Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Индукция микропотоков несферическими пузырьковыми колебаниями в системе акустической левитации

Published: May 9, 2021 doi: 10.3791/62044
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Centre Léon Bérard, INSERM, UMR 1032, LabTAU, France, 2Univ Lyon, Ecole Centrale de Lyon, INSA de Lyon, CNRS, LMFA UMR 5509, France

Summary

Предложена быстрая и надежная методика управления колебаниями формы одного захваченного акустического пузыря, основанная на технике коалесценции между двумя пузырьками. Стационарные, контролируемые симметрией колебания формы пузырьков позволяют анализировать поток жидкости, генерируемый в непосредственной близости от границы раздела пузырьков.

Abstract

При расположении вблизи биологических барьеров колеблющиеся микропузырьки могут увеличивать проницаемость клеточной мембраны, обеспечивая интернализацию лекарств и генов. Экспериментальные наблюдения показывают, что временная пермеабилизация этих барьеров может быть связана с напряжением сдвига, которое оказывается на клеточные ткани при кавитационном микропотоке. Кавитационный микропоток - это генерация вихревых потоков, которые возникают вокруг колеблющихся ультразвуковых микропузырьков. Чтобы создать такие потоки жидкости, колебания пузырьков должны отклоняться от чисто сферических колебаний и включать либо поступательную неустойчивость, либо моды формы. Экспериментальные исследования пузырьковых течений и напряжений сдвига на близлежащих поверхностях часто ограничены по своему объему из-за трудности улавливания деформаций формы микропузырьков стабильным и контролируемым образом. Описана конструкция камеры акустической левитации для исследования управляемых симметрией несферических колебаний. Такой контроль осуществляется с помощью метода коалесценции между двумя приближающимися пузырьками в достаточно интенсивном ультразвуковом поле. Управление несферическими колебаниями открывает путь к управляемому кавитационному микропотоку свободного поверхностно-колеблющегося микропузырька. Камеры с высокой частотой кадров позволяют квазиодновременно исследовать динамику несферических пузырьков на акустическом временном масштабе и поток жидкости на более низком временном масштабе. Показано, что может быть получено большое разнообразие паттернов жидкости и что они коррелируют с модальным содержимым границы раздела пузырьков. Мы демонстрируем, что даже моды формы высокого порядка могут создавать жидкие паттерны на больших расстояниях, если динамика интерфейса содержит несколько мод, подчеркивая потенциал несферических колебаний для адресной и локализованной доставки лекарств.

Introduction

В медицине вводимое лекарство должно преодолеть множество препятствий в живой системе, прежде чем достичь желаемых целей. Тем не менее, большинство лекарств быстро выводятся из кровотока. Эффективность таргетирования низкая, и они не могут легко пересекать клеточные мембраны, что приводит к неэффективной доставке лекарств. В настоящее время использование микропузырьков в сочетании с ультразвуком предложено в качестве инновационного метода неинвазивной, точной и целенаправленной доставки лекарственных препаратов и генов к патологическим тканям и клеткам1. В этом подходе микропузырьки могут играть роль носителей, когда свободные лекарства либо вводятся вместе с суспензией газовых пузырьков, либо загружаются на ее поверхность. Микропузырьки также могут выступать в качестве локального вектора для перефокусировки ультразвуковой энергии для взаимодействия с клетками. По сути, под ультразвуковым воздействием пузырьки стабильно сжимаются и расширяются, режим, называемый стабильной кавитацией, который генерирует потоки жидкости и, следовательно, напряжение сдвига на близлежащих объектах. Микропузырьки также могут колебаться нелинейно и расширяться до коллапса в режиме инерционной кавитации, создавая ударные волны, которые распространяются радиально от места коллапса2. Было показано, что кавитация, стабильная или инерционная, усиливает проникновение клеточных мембран и, таким образом, усиливает интернализацию лекарств в клетку3.

В терапевтических приложениях понимание механизма взаимодействия пузырьковых клеток очень важно, но есть несколько барьеров, как с научной, так и с технической стороны, которые мешают нашим знаниям продвигаться вперед. Во-первых, уловить динамику клеток в ответ на механические стимулы, вызванные пузырьками, очень сложно4. В акустическом масштабе времени колебания микропузырьков первого порядка могут приводить к активации мембранных каналов, облегчая молекулярное прохождение через биологические интерфейсы. Это происходит за счет прямого колебания клеточной мембраны, также называемого «клеточным массажем»5. Активация канала после прямого механического воздействия была подтверждена с использованием методов патч-зажима, которые измеряли электрофизиологические свойства клеточных мембран во время и после ультразвукового воздействия6. Измерение индуцированной пузырьками клеточной динамики (то есть полного поля деформации клеточной мембраны) в акустической шкале времени также даст представление о пороге расширения площади мембраны Δ A/A, необходимого для индуцирования пор в клеточной мембране7. Вторым барьером является контроль режима коллапса пузырьков, чтобы избежать лизиса клеток, вызванного микропузырьками. Схлопывание пузырьков и индуцированные микроструи были идентифицированы как механизм, посредством которого происходит перфорация мембраны 8,9. После проникновения клеточная мембрана восстанавливается за счет самогерметизации липидных бислоев кальция и слияния внутриклеточных везикул9. Возникновение схлопывания пузырьков также может привести к летальному повреждению клетки и вызвать ненужные побочные эффекты в окружающих. В чувствительных приложениях, таких как ультразвуковое опосредованное открытие гематоэнцефалического барьера, общепризнано, что следует избегать схлопывания инерционных пузырьков10.

