Summary
טכניקה מהירה ואמינה מוצעת לשליטה בתנודות הצורה של בועה אקוסטית אחת לכודה המבוססת על טכניקת התלכדות בין שתי בועות. תנודות צורת הבועה במצב יציב ומבוקרות סימטריה מאפשרות ניתוח של זרימת הנוזל הנוצרת בקרבת ממשק הבועות.
Abstract
כאשר הן ממוקמות ליד מחסומים ביולוגיים, מיקרו-בועות מתנדנדות עשויות להגביר את חדירות קרום התא, ולאפשר הפנמה של תרופות וגנים. תצפיות ניסיוניות מצביעות על כך שהחדירות הזמנית של מחסומים אלה עשויה לנבוע מלחץ גזירה המופעל על רקמות התא על ידי מיקרו-זרם קוויטציה. מיקרו-סטרימינג קביטציה הוא יצירה של זרמי מערבולות המתעוררים סביב מיקרו-בועות אולטרסאונד מתנדנדות. כדי לייצר זרימות נוזליות כאלה, תנודות הבועות חייבות לסטות מתנודות כדוריות גרידא ולכלול חוסר יציבות תרגומית או מצבי צורה. מחקרים ניסיוניים של זרימות המושרות על ידי בועות ולחץ גזירה על משטחים סמוכים מוגבלים לעתים קרובות בהיקפם בשל הקושי ללכוד עיוותים צורניים של מיקרו-בועות באופן יציב וניתן לשליטה. אנו מתארים תכנון של תא ריחוף אקוסטי לחקר תנודות לא כדוריות מבוקרות סימטריה. בקרה כזו מתבצעת באמצעות טכניקת התלכדות בין שתי בועות מתקרבות בשדה אולטרסאונד אינטנסיבי מספיק. השליטה בתנודות לא כדוריות פותחת את הדרך למיקרו-סטרימינג מבוקר של מיקרו-בועות חופשיות המתנדנדות על פני השטח. מצלמות בקצב פריימים גבוה מאפשרות לחקור בו זמנית את דינמיקת הבועות הלא כדוריות בסקאלת הזמן האקוסטית ואת זרימת הנוזל בסקאלת זמן נמוכה יותר. ניתן לראות כי ניתן להשיג מגוון רחב של דפוסי נוזלים וכי הם מתואמים עם התוכן המודאלי של ממשק הבועה. אנו מראים שאפילו מצבי צורה מסדר גבוה יכולים ליצור תבניות נוזל למרחקים גדולים אם דינמיקת הממשק מכילה מספר מצבים, המדגישים את הפוטנציאל של תנודות לא כדוריות לאספקת תרופות ממוקדת ומקומית.
Introduction
ברפואה, תרופה הניתנת חייבת לחדור מכשולים רבים במערכת החיים לפני שתגיע למטרות הרצויות. עם זאת, רוב התרופות מנוקות במהירות מזרם הדם. יעילות המיקוד נמוכה והם אינם יכולים לחצות בקלות את קרום התא, מה שמוביל לאספקת תרופות לא יעילה. כיום, השימוש במיקרו-בועות בשילוב עם אולטרסאונד הוצע כשיטה חדשנית להעברה לא פולשנית, מדויקת וממוקדת של תרופות וגנים לרקמות ותאים פתולוגיים1. בגישה זו, מיקרו-בועות יכולות למלא תפקיד כנשאיות שבהן תרופות חופשיות מוזרקות יחד עם תרחיף בועת גז או נטענות על פני השטח שלה. מיקרו-בועות יכולות לשמש גם כווקטור מקומי למיקוד מחדש של אנרגיית האולטרסאונד על מנת לקיים אינטראקציה עם התאים. בעיקרון, תחת חשיפה לאולטרסאונד, בועות נדחסות ומתרחבות ביציבות, משטר הנקרא קוויטציה יציבה המייצרת זרימות נוזלים ומכאן לחץ גזירה על עצמים קרובים. מיקרו-בועות עשויות גם להתנדנד באופן לא ליניארי ולהתרחב עד להתמוטטות, במשטר של קוויטציה אינרציאלית, ולייצר גלי הלם המתפשטים רדיאלית מאתר הקריסה2. הוכח כי קוויטציה, יציבה או אינרציאלית, משפרת את החדירות של קרום התא, ובכך מגבירה את הפנמת התרופות לתוך התא3.
ביישומים טיפוליים, הבנת מנגנון האינטראקציה בין תא הבועה חשובה מאוד, אך ישנם מספר חסמים, הן מהצד המדעי והן מהצד הטכני, המונעים מהידע שלנו להתקדם. ראשית, קשה מאוד ללכוד את הדינמיקה של תאים בתגובה לגירויים מכניים הנגרמים על ידי בועות4. בסקאלת הזמן האקוסטית, תנודות המיקרו-בועות מסדר ראשון יכולות להוביל להפעלה של תעלות ממברנה, מה שמקל על מעבר מולקולרי בין ממשקים ביולוגיים. זה קורה באמצעות תנודה ישירה של קרום התא, המכונה גם "עיסוי תאי"5. הפעלת תעלה בעקבות לחץ מכני ישיר הודגמה באמצעות טכניקות מהדק טלאי שמדדו תכונות אלקטרופיזיולוגיות של קרום התא במהלך ואחרי חשיפה לאולטרסאונד6. מדידת דינמיקה תאית הנגרמת על ידי בועות (כלומר שדה העיוות המלא של קרום התא) בסקאלת הזמן האקוסטית, תספק גם תובנות לגבי סף התרחבות שטח הממברנה Δ A/A הנדרש כדי לגרום לנקבוביות לתוך קרום התא7. המחסום השני הוא שליטה במשטר הבועות הקורסות כדי למנוע ליזה של תאים הנגרמת על ידי מיקרו-בועות. קריסת בועות ומיקרו-סילונים מושרים זוהו כמנגנון שבאמצעותו מתרחש ניקוב הממברנה 8,9. לאחר החדירה, קרום התא מתקן באמצעות איטום עצמי של סידן של שתי שכבות השומנים ואיחוי של שלפוחיות תוך תאיות9. התרחשות של קריסת בועות עלולה גם לגרום לנזקים קטלניים לתא ולגרום לתופעות לוואי מיותרות בתאים הסובבים אותו. ביישומים רגישים כגון פתיחת מחסום דם-מוח בתיווך אולטרסאונד, מקובל כי יש להימנע מקריסת בועות אינרציאליות10.
לכן, מאמצים אדירים מוקדשים כיום לתכנון רצפי פליטת אולטרסאונד, יחד עם ניטור ובקרה פסיביים של קוויטציה, על מנת להבטיח תנודות יציבות של מיקרו-בועות11. במשטר יציב זה, הועלתה השערה כי בועות מתנדנדות ביציבות ממלאות תפקיד חזק בהפעלת חדירת הממברנה על ידי קידום לחץ גזירה ממוקד מרחבית על קרום התא7. עקת הגזירה נובעת מזרימות הנוזל הנוצרות בקרבת הבועות המתנדנדות. זרימות נוזליות אלה נקראות מיקרו-זרם קוויטציה, וכפי שהוזכר לעיל, הן אחד מכמה מנגנונים אפשריים האחראים לספיגה מוגברת של מולקולות חוץ-תאיות. כאשר מתמודדים עם השעיה של בועות או תאים כגון טרנספקציות ביולוגיות במבחנה12, חלחול על ידי מיקרו-סטרימינג עשוי להיות יעיל הרבה יותר מאשר חלחול על ידי קריסת בועות. ניתן להראות זאת על ידי שיקול גיאומטרי פשוט. בתרחיפים של תאים, סונופורציה תהיה יעילה אם רוב התאים המרחפים מוגשים להשפעות מכניות גדולות מספיק (מה שמוביל לחדירות הממברנה). ידוע שקריסת בועות מכוונות לכיוון שבירת הסימטריה האיזוטרופית, כגון ציר קיר הבועה13 או קו הבועה-בועה וקו תאי הבועה המתחברים למרכז המסה14 שלהם. המיקרו-סילון המיוצר הוא אפוא תופעה מרחבית-מקומית לאורך מספר סופי של קווים המצטרפים למרכזי התא והבועות. בהתאם לריכוז התא והבועה, כמו גם למרחק תא הבועה, השפעה זו עשויה שלא להיות היעילה ביותר לחדור את כל מספר התאים המרחפים . לעומת זאת, מיקרו-סטרימינג קוויטציה הוא תופעה המתרחשת בסקאלת זמן איטית, עם התרחבות מרחבית גדולה בהשוואה לרדיוס הבועה. כמו כן, זרימת הנוזל מפוזרת סביב הבועה, ולכן עשויה להשפיע על מספר גדול יותר של תאים, בטווח ארוך מאוד. לכן, הבנת המיקרו-זרימה של הקוויטציה הנוצרת סביב בועה מתנדנדת היא תנאי מוקדם לשליטה וכימות של עקה גזירה הנגרמת על ידי בועה המופעלת על תאים.
