्रेनस्टेम का एक हिस्सा सेरिबैलम(चित्रा 1B)को हटाने के बाद खोपड़ी में रह सकता है। सेरिबैलम के वांछित क्षेत्र को अलग करते समय इसे हटाया जा सकता है। तालिका 1 प्रत्येक विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों (एन = 5) के लिए औसत वजन (मतलब ± मतलब की मानक त्रुटि) प्रदर्शित करता है।
चित्रा 1:निकाले गए सुअर मस्तिष्क। विच्छेदन के दौरान एक गाइड के रूप में उपयोग के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों की रूपरेखा। दिखाए गए क्षेत्र सही गोलार्द्ध से हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| क्षेत्र | वजन (जी) | एसईएम |
| पूरे सुअर * | 8.006 | 0.545 |
| ब्रेनस्टेम | 0.829 | 0.132 |
| अनुमस्तिष्क | 5.929 | 0.137 |
| मिडब्रेन | 0.376 | 0.047 |
| हिप्पोकैम्पस | 0.500 | 0.051 |
| स्ट्राटम | 0.410 | 0.115 |
| थैलेसीमिया | 0.476 | 0.120 |
| मध्यपूर्व प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स | 0.459 | 0.122 |
| * वजन के रूप में प्रस्तुत किया गया |
तालिका 1: मस्तिष्क क्षेत्रों वजन। 4 सप्ताह पुराने सुअर मस्तिष्क और प्रत्येक विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्र (n = 5) का औसत वजन ।
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Discussion
यहां वर्णित तकनीकों को लगभग 4 सप्ताह की उम्र के सूअरों के लिए डिजाइन किया गया था। यह इन कदमों को तुरंत करने के बाद सुअर मानवीय रूप से मस्तिष्क ऊतक संरचना की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए इच्छामृत्यु किया गया है महत्वपूर्ण है, खासकर जब बाद में जैव रासायनिक परख पर विचार । यह पहली बार तकनीक सीखने पर एटलस या फाइबर16 विच्छेदन गाइड का उपयोग करने के लिए उपयोगी है। यह सिफारिश की जाती है कि प्रयोगकर्ता डेटा संग्रह के लिए नमूने प्राप्त करने से पहले कई मस्तिष्क निष्कर्षण और विच्छेदन का अभ्यास करता है। सबसे कठिन कदम खोपड़ी को हटाना है। यह कदम अनुभव के साथ आसान हो जाएगा क्योंकि यह काफी हद तक firsthand अभ्यास की आवश्यकता को पता है, जहां खोपड़ी पर देखा और जब खोपड़ी के माध्यम से काट दिया गया है । यह प्रक्रिया बस्सी एट अल12द्वारा वर्णित के समान है, हालांकि इसके लिए हेक्सागोनल कपाल खिड़की बनाने की आवश्यकता नहीं है और तकनीक को करने के तरीके का एक दृश्य ट्यूटोरियल प्रदान करता है।
इस तकनीक की एक सीमा यह है कि जब पुराने सूअरों के साथ काम कर रहे हैं, तो खोपड़ी को हटाने में अधिक समय लग सकता है क्योंकि यह उम्र के साथ काफी मोटा हो जाता है। यदि एक आरी का उपयोग करना बहुत श्रमसाध्य है या मोटा खोपड़ी के लिए अप्रभावी है, तो या तो हथौड़ा और छेनी का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है, जैसे कि Bjarkam एट अल द्वारा दिखाया गया है।13,या संचालित सर्जिकल उपकरण (जैसे, हड्डी देखा)। इसके अलावा, यह तकनीक हमेशा घ्राण बल्बों का कब्जा सुनिश्चित नहीं करती है।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखकों को शूटिंग, रिकॉर्डिंग, और संपादन ऑडियो और वीडियो में अपनी विशेषज्ञता के लिए कृषि, उपभोक्ता और पर्यावरण विज्ञान सूचना प्रौद्योगिकी और संचार सेवाओं के कॉलेज के जिम Knoblauch और मार्टिन बूथ Hodges स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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