Summary
이 프로토콜은 일반적으로 신경 과학에서 공부 여러 뇌 영역의 전체 및 해부에 돼지 뇌의 제거를위한 기술을 자세히 설명합니다.
Abstract
돼지를 전임상 및 전염성 동물 모델로 사용하는 것은 심혈관 시스템, 위장 시스템 및 영양을 조사하는 연구 분야에서 잘 문서화되고 받아들여졌으며 돼지는 점점 더 신경 과학의 큰 동물 모델로 사용되고 있습니다. 또한, 돼지는 인간에서 일어나는 것과 유사한 두뇌 성장 및 발달 패턴을 표시하기 때문에 신경 발달을 공부하는 허용된 모형입니다. 신경 과학에서 덜 일반적인 동물 모델로, 돼지에 외과 및 해부 절차는 연구원 중 친숙 하거나 잘 연습 되지 않을 수 있습니다. 따라서 일관된 추출 및 해부 방법을 자세히 설명하는 표준화된 시각적 프로토콜은 돼지와 함께 일하는 연구자에게 가치가 있음을 증명할 수 있습니다. 다음 비디오는 피질과 뇌간을 그대로 유지하면서 돼지 뇌를 제거하는 기술을 보여주고 뇌간, 소뇌, 중뇌, 해마, 줄무늬, 시상 및 내측 전두엽 피질을 포함하여 여러 일반적으로 조사되는 뇌 영역을 해부하는 방법을 검토합니다. 이 비디오의 목적은 연구원에게 4주 된 돼지의 뇌 추출 및 해부를 일관되게 수행하는 데 필요한 도구와 지식을 제공하는 것입니다.
Introduction
돼지는 잘 문서화되어 심혈 관계 시스템1,위장 시스템2,영양3,4,당뇨병5,독성학6및 수술 기술7에서연구를위한 번역 가능한 동물 모델로 받아들여졌습니다. PubMed가 "돼지 뇌 동물 모델"이라는 키워드를 검색하여 1996-2005년 보다 4배 더 많은 결과를 초래함에 따라 신경 과학에서 돼지의 사용이 증가하기시작했으며,현재는 더 많은 결과가 나타나고 있습니다. 돼지 모델의 인기가 확대되는 주된 이유는 인간과 비교할 때 뇌의 성장, 구조 및 기능의 유사성 때문입니다. 인간의 뇌에 비해 돼지 뇌는 회색과 백색 물질의 유사한 자랄 패터닝, 혈관화 및 분포를 나타낸다9. 더욱이, 돼지 뇌는 신경 이미징 절차에 사용되어, 잠재적인 기록을 불러 일으켰으며, 신경외과 기술수립8,9. 다른 동물 모델과는 달리, 그러나, 돼지와 인간의 경험 주산기 뇌 성장 분출, 산전 또는 산후 성장 분출 반대로. 출생 시, 인간과 돼지 뇌는 성인 뇌 체중의 약 27%와 25%의 무게를 가지고 있으며, 성인 뇌 체중의 12%와 성인 체중10%의rhesus 원숭이 뇌의 무게가 있는 쥐 뇌에 비해 각각 무게를 측정합니다.
돼지가 신경 과학을 위한 동물 모형으로 서게 채택된 한 가지 이유는 많은 연구원이 이 맥락에서 동물에 익숙하지 하기 때문입니다. 연구원은 필드에 있는 그것의 잠재적인 사용을 인식하지 않을 수 있습니다 또는 그 같은 모형을 사용하는 데 필요한 적당한 기술을 모르는 수 있습니다. 생물 의학 및 전임상 모델로 돼지를 사용하면 신경 과학에 대한 관심과 사용이 증가함에 따라 연구 전반에 걸친 데이터의 정확한 비교를 보장하기 위해 조직 제거의 표준화 된 절차를 수립해야합니다. 돼지 뇌와 관련된 해부 및 외과 기술은 다른 곳에서 출판되었지만11,12,13,돼지 뇌 조직을 수집하는 간단하고 표준화 된 프로토콜에 대한 필요성이있다, 특히 생화학 적 분석에 사용하기 위해. 따라서 이 비디오의 목적은 연구원이 표준화된 뇌 추출 및 해부를 수행할 수 있도록 하는 데 필요한 지식을 제공하는 것입니다. 이 비디오는 피질과 뇌간을 그대로 유지하면서 돼지 뇌를 제거하는 하나의 적절한 기술을 설명하고, 그 후 여러 주요 뇌 영역을 해부하는 방법을 검토합니다.
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Protocol
어바나 샴페인 일리노이 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 동물 과목과 관련된 절차가 승인되었습니다.
참고 : 안락사 전에, 돼지는 텔라졸 : 케타민 : 자일라진의 조합과 근육 주사를 통해 마취되었다 (50.0 타일 타민 HCl 플러스 졸라제팜 H의 50.0 mg Cl은 케타민 HCl (100 g/L)의 2.50 mL및 자일라진 (100 g /L)의 2.50 mL로 재구성하고 0.06 mg / kg BW로 투여됩니다. 일단 마취되면, 돼지는 나트륨 pentobarbital의 심내 투여를 통해 안락사되었다 (390 mg / mL에서 투여 1 mL/ 5 kg BW). 뇌 해부에 대 한, 안락사의 방법은 조직의 원하는 분석 절차에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 안락사의 방법은 가능한 한 뇌에 작은 손상을 야기한다.