כדי לעשות זאת, שלב מקדים מורכב משליטה בתנודות הכדוריות והלא כדוריות של בועה מונעת אולטרסאונד, שכן זרימות הנוזל הנוצרות מושרות על ידי תנועת ממשק הבועות15,16. בפרט, תנודות צורה של מיקרו-בועות צריכות להיות מופעלות ולשמור על יציבות. יתר על כן, יש לשלוט בכיוון תנודות צורת הבועה כדי לנתח כראוי את המתאם בין דינמיקת ממשק הבועות לבין תבנית המיקרו-זרימה המושרה. כאשר מסכמים את הספרות הקיימת, ברור כי תוצאות ניסוי מפורטות של מיקרו-סטרימינג המושרה על ידי קוויטציה זמינות רק עבור בועות המחוברות למשטח. מיקרו-בועות המחוברות לקיר משמשות בדרך כלל להערכת דינמיקת ממשק מדויקת ואינטראקציות תאים בקנה מידה מיקרומטרי תחת מערכת מיקרוסקופיה מהירה במיוחד. תצורה זו רלוונטית מבחינה טיפולית כאשר בוחנים מיקרו-בועות רוטטות הממוקמות על קרום התא17,18,19. עם זאת, המחקר של בועה המחוברת למצע עשוי להפוך את ניתוח דינמיקת הבועות למסובך יותר, בין היתר בשל האופי המורכב של דינמיקת קו מגע20, והפעלת מצבי צורה אסימטריים21. ביישומים רפואיים וביולוגיים, בועות שאינן מחוברות לקיר נמצאות בדרך כלל בגאומטריות סגורות כגון כלי דם קטנים. זה משפיע באופן משמעותי על דינמיקת הבועות ועל חוסר יציבות בצורה. בפרט, נוכחותו של קיר סמוך מזיזה את סף הלחץ עבור מצב צורה ומפעילה ערכי לחץ נמוכים יותר בהתאם למספר מצב הצורה ולגודל הבועה22. הקיר משפיע גם על המיקרו-סטרימינג המושרה על ידי בועות עם עוצמה גבוהה יותר עבור הזרימה המיוצרת23.
בין כל התרחישים האפשריים שמיקרו-בועות עשויות לחוות (חופשיות או מחוברות, קרובות לקיר, קורסות או מתנדנדות ביציבות), אנו מציעים לחקור את הדינמיקה הלא-כדורית של בועה בודדת הרחוקה מכל גבול. מערך הניסוי מבוסס על מערכת ריחוף אקוסטי24 שבה נעשה שימוש בגל אולטרסאונד עומד כדי ללכוד את הבועה. תרחיש זה עולה בקנה אחד עם יישומים רפואיים שבהם אוסף של בועות ותאים מרחפים מתקיימים יחד בתא סונוטרנספקציה, למשל. ככל שבועות ותאים אינם קרובים מדי, ההנחה היא כי נוכחותו של תא אינה משפיעה על הדינמיקה של ממשק הבועה. כאשר תאים עוקבים אחר המסלולים דמויי הלולאה של המיקרו-זרם המושרה על ידי קוויטציה, הם מתקרבים באופן מחזורי ודוחים את מיקום הבועה, ואנו יכולים להניח שנוכחות התא אינה משפיעה על תבנית הזרימה או על מהירותה הממוצעת. בנוסף, דינמיקה לא כדורית ומיקרו-זרם מושרה מבועות בודדות הרחוקות מהגבול ידועות היטב מנקודת מבט תיאורטית. על מנת לקשר את זרימת הנוזל המושרה על ידי הבועה לדינמיקה של קווי המתאר של הבועה, נדרש לאפיין במדויק את דינמיקת ממשק הבועות. לשם כך, עדיף להתאים את קנה המידה המרחבי-זמני במחקרים ניסיוניים ביחס לאלה המשמשים בטיפולים, כך שרכישה עם מצלמות מהירות נפוצות (מתחת למיליון פריימים לשנייה) תתאפשר באמצעות בועות גדולות המעוררות בתדרים נמוכים יותר. כאשר בוחנים בועות לא מצופות, התדירות העצמית ω n של מצב נתון n קשורה לגודל הבועה כ-25
. יחס רדיוס-תדר עצמי זה משתנה מעט כאשר בוחנים בועות פגזיות26, אך סדר הגודל של התדר העצמי ωn נשאר זהה. לפיכך, חקירת בועות עם רדיוסי שיווי משקל ~50μm בשדה אולטרסאונד של 30 קילוהרץ דומה לחקר בועות מצופות של רדיוסים ~3μm בשדה של 1.7 MHz, כפי שהוצע על ידי Dollet et al.27. לכן צפויים מספרי מצב צורה דומים ולכן דפוסי מיקרו-סטרימינג.
כדי להפעיל תנודות לא כדוריות של ממשק הבועות, יש צורך לעבור סף לחץ מסוים שהוא תלוי רדיוס, כפי שמוצג באיור 1. טכניקות ניסוי קיימות מסתמכות על עליית הלחץ האקוסטי כדי להפעיל מצבי משטח (מודגמת על-ידי נתיב (1) באיור 1), על-ידי עליית לחץ שלב אחר שלב28 או על-ידי עירור משרעת מווסתת האחראי להתחלה מחזורית ולהכחדה של מצבי משטח29. החסרונות העיקריים של טכניקות אלה הם: (i) כיוון אקראי של ציר הסימטריה של תנודות פני השטח שלא ניתן לשלוט בהן כדי להיות במישור ההדמיה, (ii) משך חיים קצר של תנודות צורת הבועה המקשות על ניתוח זרימות הנוזל המושרות בסקאלות זמן גדולות יותר, ו-(iii) הפעלה תכופה של מצבי צורה לא יציבים. אנו מציעים טכניקה חלופית לחציית סף הלחץ בלחץ אקוסטי קבוע במפת הרדיוס/לחץ, כפי שמודגם בנתיב (2) באיור 1. לשם כך נדרש להגדיל את גודל הבועה כך שתהיה באזור חוסר היציבות. עלייה כזו מבוצעת על ידי טכניקת התלכדות בועה. ההתלכדות של שתי מיקרו-בועות, שבתחילה מתנודדות כדורית, מנוצלת ליצירת בועה מעוותת אחת. אם הלחץ האקוסטי וגודל הבועה של הבועה המתמזגת נמצאים באזור חוסר היציבות, מופעלים מצבי משטח. כמו כן, הראינו כי טכניקת ההתלכדות גורמת לתנודות צורה יציבות במשטר מצב יציב, כמו גם ציר סימטריה מבוקר המוגדר על ידי התנועה הישרית של שתי הבועות המתקרבות. מכיוון שתנודת צורה יציבה מובטחת במשך דקות, ניתוח זרימת נוזל הנגרמת על ידי בועה אפשרי על ידי זריעת התווך הנוזלי עם מיקרו-חלקיקים פלואורסצנטיים, מוארים על ידי יריעת לייזר דקה. רישום התנועה של המיקרו-חלקיקים המוצקים בקרבת ממשק הבועות מאפשר לזהות את תבנית זרימת הנוזל המושרה30. העיקרון הכולל של הפעלת תנודות בצורת בועה, המובילות לזרימת נוזל יציבה בזמן, מומחש באיור 2.
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את השלבים הדרושים ליצירת תנודות יציבות בצורת בועה באמצעות טכניקת ההתלכדות ומתארים את המדידות של זרימת הנוזל. זה כולל את העיצוב של מערכת הריחוף האקוסטי, הכיול האקוסטי, נוקלציית בועות וטכניקת ההתלכדות, מדידת דינמיקת ממשק הבועות וזרימת הנוזל שמסביב, ועיבוד התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכנון תא הריחוף האקוסטי
- תכנן מיכל מעוקב שקוף אופטית (דמוי PMMA) (קצה 8 ס"מ ועובי 2.8 מ"מ לכל פנים) עם מודול הגיאומטריה של תוכנת סימולציה מולטיפיזיקלית (Table of Materials).
