Summary
Denne protokollen beskriver teknikken for fjerning av grishjernen i sin helhet og disseksjon av flere hjerneregioner som vanligvis studeres i nevrovitenskap.
Abstract
Bruk av grisen som en preklinisk og oversettbar dyremodell har blitt godt dokumentert og akseptert av forskningsfelt som undersøker kardiovaskulære systemer, gastrointestinale systemer og ernæring, og grisen blir i økende grad brukt som en stor dyremodell i nevrovitenskap. Videre er grisen en akseptert modell for å studere nevroutvikling da den viser hjernevekst og utviklingsmønstre som ligner på det som forekommer hos mennesker. Som en mindre vanlig dyremodell innen nevrovitenskap, kan kirurgiske og disseksjonsprosedyrer på griser ikke være så kjent eller godt praktisert blant forskere. Derfor kan en standardisert visuell protokoll som beskriver konsistente ekstraksjons- og disseksjonsmetoder vise seg å være verdifulle for forskere som arbeider med grisen. Følgende video viser en teknikk for å fjerne grishjernen mens du holder cortex og hjernestamme intakt og vurderingsmetoder for å dissekere flere ofte undersøkte hjerneregioner, inkludert hjernestammen, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus og medial prefrontal cortex. Hensikten med denne videoen er å gi forskere verktøyene og kunnskapen som er nødvendig for å konsekvent utføre en hjerneutvinning og disseksjon på den fire uker gamle grisen.
Introduction
Grisen er godt dokumentert og akseptert som en overførbar dyremodell for forskning i kardiovaskulære systemer1,gastrointestinale systemer2,ernæring3,4,diabetes5,toksikologi6og kirurgiske teknikker7. Bruk av grisen i nevrovitenskap begynner å øke, da PubMed søker etter nøkkelordene "svinehjernedyrmodell" resulterer i fire ganger flere resultater fra 1996-2005 enn foregående 10 år periode8, og enda flere resultater for tiden. En hovedårsak til at populariteten til grismodellen utvides, skyldes dens likheter i vekst, struktur og funksjon av hjernen sammenlignet med mennesker. I forhold til den menneskelige hjernen viser grishjernen lignende gyral mønster, vaskularisering og distribusjon av grå og hvit materie9. Videre har grishjernen blitt brukt i nevroimaging prosedyrer, fremkalt potensiell registrering, og i etableringen av nevrokirurgi teknikker8,9. I motsetning til andre dyremodeller, derimot, grisen og menneskelig erfaring perinatal hjernevekst spruter, i motsetning til pre- eller postnatal vekst spruter. Ved fødselen veier menneske- og grishjernen henholdsvis ca. 27 og 25 prosent av deres voksne hjernevekt, sammenlignet med rottehjernen som veier 12 prosent av sin voksne hjernevekt og rhesusapehjernen ved 76 prosent avvoksenvekten 10.
En grunn til at grisen bare sakte har blitt vedtatt som en dyremodell for nevrovitenskap, er fordi mange forskere ikke er kjent med dyret i denne sammenhengen. Forskere er kanskje ikke klar over den potensielle bruken i feltet eller vet kanskje ikke de riktige teknikkene som kreves for å bruke en slik modell. Som bruk av grisen som biomedisinsk og preklinisk modell får oppmerksomhet og bruk i nevrovitenskap, er det nødvendig å etablere standardiserte prosedyrer for vevsfjerning for å sikre nøyaktig sammenligning av data på tvers av studier. Selv om disseksjon og kirurgiske teknikker som involverer grishjernen har blitt publisert andre steder11,12,13, er det behov for enkle og standardiserte protokoller for å samle grishjernevev, spesielt for bruk i biokjemiske analyser. Som sådan er målet med denne videoen å gi kunnskapen som er nødvendig for å tillate forskere å utføre en standardisert hjerneutvinning og disseksjon. Denne videoen illustrerer en riktig teknikk for å fjerne grishjernen mens du holder cortex og hjernestamme intakt, og gjennomgår deretter metoder for å dissekere flere viktige hjerneregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Illinois ved Urbana-Champaign
MERK: Før eutanasi, grisen bedøvet via intramuskulær injeksjon med en kombinasjon av telazol:ketamin:xylazin (50,0 mg tiletamin HCl pluss 50,0 mg zolazepam HCl rekonstituert med 2,50 ml ketamin HCl (100 g/l) og 2,50 ml xylazin (100 g/l) og administrert ved 0,06 mg/kg kroppsvekt). Når den var bedøvet, ble grisen euthanized via intrakariac administrering av natrium pentobarbital (390 mg / ml administrert ved 1 ml / 5 kg kroppsvekt). For hjerne disseksjon anbefales det at metoden for eutanasi velges basert på ønsket analytisk prosedyre av vevet. Metoden for eutanasi bør forårsake så liten skade på hjernen som mulig.
