Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio la tecnica per la rimozione del cervello dei suini nella sua interezza e la dissezione di diverse regioni cerebrali comunemente studiate nelle neuroscienze.
Abstract
L'uso del maiale come modello animale preclinico e traducibile è stato ben documentato e accettato dai campi di ricerca che studiano i sistemi cardiovascolari, i sistemi gastrointestinali e l'alimentazione, e il maiale viene sempre più utilizzato come un grande modello animale nelle neuroscienze. Inoltre, il maiale è un modello accettato per studiare il neurosviluppo in quanto mostra modelli di crescita e sviluppo cerebrali simili a quelli che si verificano negli esseri umani. Come modello animale meno comune nelle neuroscienze, le procedure chirurgiche e di dissezione sui suini potrebbero non essere così familiari o ben praticate tra i ricercatori. Pertanto, un protocollo visivo standardizzato che dettaglia metodi di estrazione e dissezione coerenti può rivelarsi prezioso per i ricercatori che lavorano con il maiale. Il seguente video mostra una tecnica per rimuovere il cervello del maiale mantenendo intatta la corteccia e il tronco encefalico e esamina i metodi per sezionare diverse regioni cerebrali comunemente studiate tra cui tronco encefalico, cervelletto, mesencefalo, ippocampo, striato, talamo e corteccia prefrontale mediale. Lo scopo di questo video è quello di fornire ai ricercatori gli strumenti e le conoscenze necessarie per eseguire costantemente un'estrazione e dissezione cerebrale sul maiale di quattro settimane.
Introduction
Il maiale è stato ben documentato e accettato come modello animale traducibile per la ricerca nei sistemicardiovascolari 1,sistemigastrointestinali 2,nutrizione 3,4,diabete5,tossicologia 6e tecniche chirurgiche7. L'uso del maiale nelle neuroscienze sta iniziando ad aumentare, poiché PubMed cerca le parole chiave "modello animale cerebrale suino" si traduce in risultati quattro volte superiori dal 1996 al 2005 rispetto al precedente periodo di 10anni 8e ancora più risultati al momento. Una ragione principale per cui la popolarità del modello di maiale si sta espandendo è dovuta alle sue somiglianze nella crescita, nella struttura e nella funzione del cervello rispetto agli esseri umani. Rispetto al cervello umano, il cervello dei maiali mostra modelli ginerali simili, vascolarizzazione e distribuzione della materia grigia e bianca9. Inoltre, il cervello dei suini è stato utilizzato nelle procedure di neuroimaging, ha evocato una potenziale registrazione e nella definizione di tecniche di neurochirurgia8,9. A differenza di altri modelli animali, tuttavia, il maiale e l'esperienza umana sperimentano spinte perinatale di crescita cerebrale, al contrario degli spurt di crescita pre o post-natale. Alla nascita, il cervello umano e suino pesa circa il 27 e il 25% del loro peso cerebrale adulto, rispettivamente, rispetto al cervello del topo che pesa il 12% del suo peso cerebrale adulto e al cervello della scimmia rhesus al 76% del peso adulto10.
Uno dei motivi per cui il maiale è stato adottato solo lentamente come modello animale per le neuroscienze è perché molti ricercatori non hanno familiarità con l'animale in questo contesto. I ricercatori potrebbero non essere consapevoli dei suoi potenziali usi sul campo o potrebbero non conoscere le tecniche appropriate necessarie per utilizzare tale modello. Poiché l'uso del maiale come modello biomedico e preclinico guadagna attenzione e uso nelle neuroscienze, è necessario stabilire procedure standardizzate di rimozione dei tessuti per garantire un confronto accurato dei dati tra gli studi. Sebbene la dissezione e le tecniche chirurgiche che coinvolgono il cervello dei suini siano state pubblicate altrove11,12,13, c'è bisogno di protocolli semplici e standardizzati per raccogliere il tessuto cerebrale dei suini, specialmente per l'uso in saggi biochimici. Come tale, lo scopo di questo video è quello di fornire le conoscenze necessarie per consentire ai ricercatori di eseguire un'estrazione e una dissezione del cervello standardizzate. Questo video illustra una tecnica corretta per rimuovere il cervello dei suini mantenendo intatta la corteccia e il tronco encefalico, e successivamente rivedere i metodi per sezionare diverse regioni cerebrali chiave.
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Protocol
Le procedure riguardanti materie animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign
NOTA: Prima dell'eutanasia, il maiale è stato anestetizzato mediante iniezione intramuscolare con una combinazione di telazolo:ketamina:xiazina (50,0 mg di tiletamina HCl più 50,0 mg di zolazepam HCl ricostituiti con 2,50 mL di ketamina HCl (100 g/L) e 2,50 mL di xiloazina (100 g/L) e somministrati a 0,06 mg/kg di BW). Una volta anestetizzato, il maiale è stato eutanasiato mediante somministrazione intracardiaca di pentobarbital di sodio (390 mg/mL somministrato a 1 mL/5 kg pc). Per la dissezione cerebrale, si raccomanda di scegliere il metodo di eutanasia in base alla procedura analitica desiderata del tessuto. Il metodo di eutanasia dovrebbe causare il meno danno possibile al cervello.