- הכנס משטח גלילי (Ø = 35 מ"מ) במרכז תחתית המיכל, כדי למדל את המתמר העל-קולי.
- הגדר את תנאי הגבול לאפס לחץ על כל קיר עם תזוזה רגילה של משרעת 1 מיקרומטר על פני המתמר.
- באמצעות מודול תחום תדרים, דמה את פונקציית תגובת התדר (FRF) של המיכל בתחום התדרים [10 - 40] קילוהרץ, בשלושת המיקומים השרירותיים loc1 = (0.01375, 0.01375, 0.04125), loc2 = (0, 0, 0.0088), ו- loc3 = (0.021725, 0.023375, 0.00935).
- להתאים את גודל המיכל כך שאחד המצבים האקוסטיים של החלל מתאים לתדר הנומינלי של המתמר (כאן 31.2 קילוהרץ). לפיכך, ה-FRF מכיל שיא תהודה אחד קרוב לתדר זה, כפי שמודגם באיור 3.
- שרטט את שדה הלחץ בתוך המיכל, כפי שמוצג באיור 4. מצב התהודה שנבחר חייב להכיל לפחות אנטי-צומת לחץ אחד בחלק הפנימי של המיכל, שעליו תילכד הבועה האקוסטית.
- בעת תכנון המיכל, עצב משטח עליון נייד עם חריץ מנחה בכל קצה כדי לסגור היטב את פני המיכל. קדח חור זעיר בחלק העליון על מנת למלא את המיכל בתווך הנוזלי.
- הניחו את מיכל המים על גבי מסגרת ביתית המכילה את מתמר האולטרסאונד (מסוג לנגווין, תדר נומינלי של 31.2 קילוהרץ). השתמשו בג'ל אקוגרפי כדי להצמיד את המתמר לדופן התחתונה של המיכל.
- הניחו את המיכל ואת מערכת המסגרת על גבי טבלת תזוזה תלת כיוונית עם ברגים מיקרומטריים.
- מלא את המיכל עם microfiltered, demineralized ומים (לא degassed, נפח ~ 500mL, רוויון חמצן של כ 8 מ"ג· L-1).
הערה: שימוש במים שאינם מפורקים בגז במקום במים מנוטרלים מאפשר לשמור על בועות יציבות למשך הניסויים. שימוש במים נטולי גזים יאיץ את התכווצות הבועות עקב דיפוזיית גזים, גם אם היא מאוזנת מעט על ידי דיפוזיה מתוקנת (בתיווך אולטרסאונד).
2. יצירת בועות וכיול אקוסטי
- הכינו את מערך הניסוי המשמש לנוקלציה של בועות המושרה על-ידי לייזר, עירור אקוסטי והקלטה במהירות גבוהה (איור 5a,b,c). מערך הניסוי מורכב מ-(A) מערכת הריחוף האקוסטי, (B) ספק הכוח של הלייזר ו-(C) ראש הלייזר, (D) עדשה כדורית קעורה אחת, (E) עדשה קעורה פלאנו אחת ועדשה אספרית אחת, (F) המצלמה המהירה, (G) הדיודה המתמשכת פולטת האור. מאוחר יותר, למדידות של זרימות נוזלים (איור 5d) (H) יתווסף מקור לייזר גל רציף אחד, (I) תתווסף עדשה גלילית פלנו-קעורה ואחריה עדשה גלילית פלנו-קעורה המוכנסת מאחורי העדשה הראשונה ומכוונת על הציר האורתוגונלי.
- חבר את מתמר האולטרסאונד למחולל פונקציות. הגדר את אות העירור כ: צורת גל סינוסואידית, גל רציף, תדר 31.2 קילוהרץ. המשרעת היא הפרמטר המשתנה היחיד.
- הניחו את העדשה (D) במרחק של כ-6 ס"מ לפני ראש הלייזר (C).
- מקם את העדשה (E) במרחק של כ-12 ס"מ לפני העדשה (D).
- מקם את מיכל המים (A) כך שנקודת מיקוד של הלייזר ממוקמת בתוך מיכל המים, מה שמוביל ליצירת ניצוץ לכל פולס לייזר (5-10 mJ). ניצוץ הלייזר צריך להיות ממוקם כ -3 ס"מ מתחת לצומת הלחץ הממוקד.
הערה: ללא אולטרסאונד (US), בועה גרעינית בלייזר תעלה לפנים העליונות עקב ציפה. - הפעל את מתמר האולטרסאונד. הגדל את המתח המופעל עד שהבועה כבר לא עולה אנכית אלא סוטה לכיוון צומת הלחץ, ועבור לחץ גבוה מספיק, נלכדת.
- הגדר את התאורה האחורית (דיודה פולטת אור רציפה) ואת המצלמה במהירות גבוהה כדי לצפות בבועה הלכודה.
הערה: בעת יצירת בועה חדשה באמצעות ניצוץ לייזר, קל ללכוד את מסלול הבועה המתקרבת למקום הלכידה שלה. - הזז את מיקום ניצוץ הלייזר בתוך מיכל המים כך שמסלול הבועה יישאר בתוך מישור המוקד של המצלמה.
- מלכודת בועה אחת וללכוד את התנודות הרדיאליות שלה עם הפרמטרים הבאים: גודל מסגרת 128 x 128 פיקסלים, קצב רכישה 180 קילוהרץ. דוגמה לתנודות רדיאליות באמפליטודה גדולה על פני שתי תקופות אקוסטיות מוצגת באיור 6. גודל בועות גז טיפוסי נע בין 30 ל -80 מיקרומטר.
- הקלט את התנודות הרדיאליות של הבועות במהלך 3 עד 30 אלפיות השנייה על מנת ללכוד מאות עד אלפי תנודות בועות. חזור על הקלטה זו להגדלת המתחים המופעלים של המתמר. מתחים מופעלים אופייניים הם בטווח של 0 - 8 V.
הערה: בעת שינוי המתח המופעל, מיקום שיווי המשקל של הבועה הכלואה נע מעט אנכית. כדי לעקוב אחר התנודות מבלי להזיז את התאורה האחורית והמצלמה, הניחו את המערכת (מתמר ומיכל מים) על שולחן נייד בעל שלושה כיוונים בדיוק מיקרומטרי. - הפעל את מתמר האולטרסאונד וצלם תמונה אחת של הרקע לניתוח שלאחר הניתוח.
- לאחר התהליך של סדרת הסרטונים בעקבות הליך זה:
- הפעל את קובץ ההפעלה VoltagePressure.exe. הממשק המוצג באיור 7 אמור להיפתח.
הערה: קובץ ה-script זמין כמסמך משלים. - ציינו את הפרמטרים הפיזיים והניסיוניים בעמודה השמאלית (איור 7A).
- ציין את ערכי המתח המופעל עבור סדרת ההקלטות בטבלה הימנית התחתונה (איור 7B).
- בחלונית ניתוח רדיוס הבועה , לחצו על פרמטרי טעינה (איור 7C) ובחרו את התיקייה המכילה את כל הקבצים של סדרת הסרטונים שלכם, ולאחר מכן את תמונת הרקע (חובה).
- הבחירה מותרת בין ניתוח כל הסרטונים בבת אחת, על ידי לחיצה על אוטומטי, או אחד אחד על ידי לחיצה על צעד אחר צעד.
- עבור כל קובץ וידאו, האבולוציה של רדיוס הבועה משורטטת על פני תקופה אקוסטית אחת, והתאמה מספרית מונחת. העקומה האדומה מתאימה למודל ליניארי של ריילי-פלסט. רדיוס בועת שיווי המשקל מוצג (איור 7D).
- על פי ההתאמה המספרית, הלחץ המופעל עבור מתח זה מוצג בלוח הגרף לחץ (מתח) (איור 7E). הערך של הלחץ המופעל מוצג גם בטבלה הימנית התחתונה (איור 7B). לחצים מופעלים אופייניים המתאימים לדינמיקת מתח 0 - 8 V הם 0 - 25 kPa.
