Summary
このプロトコルは、神経科学で一般的に研究されているいくつかの脳領域の完全および解剖における豚の脳の除去のための技術を詳述する。
Abstract
前臨床および翻訳可能な動物モデルとしての豚の使用は、心血管系、胃腸系、栄養を調査する研究分野で十分に文書化され、受け入れられ、豚は神経科学における大型動物モデルとしてますます使用されています。さらに、豚は人間に起こることと同様の脳の成長と発達パターンを表示するので、神経発達を研究するために受け入れられたモデルです。神経科学のあまり一般的でない動物モデルとして、豚の外科的および解剖手順は、研究者の間でそれほど身近またはよく実践されていないかもしれません。したがって、一貫した抽出および解剖方法を詳述する標準化された視覚プロトコルは、豚と協力する研究者にとって価値があることを証明するかもしれない。次のビデオは、皮質と脳幹をそのまま維持しながら豚の脳を取り除く技術を紹介し、脳幹、小脳、中脳、海馬、線条体、視床、内側前頭前野を含むいくつかの一般的に調査された脳領域を解剖する方法をレビューしています。このビデオの目的は、研究者に一貫して4週齢の豚の脳抽出と解剖を行うために必要なツールと知識を提供することです。
Introduction
豚は十分に文書化され、心血管系1、胃腸系2、栄養3、4、糖尿病5、毒物学6、および外科技術7の研究のための翻訳可能な動物モデルとして受け入れられています。PubMedが「豚の脳動物モデル」というキーワードを検索すると、1996年から2005年にかけて、前の10年の期間8よりも4倍多くの結果が得られ、現在はさらに多くの結果が得られるため、神経科学における豚の使用は増加し始めています。豚モデルの人気が拡大している主な理由は、人間と比較した場合の脳の成長、構造、機能の類似性によるものです。人間の脳と比較して、豚の脳は同様のジャイラルパターニング、血管化および灰色および白色物質の分布を示す9.また、ブタ脳は、神経イメージング手順、電位記録を誘発し、脳神経外科技術8,9を確立する際に用いられている。しかし、他の動物モデルとは異なり、豚と人間の経験は、出生前または出生後の成長スパートとは対照的に、周産期脳の成長が噴出する。出生時に、人間と豚の脳は、成人の脳体重の12%、成人体重の76%のアカゲザル脳と比較して、それぞれ成人の脳体重の約27%と25%の重さである。
豚が神経科学の動物モデルとしてゆっくりと採用されている理由の1つは、多くの研究者がこの文脈で動物に精通していないからです。研究者は、現場での潜在的な用途を認識していないか、そのようなモデルを使用するために必要な適切な技術を知らないかもしれません。生物医学的および前臨床モデルとしての豚の使用が注目を集め、神経科学で使用されるように、研究間のデータの正確な比較を確実にするために組織除去の標準化された手順を確立する必要があります。ブタの脳を含む解剖と外科技術は他の場所で公開されています11,12,13,豚の脳組織を収集するための簡単で標準化されたプロトコルの必要性があります, 特に生化学的アッセイで使用するため.そのため、このビデオの目的は、研究者が標準化された脳抽出と解剖を行うために必要な知識を提供することです。このビデオは、皮質と脳幹をそのまま維持しながら豚の脳を除去する1つの適切な技術を示し、その後、いくつかの主要な脳領域を解剖する方法を見直す。
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Protocol
イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の施設動物管理・使用委員会(IACUC)によって動物の被験者に関する手続きが承認されました。