1. Ekstraksjon av grishjernen
- Etter human eutanasi, halshugge grisen ved å kutte over nakken, mellom første og andre vertebra (henholdsvis atlas og akse).
- Fest hodet i en immobilisert benk skrustikke modifisert for å inkludere pigger. Forsikre deg om at hodet er helt immobilisert før du fortsetter.
- Bruk en skalpell, gjør et sagittalt kutt langs midtlinjen av skallen som fortsetter til bakre av hodet.
- Lag et andre (tverrgående) kutt på baken på hodet.
- Lag et tredje (tverrgående) kutt på den bakre enden av snuten og på linje med øynene. Klipp huden så langt unna skallen som mulig for å sikre enkel tilgang til skallen.
- Bruk en beinsag, lag to fremre til bakre kutt lateral til midtlinjen, som strekker seg fra øynene til toppen av skallen krumning. Skråstill sagen mot midtlinjen og kutt akkurat dypt nok til å trenge inn i skallen.
- Gjenta prosessen ovenfor på vinkelrette sider, og opprett et rektangulært "vindu" i skallen.
- Bruk en, lirke den rektangulære delen av skallen av. Begynn med å plassere kroken i et av hjørnene på delen og påfør oppadgående trykk for å løsne skallestykket. Pass på å plassere bare på skallens nivå for å forhindre utilsiktet penetrering av hjernevevet.
- Hvis noen meningeale lag forblir på hjernen, bruk tang og stump saks (eller alternativt en skalpell) for å forsiktig fjerne lagene uten å kutte inn i hjernen.
- Bruk en skalpell til å kutte bort muskler og fett i den bakre delen av hodet, og eksponere den bakre delen av skallen.
- Lag to tverrgående kutt langs etter bakre av skallen. Pass på at du ikke skjærer i hjernevev.
- Fest hodet ved å legge en fast hånd på snuten og legg et baklengs trykk for å trekke den bakre delen av skallen av, og eksponere cerebellum.
- Fjern hodet fra benkstikken og legg det på en kirurgisk matte.
- Bruk et langt slankt verktøy, for eksempel den stumpe enden av en skalpell, for å fjerne hjernen. Snu hodet og bruk en mild scooping bevegelse for å koaksialisere hjernen ut av skallehulen uten å skade overflaten av hjernen.
MERK: Det vil være nødvendig å kutte kranialnervene for å fjerne hjernen. Gjør det forsiktig og ikke prøv å trekke hjernen kraftig ut. Hjernen vil falle ut alene når den er riktig og helt løsrevet fra skallen og ryggraden.
2. Disseksjon av grishjernen
MERK: Det kan være nyttig å bruke et hjerneatlas eller fiber disseksjonsguide14 som en visuell representasjon under disseksjonsprosedyrene. Sørg for at dissekerte vevsprøver lagres riktig i henhold til prosjektspesifikke behov ved fjerning av hver prøve (beskrevet mer detaljert nedenfor). I tillegg vær oppmerksom på at for denne videoen ble alle hjerneregioner som vises dissekert fra riktig halvkule, men dette kan variere per laboratorium basert på eksperimentelle mål.
- For å fjerne hjernestammen (hovedsakelig medulla), gjør en koronal kuttet kaudal til cerebellum.
- For å fjerne cerebellum, gjør en coronal kutt posterior til cortex. Isoler ønskede regioner (f.eks. vermis, flocculus, etc.) av cerebellum fra denne prøven. Pass på at du ikke inkluderer noen deler av hjernestammen i denne prøven.