- לאחר עיבוד כל הסרטונים, לחץ על כפתור רגרסיה ליניארית כדי לבצע התאמה ליניארית של עקומת הלחץ / מתח. הנתונים (ערכי מתח ולחץ) נשמרים בקובץ .txt הממוקם בספריה הנוכחית. שיפוע ההתאמה מסופק.
- הפעל את קובץ ההפעלה VoltagePressure.exe. הממשק המוצג באיור 7 אמור להיפתח.
3. טכניקת התלכדות
- הפעל את מתמר האולטרסאונד. הגדר את המתח המופעל גבוה מספיק כך שהלחץ האקוסטי המתאים עלול להוביל להפעלת אי יציבות פני השטח, על פי דיאגרמת הלחץ/רדיוס המספרית של אזורי אי-יציבות, כפי שמוצג באיור 8.
- גרעין בועה, אשר לאחר מכן תעבור למקום הלכידה שלה. אם הבועה הכלואה מציגה רק תנודות כדוריות, עבור לשלב הבא. אם מופיעות תנודות לא כדוריות:
- כבו את כוח האולטרסאונד כדי לאפשר לבועה לעלות למשטח העליון.
- שנה את אנרגיית הלייזר (על ידי כוונון עדין על פני כמה mJ) או הפחת את מתח המתמר.
- הפעל את כוח האולטרסאונד.
- גרעין בועה חדשה.
- חזור על הליך זה עד שגודל הבועה מוביל לתנודות כדוריות בלבד.
- כאשר בועה לכודה מציגה תנודות כדוריות בלבד, נוצר ניצוץ לייזר חדש. כאשר הבועה החדשה מגיעה למקום ההשמנה, מתרחשת התלכדות.
- אם הבועה המתלכדת מציגה תנודות כדוריות בלבד, נוצר בועה חדשה. ייתכן שיהיה צורך בהתלכדות מרובה כדי להגיע לרדיוס הבועה שבו מתרחשים עיוותים לא כדוריים. דוגמה להתלכדות בועות המובילה לתנודות לא כדוריות מוצגת באיור 9.
- ברגע שהבועה המגובשת מציגה תנודות לא כדוריות, רשמו את תנודות הבועות למשך זמן של כ-3 עד 30 אלפיות השנייה.
- זהו את מספר תנודות הצורה על-ידי התייחסות לאיור 10.
4. מדידות זרימת נוזלים
- במקרה של מדידות מיקרו-סטרימינג קוויטציה, יש להוסיף חלקיקי נותב פלואורסצנטיים למים לפני התגרענות הבועות. במחקר זה נעשה שימוש בחלקיקים של 0.71 מיקרומטר (Table of Materials). הם קטנים מספיק כדי להיות שקופים אקוסטית (לא מושפעים מכוח הקרינה האקוסטית) ולעקוב במדויק אחר הזרימה, כמו גם גדולים מספיק כדי לפזר אור לייזר. השתמש בשלוש טיפות עבור נפח מיכל המים, המתאים בקירוב 2.104 חלקיקים / מ"מ3.
- לפני ביצוע המדידות, הגדר את הפרמטרים הבאים ללכידת דינמיקת הבועות (ציר הזמן המהיר) וזרימת הנוזל (בקנה מידה נמוך):
- צור מחיצות של דיסק ההקלטה של המצלמה.
- לחלופין, הגדר את פרמטרי ההקלטה כ:
- קצב פריימים 180 קילוהרץ, גודל מסגרת 128 x 128 פיקסלים וזמן חשיפה 1 μs להקלטה אחת של הדינמיקה של ממשק הבועות
- קצב פריימים 600 הרץ, גודל מסגרת 1024 x 768 פיקסלים וזמן חשיפה של אלפית שנייה אחת להקלטה אחת של תנועת עוקבי צבע.
- השתמש בלייזר רציף.
- צור יריעת לייזר דקה על ידי מתן אפשרות לקרן הלייזר לעבור ברצף דרך עדשה גלילית קעורה פלאנו ועדשה גלילית פלאנו-קמורה המכוונת על ציר אורתוגונלי. ניתן לקבל רוחב קרן של כ-160 מיקרומטר.
- הגדר את גיליון הלייזר כך שיתאים למישור ההדמיה:
- הגדר את הלייזר במכשיר נייד כך שניתן יהיה להזיז את יריעת הלייזר במקביל למישור ההדמיה.
- כוונן את המיקום כך שהחלקיקים המוארים יהיו גלויים על ידי המצלמה.
- לאטום וללכוד בועה.
- התאם את מיקום יריעת הלייזר עוד יותר, כך שצל ייראה מאחורי הבועה. הבועה נמצאת כעת בתוך יריעת הלייזר, כפי שניתן לראות באיור 11.
- השראת התלכדות בועות עד להופעת מצב צורה מתנודד יציב.
- בצע מספר הקלטות העוברות הלוך ושוב בין דינמיקת בועות למיקרו-סטרימינג.
הערה: כבה את מדפסת הלייזר הרציפה כאשר אין בה צורך. חימום יכול ליצור זרימות הסעה לא רצויות. כמו כן, כבה את הדיודה פולטת האור בעת ביצוע מדידות זרימת הזרימה.
5. עיבוד תמונה כדי להמחיש את דפוסי microstreaming cavitation
- התקן את תוכנת ההדמיה ImageJ לעיבוד וניתוח תמונה ב- Java. התקן גם את התוסף CINE File Reader כדי לפתוח את קבצי המצלמה במהירות גבוהה.
- לחץ על קובץ | ייבוא | CineFile ובחר את הווידאו *.cine המכיל את לכידת תנועת החלקיקים.
- בחר השתמש בערימה וירטואלית בחלון החדש, הסרטון נטען כעת.
- על מנת לצפות בתנועת החלקיקים מבלי להציג את תבנית ההזרמה, לחץ על תמונה | התאמה | בהירות/ניגודיות | אוטומטי. הרקע הכהה מוחלף כעת בתמונה הממוטבת אוטומטית.
- על מנת להציג את הדפוס המתקבל, לחץ על תמונה | ערימות | Z Project ובחר באפשרות Max Intensity להקרנת התמונה. תוצג תמונת פלט עם פיקסלים הכוללים את הערך המרבי על כל התמונות באוסף. התאם את ניגודיות התמונה כמתואר בשלב 5.4, במידת הצורך.
הערה: מתקבלת תבנית זרימה כמו זו שמוצגת באיור 12b ובאיור 12d.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רצף שלם של התלכדות בועות המוביל לתנודות לא-כדוריות יציבות בזמן ומבוקרות סימטריה מוצג באיור 9. השלב המתקרב של שתי בועות מתנדנדות כדורית מסתיים כאשר הסרט הנוזלי הדק בין שתי הבועות נקרע. ראוי לציין כי בשלב האחרון לפני ההתמזגות, ממשקי הבועה חורגים מהספיריות. שתי הבועות מתארכות בצורה אליפסואידית לאורך נתיב התנועה הישר של ההתקרבות. לאחר רגע ההתמזגות נשארת בועה בודדת המציגה תנודות לא כדוריות בעלות צורה מורכבת במהלך מספר תקופות אקוסטיות. זה מתאים למשטר חולף של תנודות, בעקבות עירור של כל מערכת דינמית. לאחר תריסר עד מאה תקופות אקוסטיות תנודות הצורה מתייצבות על תנודה במצב יציב, כאן מוצג עבור מצב 4, כפי שניתן להסיק מהפרשנות של איור 10. מצב זה עשוי להימשך אלפי פרקי זמן אקוסטיים, למשך מספר אלפיות שנייה עד מספר דקות. זה מאפשר מדידות כמו-סימולטניות של זרימות נוזל המושרות על ידי בועות.