注:安楽死の前に、 豚は、テラゾールの組み合わせと筋肉内注射を介して麻酔された:ケタミン:キシラジン(50.0 mgのタイルタミンHClプラス50.0 mgのゾラゼパムHCl再構成 ケタミンHClの2.50 mL(100 g/L)および2.50 mLのキシラジン(100 g/L)で、0.06 mg/kg BWで投与した。麻酔が行われた後、ピグはペントバルビタールナトリウム(390mg/mLを1mL/5 kg BWで投与する)の心臓内投与を介して安楽死させた。脳の解剖のために、組織の所望の分析手順に基づいて安楽死の方法を選択することが推奨される。安楽死の方法は、脳にできるだけ少ない損傷を引き起こすはずです。
1. 豚の脳の抽出
- 人道的安楽死に続いて、首のうなじの上、第1椎骨と第2椎骨(それぞれアトラスと軸)の間で切断することによって豚の首を切断する。
- スパイクを含むように変更された固定化されたベンチバイスでヘッドを固定します。続行する前に、ヘッドが完全に固定されていることを確認してください。
- メスを使用して、頭の後部に続く頭蓋骨の正中線に沿って矢状のカットを行います。
- 頭の後部に2番目の(横)切り傷を加えてください。
- スナッの後端に3番目の(横)カットを行い、目に沿って行きます。頭蓋骨に簡単にアクセスできるように、頭蓋骨からできるだけ遠くに皮膚をカットします。
- 骨のこぎりを使用して、目から頭蓋骨の頂点まで伸びる2つの前部から後部への切り傷を正中線に向けて行う。中線に向かって鋸をベベルし、頭蓋骨を貫通するのに十分な深さをカットします。
- 垂直な側面で上記のプロセスを繰り返し、頭蓋骨に長方形の「窓」を作成します。
- 肉のフックを使用して、頭蓋骨の長方形のセクションを詮索。セクションのコーナーの1つにフックを置くことから始め、頭蓋骨の部分を緩めるために上向きの圧力を加えます。誤って脳組織を貫通するのを防ぐために、頭蓋骨のレベルにのみ肉のフックを置くように注意してください。
- 髄膜層が脳に残っている場合は、鉗子と鈍いはさみ(またはメス)を使用して、脳に切り込まずに優しく層を取り除きます。
- 頭の後部で筋肉と脂肪を切り取り、頭蓋骨の後部を露出させるためにメスを使用してください。
- 頭蓋骨の後部に沿って2つの横断カットを行います。脳組織に切り込まないで下るようにしてください。
- スナッズにしっかりと手を置いて頭を固定し、後方の圧力を加え、頭蓋骨の後部を引き離し、小脳を露出させます。
- ベンチの悪徳から頭を取り出し、外科用マットの上に置きます。
- 頭脳を取り除くために、メスの鈍い端のような長い細いツールを使用してください。頭を反転し、脳の表面を損傷することなく、頭蓋骨から脳を同化するために穏やかなスクープ運動を使用しています。
注:脳を取り除くために頭蓋神経を切断する必要があります。穏やかにそうし、強制的に脳を引き出そうとしないでください。脳は、頭蓋骨と背骨から適切かつ完全に切り離されると、単独で脱落します。
2. 豚の脳の解剖
注:解剖手順中の視覚表現として脳アトラスまたは繊維解剖ガイド14 を使用すると役に立つ場合がある。解剖された組織サンプルは、各サンプルの除去時にプロジェクト固有のニーズに応じて適切に保存されていることを確認してください(以下で詳しく説明)。さらに、このビデオの目的のために、示されたすべての脳領域は右半球から解剖されたが、これは実験目的に基づいて実験室によって異なるかもしれないことに注意してください。
- 脳幹(主に髄質)を取り除くために、小脳にコロナカット尾体を作る。
- 小脳を取り除くために、皮質の後部にコロナカットを作ります。このサンプルから小脳の所望の領域(例えば、ベルミ、フロックルなど)を分離する。このサンプルには脳幹の一部を含めないようにしてください。
- 縦方向の裂け目に沿って中矢状の切り取りを行うことによって、脳の2つの半球を分離します。皮質に損傷を引き起こすのを防ぐために連続的な動きとしてこのカットを行います.