1. 돼지 뇌의 추출
- 인도적 안락사에 따라, 목의 목덜미 위에 절단하여 돼지를 참수, 첫 번째와 두 번째 척추 사이 (아틀라스와 축, 각각).
- 스파이크를 포함하도록 수정된 고정된 벤치 바이스로 머리를 고정합니다. 진행 하기 전에 머리가 완전히 고정 되어 있는지 확인 합니다.
- 메스를 사용하여 두개골의 중간선을 따라 처질절단을 하여 머리 뒤쪽으로 계속 자른다.
- 머리 뒤쪽에서 두 번째(횡방향)를 잘라내십시오.
- 주둥이의 후방 끝에 세 번째(횡방향)를 자르고 눈과 함께 합니다. 두개골에 쉽게 접근할 수 있도록 가능한 한 멀리 두개골에서 피부를 잘라냅니다.
- 뼈 톱을 사용하여, 두 개의 전방 후방 컷중간으로 잘라, 두개골 곡률의 정점에 눈에서 확장. 톱을 미드라인쪽으로 베벨을 하고 두개골을 관통할 수 있을 만큼 깊이 잘라냅니다.
- 수직 측면에 위의 프로세스를 반복하여 두개골에 직사각형 "창"을 만듭니다.
- 고기 갈고리를 사용하여 두개골의 직사각형 부분을 벗겨내시다. 먼저 후크를 섹션의 모서리 중 하나에 넣고 위쪽으로 압력을 가하여 두개골 조각을 풀어줍니다. 실수로 뇌 조직을 관통하는 것을 방지하기 위해 두개골의 수준에 만 고기 후크를 배치하는 주의하십시오.
- 뇌에 수막 층이 남아 있는 경우, 집게와 무딘 가위(또는 메스)를 사용하여 뇌로 절단하지 않고 층을 부드럽게 제거하십시오.
- 메스를 사용하여 머리의 뒤쪽 부분에서 근육과 지방을 잘라 두개골의 후위 부분을 노출시하십시오.
- 두개골 의 후방을 따라 두 개의 횡방향 컷을 확인합니다. 뇌 조직으로 잘라하지 않도록해야합니다.
- 주전자에 단단한 손을 얹고 뒤로 압력을 가하여 두개골의 후방 부분을 당겨 소뇌를 노출시켜 머리를 고정하십시오.
- 벤치 부사장에서 머리를 제거하고 수술 매트에 배치합니다.
- 메스의 무딘 끝과 같은 긴 날씬한 도구를 사용하여 뇌를 제거하십시오. 머리를 반전하고 뇌의 표면을 손상시키지 않고 두개골 구멍에서 뇌를 동축부드러운 스쿱 모션을 사용합니다.
참고 : 뇌를 제거하기 위해 두개골 신경을 끊어야합니다. 부드럽게 그렇게하고 강제로 뇌를 당겨하려고하지 않습니다. 뇌가 두개골과 척추에서 제대로 완전히 분리되면 스스로 떨어질 것입니다.
2. 돼지 뇌의 해부
참고: 해부 시 뇌 아틀라스 또는 섬유 해부가이드(14)를 시각적 표현으로 사용하는 것이 유용할 수 있습니다. 해부된 조직 샘플은 각 샘플을 제거할 때 프로젝트별 필요에 따라 제대로 저장되는지 확인하십시오(아래 자세히 설명됨). 또한,이 비디오의 목적을 위해, 표시된 모든 뇌 영역은 오른쪽 반구에서 해부되었다, 그러나 이것은 실험 목표에 따라 실험실마다 다를 수 있습니다.
- 뇌간 (주로 수질)을 제거하려면 소뇌에 관상 절단 된 코달을 만듭니다.
- 소뇌를 제거하려면 피질에 관상 절단 후방을 만듭니다. 이 샘플에서 소뇌의 원하는 영역(예: vermis, flocculus 등)을 분리합니다. 이 샘플에 뇌 줄기의 어떤 부분을 포함 하지 않도록 해야 합니다.
- 세로 균열을 따라 중간 처검 컷을 만들어 뇌의 두 반구를 분리합니다. 피질에 손상을 일으키는 것을 방지하기 위해 연속 동작으로이 절단을합니다.
- 중뇌를 제거하려면 원하는 양의 조직을 우수하고 열등한 콜리큘리에 해부하십시오.
- 해마를 제거하기 위해, 코퍼스 캘로섬의 후부에 메스의 무딘 끝을 놓고 부드럽게 해마를 굴려, 코퍼스 캘로섬의 후방 부분에서 시작하는 "J"모션을 사용하여; 전체 해마 뿔은 '콩 모양'입니다.
- striatum (caudate 핵은 주로 표시됩니다)는 해마에 코퍼스 캘로섬과 전방 바로 아래 회색과 흰색 물질 줄무늬 영역입니다. 메스를 베벨과 제거시 수축 된 조직을 드러내며이 부위를 제거하십시오.