ברגע שבועה נלכדת ומציגה תנודות צורה יציבות, התנועה של נותבי פלורסנט בסביבת הבועה נלכדת, כפי שמוצג באיור 11. ראשית, היעדר תנועת חלקיקים עבור בועה המציגה תנודות כדוריות בלבד עולה בקנה אחד עם מספר מודלים מיקרו-סטרימינג של קוויטציה31 המעידים כי אין מערבולות המושרה על ידי תנודות רדיאליות טהורות. כאשר מתרחשות תנודות צורה, נוצרת תנועה נוזלית בקרבת ממשק הבועות, כפי שמוצג באיור 12. ההקלטה החלופית של הדינמיקה של ממשק הבועות בסקאלת הזמן האקוסטית (איור 12a,c) ושל תנועת חלקיקים בסקאלת זמן נמוכה יותר (איור 12b,d) מאפשרת להתאים את תבנית המיקרו-זרימה למספר מצב צורה נתון. איור 12a מציג סדרת תצלומי בזק של דינמיקת הבועות עבור בועה ברדיוס ממוצע R0=70.5 מיקרומטר, המונעת בלחץ האקוסטי Pa=12.8 kPa, המתנדנד בעיקר במצב 3. תבנית המיקרו-זרימה המשויכת, באיור 12b, מורכבת משש אונות. שימור ציר הסימטריה בין תנודות מצב הצורה לבין תבנית המיקרו-סטרימינג נראה בבירור. איור 12c מציג סדרת תצלום בזק של דינמיקת הבועות עבור בועה ברדיוס ממוצע R0=55.7 מיקרומטר, המונעת בלחץ האקוסטי Pa=23.6 kPa, המתנדנד בעיקר במצב 4. תבנית המיקרו-זרימה המשויכת באיור 12d מורכבת משמונה אונות קטנות בגודל קוטר הבועה. שוב, שימור ציר הסימטריה בין תנודות מצב הצורה לבין תבנית המיקרו-זרימה נראה בבירור. נראה כי תוצאות אלה מאשרות כי ככל שמצבי הצורה מסדר גבוה יותר, כך תבנית המיקרו-סטרימינג קטנה יותר והם מוגבלים יותר בסביבת הבועה.
הנחה זו של תבנית זרימה צרה יותר עבור מצבים מסדר גבוה יותר אינה ברורה כל כך ותלויה בתוכן המודאלי של דינמיקת ממשק הבועות. אכן, עלינו לזכור שזרימת נוזל הנגרמת על ידי בועה נובעת מאינטראקציות בין שני מצבי צורה המתנדנדים באותה תדירות, או מהאינטראקציה העצמית של מצב עם עצמו31 . בועה המתנדנדת בעיקר במצב צורה נתון, למשל נניח למצב 3, עשויה לעורר תנודות לא כדוריות אחרות באמצעות צימוד לא ליניארי בין מצבים29. אם הדינמיקה של ממשק הבועות מכילה מצבים משלימים, כמו השני והרביעי (למשל), אז זרימת המיקרו-זרם יכולה להשתנות באופן משמעותי בגלל האינטראקציות המרובות בין מצבים שייצרו דפוסים ספציפיים. זה מודגם באיור 13 עבור שתי בועות שמתנדנדות בעיקר במצב 3, שגורמות לשני דפוסי מיקרו-זרימה שונים. באיור 13a,b,c, בועה של רדיוס שיווי משקל R0 = 70.1 מיקרומטר, המונעת בלחץ אקוסטי Pa=12.4 kPa, מתנודדת במצב 3, מציגה תבנית מסוג אונה. ניתוח דינמיקת הממשקים (איור 13b) מגלה כי המצבים השולטים הם הרדיאלי (מתנדנד בתדירות הנהיגה f 0), התרגום (מצב עם מספר 1, מתנדנד במחצית מתדירות הנהיגה f 0), השלישי (מתנדנד ב-f 0/2) ומצב רביעי ושישי קטן יחסית (שניהם מתנדנדים ב-f 0). ניתן לשער כי התרומה העיקרית לזרימת המיקרו-זרם היא האינטראקציה בין המצב הרדיאלי למצב 4 ו-6, מה שמוביל לתבנית מסוג אונה31. באיור 13d,e,f, בועה של רדיוס שיווי משקל R0 = 68.6 מיקרומטר, המונעת בלחץ אקוסטי Pa = 13.3 kPa, מתנודדת במצב 3, מציגה תבנית מסוג צולב, עם הארכת זרימה למרחקים גדולים. ניתוח דינמיקת הממשק (איור 13d) מגלה כי המצבים השולטים הם הרדיאלי, התרגום (מצב עם מספר 1), השלישי והשישי. על פי המשרעת הגבוהה של מצב 3, ניתן לשער כי התרומה העיקרית לזרימת המיקרו-זרם היא האינטראקציה העצמית של מצב 3, המובילה לתבנית מסוג32.
איור 1. איור של השיטה להפעלת תנודות צורה. מפת הלחץ/רדיוס מכילה אזור אי-יציבות אחד לכל מצב של מעלה נתונה. ניתן לחצות את סף הלחץ כדי להגיע לאזור זה על ידי (1) הגדלת הלחץ האקוסטי המופעל המניע בועת גז ברדיוס קבוע, עד להופעת מצבי צורה, או (2) הגדלת גודל הבועה בלחץ אקוסטי מופעל קבוע. עלייה כזו בנפח הבועה מתרחשת לאט כאשר מתרחשת דיפוזיה מתוקנת, בעוד התלכדות הבועות מהדקת משמעותית את התהליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. איור של טכניקת התלכדות הבועות. השלב המתקרב (A) מורכב משתי בועות הפוגשות זו את זו באותו מקום לכידה בתוך המיכל. כאשר הם נפגשים, מתרחשת התלכדות: קרע של הסרט הנוזלי הדק בין בועות (B) מוביל ליצירת בועה אחת, מעוותת בתחילה. בועה מעוותת זו מונעת על ידי שדה האולטרסאונד המונוכרומטי ומציגה תחילה תנודות חולפות (C), לפני הכניסה למשטר המצב היציב. במשטר המצב היציב (D), הבועה המגובשת מציגה תנודות צורה יציבות בזמן ומבוקרות סימטריה. על ידי זריעת התווך עם ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים, זרימת הנוזל המושרה על ידי הבועה נלכדת (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תגובת תדר פונקציה של שדה הלחץ בתוך מערכת הריחוף. המשרעת של הלחץ האקוסטי מוצגת כפונקציה של התדר, עבור שלושה מיקומים בתוך המיכל המתאימים לקואורדינטות הבאות (x,y,z): (1) כחול, (2.05,2.05,6)ס"מ, (2) אדום, (0,0,1.28)ס"מ ו-(3) שחור, (3.23,3.48,1.36)ס"מ, כאשר מקור מערכת הקואורדינטות נלקח במרכז הפן התחתון של המיכל המעוקב. קרוב ל-31.5kHz ניתן לראות בבירור מצב תהודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. התפלגות הלחץ האקוסטי בתוך תא הריחוף. (A) ייצוג תלת-ממדי של שדה הלחץ בתוך מכל המים המעוקב עבור מצב התהודה שנבחר. מצב זה מתרחש בתדר 31.2 קילוהרץ המתאים לתדר מקור האולטרסאונד. (B) התפלגות הלחץ האקוסטי במישור האלכסוני של המיכל. (C) התפלגות הלחץ האקוסטי במישור אופקי (גובה z=קבוע). הגובה נבחר כך שהוא מתאים למיקום של אנטינוד הלחץ בחלק העליון של המיכל. המשרעת של סרגל הצבע מתקבלת על ידי הטלת תזוזה רגילה של 1 מיקרומטר על פני השטח המתמר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. תצלומים וסכמות של מערך הניסוי. היא מורכבת מ-(A) מערכת הריחוף האקוסטי, (B-C) מגבר הלייזר הפועם וראש הלייזר, (D-E) מערכת עדשות המיקוד, (F) המצלמה המהירה, (G) הדיודה פולטת האור, (H) לייזר הגל הרציף ו-(I) מערכת העדשות המעצבות. (א) צד ו-(ב) מבט מלמעלה על מערך הניסוי. (ג) איור החומרים הדרושים ללכידת תנודות הבועות. שים לב שהלייזר הרציף (H) כבוי במהלך תהליך זה. (ד) המחשה של החומרים הדרושים ללכידת זרמי הנוזלים. שימו לב שהלייזר הפועם (C) לנוקלציית בועות כבוי, בעוד שהלייזר הרציף (H) ליצירת יריעת לייזר המאירה את עוקבי המיקרו-חלקיקים