1. Estrazione del cervello di maiale
- A seguito dell'eutanasia umana, decapitare il maiale tagliando sopra la nuca, tra la prima e la seconda vertebra (rispettivamente atlante e asse).
- Fissare la testa in una morsa del banco immobilizzata modificata per includere punte. Assicurarsi che la testa sia completamente immobilizzata prima di procedere.
- Usando un bisturi, fai un taglio sagittale lungo la linea mediana del cranio che continua fino alla parte posteriore della testa.
- Fare un secondo taglio (trasversale) sul posteriore della testa.
- Fare un terzo taglio (trasversale) sull'estremità posteriore del muso e in linea con gli occhi. Tagliare la pelle il più lontano possibile dal cranio per garantire un facile accesso al cranio.
- Usando una sega ossea, fare due tagli anteriore-posteriore laterali alla linea mediana, che si estendono dagli occhi all'apice della curvatura del cranio. Smussare la sega verso la linea mediana e tagliare abbastanza in profondità da penetrare nel cranio.
- Ripeti il processo di cui sopra sui lati perpendicolari, creando una "finestra" rettangolare nel cranio.
- Usando un gancio di carne, indiscrere la sezione rettangolare del cranio. Iniziare posizionando il gancio in uno degli angoli della sezione e applicare la pressione verso l'alto per allentare il pezzo del cranio. Fare attenzione a posizionare il gancio di carne solo a livello del cranio per evitare di penetrare inavvertitamente nel tessuto cerebrale.
- Se alcuni strati meningei rimangono sul cervello, utilizzare forcep e forbici smussate (o in alternativa, un bisturi) per rimuovere delicatamente gli strati senza tagliare nel cervello.
- Usa un bisturi per tagliare muscoli e grasso nella parte posteriore della testa, esponendo la porzione posteriore del cranio.
- Fai due tagli trasversali lungo la parte posteriore del cranio. Assicurati di non tagliare il tessuto cerebrale.
- Fissare la testa posizionando una mano ferma sul muso e applicare una pressione all'indietro per estrarre la porzione posteriore del cranio, esponendo il cervelletto.
- Rimuovere la testa dalla morsa della panca e posizionarsi su un tappetino chirurgico.
- Utilizzare uno strumento lungo e sottile, come l'estremità smussata di un bisturi, per rimuovere il cervello. Invertire la testa e usare un delicato movimento di scooping per convincere il cervello fuori dalla cavità cranica senza danneggiare la superficie del cervello.
NOTA: Sarà necessario sever nervi cranici per rimuovere il cervello. Fallo delicatamente e non tentare di estrarre con forza il cervello. Il cervello cadrà da solo quando è correttamente e completamente staccato dal cranio e dalla colonna vertebrale.
2. Dissezione del cervello dei suini
NOTA: Può essere utile utilizzare un atlante cerebrale o una guida alla dissezione delle fibre14 come rappresentazione visiva durante le procedure di dissezione. Assicurarsi che i campioni di tessuto sezionati siano conservati correttamente in base alle esigenze specifiche del progetto al momento della rimozione di ciascun campione (descritto più dettagliatamente di seguito). Inoltre, si prega di notare che ai fini di questo video, tutte le regioni cerebrali mostrate sono state sezionate dall'emisfero destro, ma questo può differire per laboratorio in base agli obiettivi sperimentali.
- Per rimuovere il tronco encefalico (prevalentemente il midollo), fare un taglio coronale caudale al cervelletto.
- Per rimuovere il cervelletto, fare un taglio coronale posteriore alla corteccia. Isolare le regioni desiderate (ad esempio, vermi, flocculo, ecc.) del cervelletto da questo campione. Assicurati di non includere parti del tronco encefalico in questo campione.
- Separare i due emisferi del cervello facendo un taglio medio-sagittale lungo la fessura longitudinale. Fai questo taglio come movimento continuo per evitare di causare danni alla corteccia.
- Per rimuovere il midbrain, sezionare una quantità desiderata di tessuto appena ventrale ai collicoli superiori e inferiori.
- Per rimuovere l'ippocampo, posizionare l'estremità smussata di un bisturi nella parte posteriore del corpo calloso e far rotolare delicatamente fuori l'ippocampo, usando un movimento "J" a partire dalla porzione posteriore del corpo calloso; un intero corno ippocampale è "a forma di fagiolo".