- Skill de to hjernehalvdelene ved å lage et middels sagittalt kutt langs langsgående sprekk. Gjør dette kuttet som en kontinuerlig bevegelse for å forhindre å forårsake skade på cortex.
- For å fjerne midbrain, disseker en ønsket mengde vev bare ventral til overlegen og dårligere colliculi.
- For å fjerne hippocampus, plasser den stumpe enden av en skalpell i den bakre delen av corpus callosum og rull forsiktig hippocampus ut, ved hjelp av en "J" bevegelse som starter fra den bakre delen av corpus callosum; et helt hippocampal horn er 'bønneformet'.
- Striatum (caudate nucleus er først og fremst vist) er en grå og hvit materie-stripet region like under corpus callosum og fremre til hippocampus. Skråstill skalpellen og fjern denne regionen, og avsløre striated vev ved fjerning.
- For å fjerne medial prefrontal cortex, disseker vev fra frontal gyrus til corpus callosum, fjerne den mest mediale delen av den delen. Riktig cortex bør forbli etter fjerning av medial prefrontal cortex.
- For å fjerne thalamus, fjern den pærelignende strukturen i midten av hjernens midtsagittale overflate og rostral til midbrain. Thalamus har en sfærisk form og vil se litt mørkere ut enn det omkringliggende vevet.
3. Etter disseksjon
- Etter ferdigstillelse av disseksjonen, bevare vevsprøver riktig for etterfølgende analyser. Unnlatelse av dette trinnet vil resultere i betydelig autolyse og nedbrytning innen så lite som 20 minutter.
- La hver hjerneregion være intakt på tidspunktet for disseksjon hvis strukturelle analyser vil bli utført, eller hakk vevet for å lage en homogen vevsprøve før bevaring. Vanlige prøvebevaringsmetoder for hjernevev inkluderer kryopreservering og kjemisk fiksering ved hjelp av krysskoblingsmidler15.
- For standard laboratorieanalyser (f.eks. gen- eller proteinuttrykk), dypp i flytende nitrogen eller løsninger som stabiliserer genetisk materiale før langtidslagring ved -80 °C for å gi praktiske og kostnadseffektive bevaringsmetoder.
- Hvis det er en prioritet å opprettholde vevsstrukturen, må hjernevevet bevares gjennom tradisjonelle fikseringsmetoder (f.eks. bruk av aldehydbaserte fikseringer for å krysslinke proteiner), enten uten eller med perfusjon av dyret eller orgel av interesse før vevspredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen beskriver eksempler på resultater oppnådd etter riktig ekstraksjon og disseksjon av en 4 uker gammel grishjerne. Figur 1 skisserer formen på hver hjerneregion for bruk som veiledning under disseksjonen. En del av hjernestammen kan forbli i skallen etter fjerning av cerebellum (Figur 1B). Dette kan fjernes mens du isolerer ønsket område av cerebellum. Tabell 1 viser gjennomsnittsvekten (gjennomsnitt ± standardfeilen for gjennomsnittet) for hver av de dissekerte hjerneregionene (n=5).
Figur 1: Ekstrahert grishjerne. Omriss av hjerneregioner for bruk som guide under disseksjon. Områder som vises er fra høyre halvkule. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Regionen | Vekt (g) | Sem |
| Hele grisen* | 8.006 | 0.545 |
| Hjernestammen | 0.829 | 0.132 |
| Lillehjernen | 5.929 | 0.137 |
| Midbrain | 0.376 | 0.047 |
| Hippocampus | 0.500 | 0.051 |
| Striatum | 0.410 | 0.115 |
| Thalamus | 0.476 | 0.120 |
| medial prefrontal cortex | 0.459 | 0.122 |
| *Vekt presentert som kg |
Tabell 1: Hjerneregioner Vekter. Gjennomsnittlig vekt av den 4 uker gamle grishjernen og hver dissekerte hjerneregion (n = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene beskrevet her ble designet for griser ca 4 uker. Det er viktig å utføre disse trinnene umiddelbart etter at grisen har blitt humant euthanized for å sikre at integriteten til hjernevevsstrukturen opprettholdes, spesielt når man vurderer etterfølgende biokjemiske analyser. Det er nyttig å bruke et atlas eller fiber16 disseksjonsguider når du først lærer teknikkene. Det anbefales at eksperimentet praktiserer flere hjerneekstraksjoner og disseksjoner før de innhenter prøver for datainnsamling. Det vanskeligste trinnet er fjerning av skallen. Dette trinnet blir lettere med erfaring, da det i stor grad krever førstehånds praksis å vite hvor på skallen å så og når skallen er kuttet gjennom. Denne prosedyren ligner på det som er beskrevet av Bassi et al.12, selv om det ikke krever behov for å lage et sekskantet kranialvindu og gir en visuell veiledning om hvordan du utfører teknikken.