מופעל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. סדרת תצלומי בזק של בועה מונעת אולטרסאונד המציגה תנודות כדוריות באמפליטודה גדולה. רדיוס שיווי משקל הבועה הוא ~ 60 מיקרומטר, והלחץ האקוסטי המניע הוא ~ 15 kPa. מרווח הזמן בין שתי תמונות עוקבות הוא 5.6 μs. הסדרה כולה מתכתבת עם שתי תקופות אקוסטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. לוח ממשק של סקריפט ההפעלה PVR_Interface.exe. הסקריפט מפעיל ממשק משתמש גרפי המכיל (A) פאנל לקביעת הפרמטרים הפיזיים, (B) טבלה להגדרת המתח החשמלי המופעל על המתמרים, (C) האפשרות לטעון את כל סט הסרטונים המוקלטים המעובדים לאחר מכן ומספקים את רדיוס בועות שיווי המשקל (D) והלחץ האקוסטי המופעל (B), העלילה של יחסי לחץ/מתח (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8. דיאגרמת לחץ/רדיוס של אזורי אי-יציבות. כל אזור צבעוני מתאים לאזור אי-יציבות עבור מצב צורה נתון: (אזור כחול) מצב 2, (אזור ירוק) מצב 3 ומצב (אזור אדום) 4. האזור הלבן מתאים למקרה שבו מיקרו-בועות מציגות תנודות כדוריות בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9. סדרת תצלומי בזק של התלכדות בועות המובילה לתנודות צורה. לאחר השלב המתקרב של שתי בועות, הסרט הדק ביניהן נקרע ומתרחשת התלכדות. בועה בודדת מונעת כעת על ידי שדה האולטרסאונד, תחילה במשטר תנודות חולף. לאחר כמה תקופות אקוסטיות משטר המצב היציב נקבע על מצב צורה צירית, כאן מצב 4. מרווח הזמן בין שני תצלומים עוקבים הוא 30 μs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10. חמשת מצבי הצורה הצירים-סימטריים הראשונים, כולל המצב הרדיאלי. מבט מהצד על קווי המתאר של ממשק הבועות המוצג בשני קצוות של משרעת התנודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11. חלקיקי נותב פלואורסצנטיים סביב מיקרו-בועות מתנדנדות כדורית. שתי התמונות תואמות לסופרפוזיציה של 100 תצלומי בזק המכסים 0.25 שניות. (א) לא ניתן להבחין בתנועה של חלקיקי הנותב אם אין תנודות צורה. (ב) זרימה ממוצעת של טפיל הנראית בכל שדה הראייה יכולה להופיע, למשל, עקב חימום יריעת הלייזר. עם זאת, זרימה זו אינה קשורה לתנועת הבועה. בשתי התמונות נראה בבירור הצל המושרה על ידי יריעת הלייזר מאחורי הבועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12. הקלטה כמו-סימולטנית של דינמיקת הבועות והמיקרו-הזרמה המושרה. עמודה שמאלית: סדרת תצלום בזק של בועה אחת המציגה תנודות במצב צורה מסדר 3 (a) והמיקרו-זרם המושרה (b). עמודה ימנית: סדרת תצלום בזק של בועה אחת המציגה תנודות במצב צורה מסדר 4 (c) והמיקרו-סטרימינג המושרה (d). עבור כל האיורים, הקו המקווקו האדום מתאים לציר הסימטריה הן של תנודות צורת הבועה והן של זרימות הנוזל, הנקבע על ידי התנועה הישר של שתי הבועות המתקרבות לפני ההתמזגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 13. דוגמה לשתי תבניות זרימה המושרות על ידי בועה המתנדנדת בעיקר במצב 3. (א,ד) איור וצילום מהיר של ממשק הבועות, (b,e) פירוק המצב של ממשק הבועות ו-(c,f) תבנית הזרימה המשויכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך המוצג מורכב משימוש בהתלכדות בועות על מנת להפעיל תנודות בצורת בועה במצב יציב, מבוקר סימטריה, המאפשר לחקור את זרימת הנוזל לטווח ארוך המושרה על ידי תנודות אלה. האתגר העיקרי בטכניקה הוא שליטה בתנודות לא כדוריות עבור בועה שנלכדת, הרחק מכל גבולות.
רוב הטכניקות הקיימות המוצעות בספרות התמקדו בבועותהמחוברות למצע 7,16, שכן היעדר תנועה של מרכז הבועות מקל על לכידת הממשק שלו בסקאלת הזמן האקוסטית (עד מאות קילוהרץ). בעוד שחריגה מסף הלחץ הדרוש להפעלת מצבי צורה היא משימה קלה במקרה זה, השליטה בתנודות הצורה מסובכת עקב שבירת הסימטריה הנגרמת על ידי המצע. בועה המחוברת לקיר באה במגע עם המצע בזווית מגע מסוימת, מה שמוביל להפעלת מצבי משטח אסימטריים21. בנוסף למורכבות של פירוש המצבים התלת-ממדיים, הא-סימטריים עם תצוגת מצלמה אחת בלבד, עולה מעבר פתאומי למשטר תנודות שטח כאוטי33. לכן, האתגר העיקרי הוא לכידת תנודות צורה של בועה בודדת, לכודה הרחק מכל גבול על מנת לקבל תנודות ציריות לא כדוריות. תנאים אלה מאפשרים השוואה בין ניסויים לבין המגוון הגדול של מחקרים אנליטיים הקיימים בספרות. הקושי הניסיוני העיקרי טמון ביציבות המיקום של המיקרו-בועה. כדי להתגבר על בעיה זו, נעשה שימוש בפינצטה אופטית כדי לשלוט בלכידת בועות34, ושדות אולטרסאונד מווסתים באמפליטודה משמשים ללכידה ולהנעת תנודות בועות29. בשני המקרים, בועה אחת נלכדת ומופעלים מצבים לא כדוריים. כמו כן, במקרה של שדה הנהיגה המווסת באמפליטודה, מצבי הצורה קיימים רק לפרק זמן קטן מכיוון שהם מתחילים ונעלמים מעת לעת. בנוסף, הכיוון של תנודות צורת הבועה אינו נשלט ומוביל להטיה בניתוח תנועת הממשק.
החלופה שאנו מציעים היא שימוש בלייזר פועם כדי לגרעין בועה בודדת, שנלכדה מאוחר יותר בצומת לחץ של תא ריחוף תהודה. על ידי גרעין בועות עוקבות לאורך זמן, כל בועה גרעינית נעה לעבר מקום הלכידה שלה, שכבר תפוס על ידי בועה אחרת. התלכדות מתרחשת וגורמת לממשק בועות מעוות בתחילה. אם לחץ הנהיגה חזק מספיק, תנודות הצורה מתמשכות. נוקלציית לייזר הועדפה על פני טכניקות נוקלציה אחרות, כגון אלקטרוליזה למשל, מכיוון שהיא מאפשרת יצירת בועות מהירה ואמינה. כפי שמודגם באיור 9, ציר הסימטריה של תנודות הצורה נתון על ידי ציר גישת הבועה לפני ההתלכדות. עם זאת, תוצאה עיקרית זו דורשת זמן רב יחסית לקביעת מערך הניסוי מכיוון שנדרש שהבועות יישארו בתוך מישור המוקד של המצלמה בשלב ההתלכדות (על מנת לכוון את ציר הסימטריה במישור זה). לשם כך, נעשים שינויים קלים באתר הגרעין של הבועות על מנת לייעל את הנתיב שבו הבועות נעות ופוגשות זו את זו. השינוי לאתר נוקלציית בועות דורש שינוי עדין של מיקום המיכל יחסית לנתיב הלייזר, ומבוצע בשלב תלת כיווני בדיוק מיקרומטרי. בנוסף, כוונון עדין של אנרגיית הלייזר מבוצע על מנת לייעל את גודל הבועה הגרעין. בועות גדולות מדי ייצרו מיד מצבי צורה עם מספר מצבים גבוה ויתקרבו לתהודה הבועתית הנפחית. זה מוביל לאי יציבות מיקום גבוהה של מרכז הבועה. בועות קטנות מדי ידרשו מספר רב של תהליכי התלכדות לפני שיגיעו לגודל המתאים להפעלת מצבי צורה.