- Lo striato (il nucleo caudato è mostrato principalmente) è una regione a strisce di materia grigia e bianca appena sotto il corpo calloso e anteriore all'ippocampo. Smussare il bisturi e rimuovere questa regione, rivelando il tessuto striato al momento della rimozione.
- Per rimuovere la corteccia prefrontale mediale, sezionare il tessuto dal giro frontale al corpo calloso, rimuovendo la porzione più mediale di quella sezione. La corteccia destra dovrebbe rimanere dopo la rimozione della corteccia prefrontale mediale.
- Per rimuovere il talamo, rimuovere la struttura simile a un bulbo al centro della superficie medio-agittale del cervello e rostrale al midbrain. Il talamo ha una forma sferica e avrà un aspetto leggermente più scuro del tessuto circostante.
3. Post-dissezione
- Al termine della dissezione, conservare correttamente i campioni di tessuto per le analisi successive. L'omissione di questo passaggio comporterà un'autolisi significativa e una degradazione entro soli 20 minuti.
- Lasciare intatta ogni regione cerebrale al momento della dissezione se verranno eseguite analisi strutturali o tritare i tessuti per creare un campione di tessuto omogeneo prima della conservazione. I metodi comuni di conservazione dei campioni per i tessuti cerebrali includono la crioconservazione e la fissazione chimica mediante agenti retiche15.
- Per i test di laboratorio standard (ad esempio, espressione genica o proteica), immergersi nell'azoto liquido o nelle soluzioni che stabilizzano il materiale genetico prima della conservazione a lungo termine a -80 °C per fornire metodi di conservazione convenienti ed economici.
- Se mantenere la struttura tissutale è una priorità, preservare i tessuti cerebrali attraverso i metodi di fissazione tradizionali (ad esempio, utilizzando fissanti a base di aldeide per collegare le proteine), senza o con perfusione dell'animale o dell'organo di interesse prima della dissezione tissutale.
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Representative Results
Questa sezione descrive esempi di risultati ottenuti dopo la corretta estrazione e dissezione di un cervello di maiale di 4 settimane. La figura 1 delinea la forma di ciascuna regione cerebrale da utilizzare come guida durante la dissezione. Parte del tronco encefalico può rimanere nel cranio dopo la rimozione del cervelletto (Figura 1B). Questo può essere rimosso isolando la regione desiderata del cervelletto. La tabella 1 mostra il peso medio (± errore standard della media) per ciascuna delle regioni cerebrali sezionate (n=5).
Figura 1: Cervello di maiale estratto. Contorni delle regioni cerebrali da utilizzare come guida durante la dissezione. Le regioni mostrate provengono dall'emisfero destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| regione | Peso (g) | Sem |
| Maiale intero* | 8.006 | 0.545 |
| Tronco encefalico | 0.829 | 0.132 |
| cervelletto | 5.929 | 0.137 |
| mesencefalo | 0.376 | 0.047 |
| ippocampo | 0.500 | 0.051 |
| Striato | 0.410 | 0.115 |
| talamo | 0.476 | 0.120 |
| Corteccia prefrontale mediale | 0.459 | 0.122 |
| *Peso presentato come kg |
Tabella 1: Pesi delle regioni cerebrali. Peso medio del cervello di maiale di 4 settimane e di ogni regione cerebrale sezionata (n=5).
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Discussion
Le tecniche descritte nel presente documento sono state progettate per i suini di circa 4 settimane di età. È fondamentale eseguire questi passaggi immediatamente dopo che il maiale è stato eutanasiato umanamente per garantire che l'integrità della struttura del tessuto cerebrale sia mantenuta, specialmente quando si considerano i successivi test biochimici. È utile utilizzare un atlante o guide alla dissezionein fibra 16 quando si imparano per la prima volta le tecniche. Si raccomanda allo sperimentatore di praticare diverse estrazioni cerebrali e dissezioni prima di ottenere campioni per la raccolta dei dati. Il passo più difficile è la rimozione del cranio. Questo passaggio diventerà più facile con l'esperienza in quanto richiede in gran parte una pratica diretta per sapere dove sul cranio vedere e quando il cranio è stato tagliato. Questa procedura è simile a quella descritta da Bassi etal.
Una limitazione di questa tecnica è che quando si lavora con maiali più anziani, potrebbe essere necessario più tempo per rimuovere il cranio man mano che diventa significativamente più spesso con l'età. Se l'uso di una sega ètroppolaborioso o inefficace per teschi più spessi, potrebbe essere necessario utilizzare un martello e uno scalpello, come quello mostrato da Bjarkam et al. Inoltre, questa tecnica non sempre garantisce la cattura dei bulbi olfattivi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero ringraziare Jim Knoblauch e Martin-Booth Hodges del College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services per la loro esperienza nelle riprese, nella registrazione e nell'editing di audio e video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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