En begrensning av denne teknikken det at når du arbeider med eldre griser, kan det ta mer tid å fjerne skallen, da den blir betydelig tykkere med alderen. Hvis bruk av en sag er for arbeidskrevende eller ineffektiv for tykkere hodeskaller, kan det være nødvendig å enten bruke en hammer og meisel, slik bjarkam et al.13, eller drevet kirurgisk utstyr (f.eks. bensag). Videre sikrer denne teknikken ikke alltid fangst av olfaktoriske pærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne Jim Knoblauch og Martin-Booth Hodges fra College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences Information Technology and Communication Services for deres ekspertise innen skyting, opptak og redigering av lyd og video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #22 Scalpel Blades for #4 Handles | Ted Pella, inc. | 549-4S-22 | |
| 11 1/2" Satterlee Bone Saw | Leica Biosystems | 38DI13425 | |
| 5 1/2" Skull Breaker with Chisel End (Meat Hook) | Leica Biosystems | 38DI37636 | |
| 5-inch Heavy Duty Workshop Bench Vise | Pony | 29050 | |
| Butcher Knife 25cm | Victorinox | 5.7403.25 | Sharpen before use |
| CM40 Light Duty Drop Forged C Clamps | Bessey | 00655BC3120 | |
| Diamond Hone Knife Shaper | Chef’s Choice | 436-3 | |
| Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle #4 | ThermoScientific | 5334 | |
| Tissue Forceps | Henry Schein | 101-5132 | |
| Vinyl Dissecting pad | Carolina | 629006 |
References
- Hughes, H. C.
- Yen, J. Anatomy of the Digestive System and Nutritional Physiology. Biology of the Domestic Pig. , 31-63 (2001).
- Pond, W. G. Of Pigs and People. Swine Nutrition. , 3-24 (2001).
- Odle, J., Lin, X., Jacobi, S. K., Kim, S. W., Stahl, C. H. The Suckling Piglet as an Agrimedical Model for the Study of Pediatric Nutrition and Metabolism. Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 419-444 (2014).
- Larsen, M. O., Rolin, B. Use of the Göttingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. ILAR Journal. 45 (3), 303-313 (2004).
- Lehmann, H.
- Richer, J., et al. Sacrococcygeal and transsacral epidural anesthesia in the laboratory pig. Surgical Radiologic Anatomy. 20, 431-435 (1998).
- Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
- Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. -H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
- Dobbing, J., Sands, J.
- Aurich, L. A., et al. Microsurgical training model with nonliving swine head. Alternative for neurosurgical education. Acta Cirurgica Brasileira. 29 (6), 405-409 (2014).
- Bassi, T., Rohrs, E., Fernandez, K., Ornowska, M., Reynolds, C. S. Direct brain excision: An easier method to harvest the pig's brain. Interdisciplinary Neurosurgery. 14, 37-38 (2018).
- Bjarkam, C. R., et al. Exposure of the pig CNS for histological analysis: A manual for decapitation, skull opening, and brain removal. Journal of Visualized Experiments. 122, e55511 (2017).
- Pascalau, R., Szabo, B. Fibre dissection and sectional study of the major porcine cerebral white matter tracts. Anatomia, Histologia, Embryologia. 46, 378-390 (2017).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7, 146 (2019).
- Félix, B., et al.