היתרון העיקרי של הטכניקה המוצעת הוא הקמת משטר מצב יציב לתנודות צורה מבוקרות סימטריה. מכיוון שתנועת הממשק נמשכת זמן רב יחסית (משניות לדקות), לכידת זרימת הנוזל הנגרמת על ידי בועות אפשרית על ידי החלפת מערך הניסוי למעקב אחר ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים שנזרעו בתווך הנוזלי. ראוי לציין כי עד כה לא קיימים מחקרים ניסיוניים על מיקרו-סטרימינג המושרה על ידי בועה בנוזל אינסופי בספרות. כמו כן, גם כאשר מיקרו-סטרימינג קוויטציה נחקר עבור בועה המחוברת למצע, הניתוח מוגבל לתצפיות איכותניות מבלי לקחת בחשבון את הקשר לדינמיקה של הבועה16. מדידת תנועת החלקיקים מתבצעת ביריעת לייזר דקה המסופקת על ידי לייזר גל רציף. מכיוון שיש צורך לבצע מעין בו זמנית (i) את נוקלאציית הלייזר באמצעות פולס לייזר, (ii) את מעקב החלקיקים עם יריעת לייזר ו-(iii) את ההקלטה על ידי המצלמה המהירה, יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לחסימה הפוטנציאלית של חומרים המקיפים את מיכל המים. זה מוביל להתקנה קומפקטית עם הגבלות רבות על פריסת המכשירים, כפי שמוצג באיור 5. בעת לכידת תבנית מיקרו-סטרימינג המושרה על ידי בועה מתנודדת צורה, יש צורך לחילופין לעקוב אחר דינמיקת ממשק הבועות, כפי שהוזכר בשלב 4.2. ואכן, מעבר בין רצפים חלופיים של דינמיקת בועות והדמיית זרימת נוזלים מאפשרים לשייך בבטחה את תבנית המיקרו-זרימה לתנודת צורה נתונה. הליך חלופי זה הוא הכרחי מכיוון ש-(i) תנודות צורה עשויות להיכבות, (ii) יציבות הבועה עשויה לעלות בפתאומיות ולהוביל לחוסר יציבות המיקום של הבועה, (iii) בועה עשויה להתפרק כאשר מתרחשים עיוותים גדולים. גם אם אירועים אלה נדירים, חשוב לוודא שדינמיקת הבועות נשארת זהה על ידי הקלטתה לפני ואחרי צילום תבנית המיקרו-סטרימינג. (בדרך זו ניתן להיות בטוחים שתנועת הבועה והתבנית באמת מתואמים).
האם ניתן לראות כי בועה המתנדנדת בעיקר על מספר מצב נתון מובילה לתבנית מיקרו-סטרימינג מסוימת, כפי שניתן לראות באיור 12. התבנית ייחודית ותלויה בתוכן המודאלי של תנועת הממשק. כפי שמודגם באיור 13, אותו מספר מצב דומיננטי עשוי לגרום למערבולות של מרחקים גדולים או קטנים כתלות במספר, באמפליטודה ובפאזה של המצבים המשניים המעוררים.
לתצפיות אלה עשוי להיות שימוש מעשי ביישומים רפואיים כגון מתן תרופות בתיווך אולטרסאונד ממוקד ומקומי, למשל. בועות ידועות כפועלות כווקטורים לחדירת צמתים הדוקים בין תאים, ואפילו קרום התא עצמו, מה שמוביל לסונופורציה1. במקרה של מיקרו-בועות מתנדנדות יציבות, תופעה זו עשויה להיגרם על ידי לחץ גזירה או שיפועי לחץ גזירה35 המושרים על ידי תנודות בועות, באמצעות יצירת זרימות מיקרו-זרם. נזכיר כי מיקרו-סטרימינג הוא תופעה לא לינארית, מסדר שני. בתחילה, שינוי קנה המידה של דפוסי הזרימה הנצפים לזה המתקבל עבור מיקרו-בועות טיפוליות, מופגזות, עם גדלים קטנים יותר (~ רדיוס של 3 מיקרומטר) אינו פשוט. כבר ראינו בהקדמה כיצד ניתן לשנות את קנה המידה של דינמיקה לא-כדורית של בועות חופשיות או מצופות בסדר גודל אחד: התדירות העצמית ω n של מצב נתון n קשורה לגודל הבועה כ-25. ב-Dollet et al.27, מצבי צורה מסדר 4 נלכדו עבור בועות מיקרומטריות מצופות המעוררות במהירות של 1.7 מגה-הרץ, בדומה למספר מצב הצורה שנצפה בניסוי שלנו. כמו כן, הלחץ המופעל שונה מאוד, כמו לחץ עד 200kPa נדרשים כדי להפעיל מצבי צורה על סוכן ניגוד אולטרסאונד microbubbles27. במערך המוצע, הלחץ המרבי המופעל אינו עולה על 25 kPa. ההבדל החזק בלחץ המופעל נובע מהפעלת אי יציבות פני השטח, כאשר מצבי צורה מופיעים מעל סף לחץ מסוים. עבור תנאי הניסוי ב 1.7 MHz שניתנו ב Dollet et al. 27, הוכח כי סף הלחץ המוביל לחוסר יציבות צורה הוא סביב 150 kPa עבור מצב 436. עבור תדר נסיעה של 30 קילוהרץ, נדרשת רק משרעת שדה נהיגה של 10 kPa כדי להפעיל חוסר יציבות צורה בבועה ~ 50 מיקרומטר. לאחר הפעלתה, חוסר יציבות הצורה מתפתח לאחר מספר מחזורים אקוסטיים, ומדגים רוויה מישורית של משרעת המצב. רוויית משרעת נצפתה הן עבור בועות חופשיות 24,29 והן עבור בועות מצופות27. הוא מציין את האפשרות להגיע לתנודות צורה במצב יציב עבור בועות חופשיות או מצופות, עם תנודות צורה גדולות כמו 25 עד 50% ממשרעת המצב הרדיאלי27,37. באמצעות הגישה הניסויית שלנו, אנו מגיעים לעיוותים קיצוניים של צורה בתצורה
(כאשר n הוא משרעת מצב הצורה), כפי שמודגם באיור 13.
לסיכום, מערך הניסוי המוצע מאפשר קנה מידה של התכונות העיקריות של תנודות לא כדוריות של מיקרו-בועות, אפילו עבור גדלים המשתנים כמעט בסדר גודל אחד. בנוגע לזרימת המיקרו-זרם, קנה המידה של מהירות הזרימה עשוי לחקור בועות המציגות תנודות רוחביות ורדיאליות7, או מצב לא כדורי המציג אינטראקציה עצמית32. בשני המקרים סולם מהירויות הזרימה הוא v ~ ωR0 a i a j, כאשר i, j מציין את אמפליטודות המצב הנחשבות המנורמלות על ידי רדיוס הבועה. עבור ערכים דומים של פרמטר ההתפשטות הלא כדורית ai, מהירויות זרימה זהות מתקבלות כאשר ωR0 ~ קבוע. בהשוואה בין תנאי הניסוי שלנו לזה המשמש למיקרו-בועות פגזיות טיפוליות27, תחזיות תיאורטיות של מהירויות זרימה שונות רק מפקטור 2.5. מדידות של מהירויות זרימה על ידי מהירות מעקב אחר חלקיקים הובילו להערכות של גודל המהירות של 1 מ"מ לשנייה במערך המוצג כאן. ערך זה דומה לזה המתקבל בעת חקירת מיקרו-סטרימינג המושרה על ידי חומרי ניגוד אולטרסאונד19. לגבי הארגון המרחבי של תבנית הזרימה, ההתפלגות הזוויתית של מערבולות הזרימה סביב ממשק הבועות אינה תלויה ברדיוס הבועה31. רק ההתפשטות הרדיאלית של שדה ההזרמה מושפעת משינוי גודל הבועה. התפשטות רדיאלית זו משתנה כ
- , כאשר הוא מקדם המקושר למספר המצב הנחקר. ברור שהצורה הכוללת של תבנית הזרימה נשמרת, שכן ההתפשטות הרדיאלית נשלטת על ידי רדיוס הבועה R0. עם זאת, כפי שמודגם באיור 13, דפוס הזרימה יכול להיות שונה באופן משמעותי גם כאשר לוקחים בחשבון את אותו מספר מצב צורה. איור 13 מדגיש את ההשפעה העצומה של דינמיקת ממשק הבועות על תבנית הזרימה, ובמיוחד על קצב השינוי המרחבי בשדה המהירות. ההתפלגות המרחבית של מתח גזירה, או שיפוע מתח גזירה, צוינה כאינדיקטור מתאים ליעילות סונופורציה35. במערך הניסוי המוצע שלנו, ניתן להעריך בשלב זה רק את לחץ הגזירה בנוזל בתפזורת. הרחבה נוספת של לחץ הגזירה בקיר תדרוש תוספת של משטח סמוך קרוב לבועה. ניתן לצפות כי משטח בסביבת הבועה יפריע ליציבות מיקום הבועה על ידי שינוי מקומי של שדה הגל העומד. הבטחת יציבות הבועה במרחק קרוב מהקיר היא עדיין אתגר שניתן לפתור חלקית על ידי הוספת שדה אולטרסאונד משני המוקדש ללכידת בועות באורך גל זהה למרחק קיר הבועה. תא ריחוף אקוסטי כזה בתדר כפול כבר תוכנן לחקר דינמיקה של זוג בועות וכוחות אינטראקציה38. לרוע המזל, הפרש הגודל הגדול בין הבועות שנחקרו כאן לבין תאים ביולוגיים (רדיוס טיפוסי ~10μm) הופך את השימוש הישיר במערך ניסויי זה לבלתי אפשרי לחקירות ביולוגיות. עם זאת, אנו מצפים שתוצאות הניסוי שלנו בשילוב עם ההתפתחויות התיאורטיות האחרונות על מיקרו-סטרימינג המושרה על ידי בועות יסייעו לשפר מודלים כאלה, כמו גם לספק ביטחון בחיזוי התיאורטי של עקת גזירה הנגרמת על ידי בועה או שיפועי לחץ גזירה בקרבת קרום התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי LabEx CeLyA של אוניברסיטת ליון (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspherical lens | Thorlabs | AL4050 | Lens of focus 40 mm |
| Continuous wave laser source | CNI | MLL6FN | DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW |
| Cylindrical plano-concave lens | Thorlabs | LJ1277L1-A | lens of focus -25?4mm |
| Cylindrical plano-concave lens | Thorlabs | LK1900L1 | lens of focus 250 mm |
| Fluorescent particles | Duke Scientific | R700 | Red polymer fluorescent microspheres |
| Function generator | Agilent | HP33120 | Generator of function feeding the ultrasound transducer |
| High-speed camera | Vision Research | Phantom v12.0 | High-speed recording up to 1 Mfps |