- 中脳を取り除くために、所望の量の組織を単に腹側と下のコリリに解剖する。
- 海馬を取り除くために、頭体の梁の後部にメスの鈍い端を置き、体頭肉の後部から始まる「J」運動を使用して海馬をそっと転がします。海馬の角全体が「ビーン型」です。
- 線条体(主にcaudate核が示されている)は、海馬の前部と海馬のちょうど下の灰色および白色物質縞の領域である。メスをベベルし、この領域を除去し、除去時に縞組織を明らかにする。
- 内側前頭前野を除去するために、前頭回から脳梁に組織を解剖し、そのセクションの最も内側の部分を取り除く。右皮質は、内側前頭前野の除去後に残るべきである。
- 視床を取り除くために、脳の中頭座面の中心にある球根のような構造を取り除き、中脳にrostralを取り除きます。視床は球形をしており、周囲の組織よりも少し暗く見えます。
3. 解剖後
- 解剖が完了したら、その後の分析のために組織サンプルを適切に保存します。このステップを省略すると、わずか20分以内に大幅な自己分解と劣化が発生します。
- 構造解析が行われる場合は解剖時に各脳領域をそのままにするか、組織をミンチして保存前に均質な組織サンプルを作成する。脳組織の一般的なサンプル保存方法には、架橋剤15を用いた凍結保存および化学固定が含まれる。
- 標準的なラボアッセイ(例えば、遺伝子またはタンパク質発現)については、-80°Cで長期保存する前に遺伝物質を安定化させる液体窒素または溶液に浸し、便利で費用対効果の高い保存方法を提供します。
- 組織構造を維持することが優先事項である場合、従来の固定法(例えば、アルデヒドベースの固定剤を使用して架橋タンパク質を使用する)を通じて脳組織を保存し、組織解剖前に目的の動物または臓器を灌流することなく、または灌流する。
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Representative Results
このセクションでは、4週齢の豚の脳の正しい抽出と解剖の後に得られた結果の例を説明します。 図1 は、解剖時のガイドとして使用する各脳領域の形状を概説する。脳幹の一部は、小脳の除去後に頭蓋骨に残ることがある(図1B)。これは、小脳の所望の領域を単離しながら除去することができる。 表1 は、解剖された脳領域(n=5)の平均重量(平均±平均の標準誤差)を示しています。
図1:摘出された豚の脳 解剖時のガイドとして使用するための脳領域の概要。表示される領域は右半球から取得されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 地域 | 重量 (g) | SEM |
| ホールピッグ* | 8.006 | 0.545 |
| 脳幹 | 0.829 | 0.132 |
| 小脳 | 5.929 | 0.137 |
| 中脳 | 0.376 | 0.047 |
| 海馬 | 0.500 | 0.051 |
| 線条 体 | 0.410 | 0.115 |
| 視床 | 0.476 | 0.120 |
| 内側前頭前野 | 0.459 | 0.122 |
| *重量はkgとして提示 |
表1:脳領域の重み付け 4週齢の豚の脳と解剖された脳領域の平均体重(n=5)。
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Discussion
本明細書に記載された技術は、約4週齢の豚のために設計された。特に、その後の生化学的アッセイを検討する場合、脳組織構造の完全性を維持するために、豚が人道的に安楽死させた直後にこれらのステップを実行することが重要である。最初に技術を学ぶときにアトラスまたはファイバー16 解剖ガイドを使用すると便利です。実験者は、データ収集のためのサンプルを取得する前に、いくつかの脳の抽出と解剖を練習することをお勧めします。最も困難なステップは、頭蓋骨の除去です。このステップは、頭蓋骨のどこに見て、いつ頭蓋骨が切り取られたかを知るために直接練習する必要が大きいため、経験が容易になります。この手順は、Bassi et al.12によって記述されたものと同様ですが、六角形の頭蓋ウィンドウを作成する必要はないが、技術を実行する方法の視覚的なチュートリアルを提供します。
この技術の限界は、古い豚と一緒に働くとき、年齢とともに著しく厚くなるので、頭蓋骨を取り除くのにより多くの時間がかかることである。鋸を使用すると、より厚い頭蓋骨のためにあまりにも面倒または効果がない場合は、Bjarkamら13、または動力を与えられた外科装置(例えば、骨のこぎり)によって示されるように、ハンマーおよびノミを使用することが必要であるかもしれない。さらに、この技術は、常に嗅球の捕獲を保証するものではありません。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、農業・消費者・環境科学情報通信大学のジム・ノブラウチとマーティン・ブース・ホッジスが、オーディオとビデオの撮影、録音、編集に関する専門知識を認めたいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
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