- 내측 전두엽 피질을 제거하려면 전두엽 자이루스에서 코퍼스 캘로섬으로 조직을 해부하여 해당 섹션의 가장 내측 부분을 제거합니다. 오른쪽 피질은 내측 전두엽 피질을 제거 한 후에도 남아 있어야합니다.
- 시동을 제거하려면 뇌의 중증 표면의 중앙에 전구와 같은 구조를 제거하고 중뇌로 장밋빛으로 제거하십시오. 시상은 구형 모양을 가지고 있으며 주변 조직보다 약간 어둡게 보입니다.
3. 해부 후
- 해부가 완료되면 후속 분석을 위해 조직 샘플을 적절하게 보존하십시오. 이 단계를 생략하면 20분 이내에 상당한 자동 분해와 저하가 발생합니다.
- 구조 분석이 수행될 경우 해부 시에 각 뇌 영역을 그대로 두거나 보존 전에 균질성 조직 샘플을 만들기 위해 조직을 다진다. 뇌 조직을 위한 일반적인 견본 보존 방법은 교차 연결 에이전트를 사용하여 냉동 보존 및 화학 고정을 포함합니다(15).
- 표준 실험실 연구제(예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현)의 경우-80°C에서 장기 저장하기 전에 유전 물질을 안정화시키는 액체 질소 또는 용액에 몰입하여 편리하고 비용 효율적인 보존 방법을 제공합니다.
- 조직 구조를 유지하는 것이 우선 순위인 경우, 전통적인 고정 방법(예: 알데히드 기반 고정제를 사용하여 단백질을 교차링크하는) 조직 해부 이전에 동물 또는 관심 기관의 관류없이 또는 관류로 뇌 조직을 보존하십시오.
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Representative Results
이 섹션에서는 4주 된 돼지 뇌의 정확한 추출 및 해부 후 얻은 결과의 예를 설명합니다. 그림 1은 해부 동안 가이드로 사용하기 위해 각 뇌 영역의 모양을 간략하게 설명합니다. 뇌의 일부는 소뇌의 제거 후 두개골에 남아있을 수 있습니다(도 1B). 이것은 소뇌의 원하는 영역을 격리하는 동안 제거 될 수있다. 표 1은 해부된 각 뇌 영역(n=5)에 대한 평균 중량(평균 ± 표준 오차)을 표시합니다.
그림 1: 돼지 뇌추출. 해부 동안 가이드로 사용하기 위해 뇌 영역의 개요. 표시된 영역은 오른쪽 반구에서 온 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 부위 | 무게 (g) | SEM |
| 돼지 전체* | 8.006 | 0.545 |
| 브레인스템 | 0.829 | 0.132 |
| 소뇌 | 5.929 | 0.137 |
| 중뇌 | 0.376 | 0.047 |
| 해마 | 0.500 | 0.051 |
| 스트트리아텀 | 0.410 | 0.115 |
| 시상 | 0.476 | 0.120 |
| 내측 전두엽 피질 | 0.459 | 0.122 |
| *킬로그램으로 제시된 무게 |
표 1: 뇌 영역 가중치. 4 주 된 돼지 두뇌와 각 해부 된 뇌 영역의 평균 무게 (n=5).
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Discussion
본 명세서에 기술된 기술은 약 4주 의 돼지를 위해 디자인되었다. 돼지가 뇌 조직 구조의 무결성을 유지하기 위해 인도적으로 안락사 된 직후이러한 단계를 수행하는 것이 중요합니다, 특히 후속 생화학 적 분석을 고려할 때. 처음 기술을 배울 때 아틀라스 또는 섬유16 해부 가이드를 사용하는 것이 도움이됩니다. 실험자는 데이터 수집을 위한 샘플을 얻기 전에 여러 뇌 추출 및 해부를 연습하는 것이 좋습니다. 가장 어려운 단계는 두개골을 제거하는 것입니다. 이 단계는 주로 두개골에서 볼 수있는 곳과 두개골이 잘려졌을 때를 알 수있는 직접적인 연습이 필요하기 때문에 경험이 더 쉬워질 것입니다. 이 절차는 Bassi 외12에의해 설명된 것과 유사하지만 육각형 두개골 창을 만들 필요가 없으며 기술을 수행하는 방법에 대한 시각적 자습서를 제공합니다.
이 기술의 한계는 오래된 돼지와 함께 작업 할 때 나이가 들면서 두개골을 제거하는 데 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다. 톱을 사용하는 것이 두꺼운 두개골에 너무 힘들거나 효과가 없는 경우 Bjarkam 외13또는 전원 수술 장비 (예 : 뼈 톱)에 의해 나타난 것과 같이 망치와 끌을 사용해야 할 수도 있습니다. 또한,이 기술은 항상 후각 전구의 캡처를 보장하지 않습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 짐 노블라우치와 마틴 부스 호지스 농업, 소비자 및 환경 과학 정보 기술 및 통신 서비스 대학의 촬영, 녹음 및 오디오 및 비디오 편집에 대한 전문 지식을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