| Liquid medium | Carlo Erba | Water for analysis | Demineralized, undegassed water |
| Multiphysics software | Comsol | None | Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber |
| Nd:Yag pulsed laser | New Wave Research | Solo III-15 | 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ |
| Plano-concave lens | Thorlabs | N-BK7 | lens of focus 125 mm |
| Spherical concave lens | Thorlabs | N-SF11 | Bi-concave lens of focus -25mm |
| Ultrasound transducer | SinapTec | Custom-made | Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter |
| Visualization software | NIH | ImageJ | Software for image processing and analysis in Java |
| XY Linear stage | Newport | M-406 | Displacement stage with micrometric screw |
| Z-axis linear stage | Edmund Optics | 62-299 | Vertical displacement stage with micrometric screw |
References
- Roovers, S., et al. The role of ultrasound-driven microbubble dynamics in drug delivery: from microbubble fundamentals to clinical translation. Langmuir. 35 (31), 10173-10191 (2019).
- Liu, H. L., Fan, C. H., Ting, C. Y., Yeh, C. K. Combining microbubbles and ultrasound for drug delivery to brain tumors: current progress and overview. Theranostics. 4 (4), 432-444 (2014).
- Lammertink, B. H. A., et al. Sonochemotherapy: from bench to bedside. Frontiers in Pharmacology. 6, 138 (2015).
- Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10, 011501 (2016).
- Van Wamel, A., Bouakaz, A., Versluis, M., de Jong, N. Micromanipulation of endothelial cells: ultrasound-microbubble-cell interaction. Ultrasound in Medicine and Biology. 30, 1255-1258 (2004).
- Tran, T. A., Roger, S., Le Guennec, J. Y., Tranquart, F., Bouakaz, A. Effect of ultrasound-activated microbubbles on the cell electrophysiological properties. Ultrasound in Medicine and Biology. 33, 158-163 (2007).
- Marmottant, P., Hilgenfeldt, S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature. 423 (6936), 153-156 (2003).
- Prentice, P. A., Cuschieri, K., Dholakia, K., Prausnitz, M., Campbell, P. Membrane disruption by optically controlled microbubble cavitation. Nature Physics. 1, 107-110 (2005).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophysical Journal. 96, 4866-4876 (2009).
- Novell, A., et al. A new safety index based on intrapulse monitoring of ultra-harmonic cavitation during ultrasound-induced blood-brain barrier opening procedures. Scientific Reports. 10, 10088 (2020).
- Cornu, C., et al. Ultrafast monitoring and control of subharmonic emissions of an unseeded bubble cloud during pulsed sonication. Ultrasonics Sonochemistry. 42, 697-703 (2018).
- Reslan, L., Mestas, J. L., Herveau, S., Béra, J. C., Dumontet, C. Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation. Journal of Controlled Release. 142 (2), 251-258 (2010).
- Reuter, F., Gonzalez-Avila, S. R., Mettin, R., Ohl, C. D. Flow fields and vortex dynamics of bubbles collapsing near a solid boundary. Physical Review Fluids. 2, 064202 (2017).
- Chew, L. W., Klaseboer, E., Ohl, S. W., Khoo, B. C. Interaction of two differently sized oscillating bubbles in a free field. Physical Review E. 84, 066307 (2011).
- Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
- Tho, P., Manasseh, R., Ooi, A. Cavitation microstreaming patterns in single and multiple bubble systems. Journal of Fluid Mechanics. 576, 191-233 (2007).
- Van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. Journal of Controlled Release. 112, 149-155 (2006).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. PNAS. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterization of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12, 034109 (2018).
- Shklyaev, S., Straube, A. V. Linear oscillations of a compressible hemispherical bubble on a solid substrate. Physics of Fluids. 20, 052102 (2008).
- Fauconnier, M., Bera, J. C., Inserra, C. Nonspherical modes non-degeneracy of a tethered bubble. Physical Review E. 102, 033108 (2020).
- Xi, X., Cegla, F., Mettin, R., Holsteyns, F., Lippert, A. Study of non-spherical bubble oscillations near a surface in a weak acoustic standing wave field. The Journal of the Acoustical Society of America. 135, 1731 (2014).
- Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Effect of a distant rigid wall on microstreaming generated by an acoustically driven gas bubble. Journal of Fluid Mechanics. 742, 425-445 (2014).
- Cleve, S., Guédra, M., Inserra, C., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Surface modes with controlled axisymmetry triggered by bubble coalescence in a high-amplitude acoustic field. Physical Review E. 98, 033115 (2018).
- Lamb, H. Hydrodynamics. 6th ed. , University Press. Cambridge. (1932).
- Liu, Y., Wang, Q. Stability and natural frequency of nonspherical mode of an encapsulated microbubble in a viscous liquid. Physics of Fluids. 28, 062102 (2016).
- Dollet, B., et al. Nonspherical oscillations of ultrasound contrast agent microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (9), 1465-1473 (2008).
- Versluis, M., et al. Microbubble shape oscillations excited through ultrasonic parametric driving. Physical Review E. 82, 026321 (2010).
- Guédra, M., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Dynamics of nonspherical microbubble oscillations above instability threshold. Physical Review E. 96, 063104 (2017).
- Cleve, S., Guédra, M., Mauger, C., Inserra, C., Blanc-Benon, P. Microstreaming induced by acoustically trapped, non-spherically oscillating microbubbles. Journal of Fluid Mechanics. 875, 597-621 (2019).
- Doinikov, A. A., Cleve, S., Regnault, G., Mauger, C., Inserra, C. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. I. Case of modes 0 and m. Physical Review E. 100, 033104 (2019).
- Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Doinikov, A. A. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. III. Case of self-interacting modes n-n. Physical Review E. 101, 013111 (2020).
- Prabowo, F., Ohl, C. D. Surface oscillations and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrasonics Sonochemistry. 18 (1), 431-435 (2011).
- Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined; optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90, 114103 (2007).
- Collis, J., et al. Cavitation microstreaming and stress fields created by microbubbles. Ultrasonics. 50, 273-279 (2010).
- Loughran, J., Eckersley, R. J., Tang, M. X. Modeling non-spherical oscillations and stability of acoustically driven shelled microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4349-4357 (2012).
- Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall - a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
- Regnault, G., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Secondary radiation force between two closely spaced acoustic bubbles. Physical Review E. 102, 031101 (2020).