Поэтому в настоящее время огромные усилия направлены на проектирование последовательностей ультразвукового излучения в сочетании с пассивным кавитационным мониторингом и контролем, чтобы обеспечить стабильные колебания микропузырьков11. В этом стабильном режиме была выдвинута гипотеза о том, что стабильно колеблющиеся пузырьки играют сильную роль в запуске пермеабилизации мембраны, способствуя пространственно-направленному напряжению сдвига на клеточной мембране7. Напряжение сдвига возникает из-за потоков жидкости, создаваемых в непосредственной близости от колеблющихся пузырьков. Эти потоки жидкости называются кавитационным микропотоком, и, как упоминалось выше, они являются одним из нескольких возможных механизмов, ответственных за усиленное поглощение внеклеточных молекул. При работе с суспензией пузырьков или клеток, таких как биологические трансфекции in vitroанализы 12, пермеабилизация путем микростриминга может быть гораздо более эффективной, чем пермеабилизация путем коллапса пузырьков. Это можно показать простым геометрическим соображением. В клеточных суспензиях сонопорация будет эффективной, если большинство взвешенных клеток подвергается достаточно большим механическим воздействиям (что приводит к пермеабилизации мембраны). Известно, что схлопывания пузырьков направлены вдоль направления нарушения изотропной симметрии, такой как ось13 пузырь-стенка или линия пузырь-пузырь и пузырьковая ячейка, соединяющая их центрмасс 14. Таким образом, полученная микроструя представляет собой пространственно-локализованное явление вдоль конечного числа линий, соединяющих клеточный и пузырьковый центры. В зависимости от концентрации клеток и пузырьков, а также расстояния между пузырьковыми клетками этот эффект может быть не самым эффективным для проникновения всего числа взвешенных клеток. Напротив, кавитационный микропоток — это явление, происходящее в медленном временном масштабе, с большим пространственным расширением по сравнению с радиусом пузырька. Кроме того, поток жидкости распределяется по всему пузырьку и, следовательно, может воздействовать на большее количество клеток на очень большом расстоянии. Таким образом, понимание генерируемого кавитационного микропотока вокруг колеблющегося пузырька является необходимым условием для контроля и количественной оценки напряжения сдвига, вызванного пузырьком, которое прикладывается к клеткам.

Для этого предварительный этап состоит в управлении сферическими и несферическими колебаниями пузырька, управляемого ультразвуком, поскольку генерируемые потоки жидкости индуцируются движением границы раздела15,16 пузырьков. В частности, колебания формы микропузырьков должны запускаться и поддерживаться стабильными. Кроме того, необходимо контролировать ориентацию колебаний формы пузырька, чтобы правильно проанализировать корреляцию между динамикой границы раздела пузырьков и индуцированным микропотоковым паттерном. При обобщении существующей литературы очевидно, что подробные экспериментальные результаты кавитационно-индуцированного микропотока доступны только для пузырьков, прикрепленных к поверхности. Микропузырьки, прикрепленные к стене, обычно используются для оценки точной динамики интерфейса и взаимодействия клеток в микрометровом масштабе в системе сверхбыстрой микроскопии. Эта конфигурация терапевтически актуальна при рассмотрении вибрирующих микропузырьков, расположенных на клеточной мембране17,18,19. Однако изучение пузырьков, прикрепленных к подложке, может усложнить анализ динамики пузырьков, отчасти из-за сложного характера динамики20 контактной линии и срабатывания мод21 асимметричной формы. В медицинских и биологических приложениях пузырьки, которые не прикреплены к стене, обычно встречаются в ограниченных геометрических формах, таких как небольшие сосуды. Это существенно влияет на динамику пузыря и нестабильность формы. В частности, наличие ближайшей стенки смещает порог давления для срабатывания режима формы на более низкие значения давления в зависимости от номера режима формы и размера пузырька22. Стенка также влияет на микропоток, индуцированный пузырьками, с возможно более высокой интенсивностью для создаваемого потока23.

Среди всех возможных сценариев, с которыми могут столкнуться микропузырьки (свободные или прикрепленные, близко к стене, коллапсирующие или стабильно колеблющиеся), мы предлагаем исследовать несферическую динамику одного пузыря вдали от любой границы. Экспериментальная установка основана на системе24 акустической левитации, в которой стоячая ультразвуковая волна используется для улавливания пузыря. Этот сценарий согласуется с медицинскими приложениями, в которых набор взвешенных пузырьков и клеток сосуществует, например, в камере сонотрансфекции. Поскольку пузырьки и ячейки расположены не слишком близко, предполагается, что наличие ячейки не влияет на динамику границы раздела пузырьков. Когда клетки следуют петлевым траекториям кавитационно-индуцированного микропотока, они циклически приближаются и отталкиваются от местоположения пузырька, и мы можем предположить, что присутствие клетки не влияет ни на картину потока, ни на его среднюю скорость. Кроме того, с теоретической точки зрения хорошо известны несферическая динамика и индуцированные микропотоки от одиночных пузырьков, удаленных от границы. Чтобы связать индуцированный пузырьками поток жидкости с динамикой контура пузырька, необходимо точно охарактеризовать динамику границы раздела пузырьков. Для этого предпочтительно адаптировать пространственно-временной масштаб в экспериментальных исследованиях по отношению к тем, которые используются в терапии, таким образом, чтобы сбор данных с помощью обычных высокоскоростных камер (менее 1 миллиона кадров в секунду) был возможен с использованием больших пузырьков, возбужденных на более низких частотах. При рассмотрении пузырьков без покрытия собственная частота ω n данной моды n связана с размером пузырька как Equation 125. Это соотношение радиус-собственная частота несколько изменяется при рассмотрении оболочечных пузырьков26, но порядок величины собственной частоты ωn остается прежним. Таким образом, исследование пузырьков с равновесными радиусами ~ 50 мкм в ультразвуковом поле 30 кГц аналогично изучению покрытых пузырьков радиусом ~ 3 мкм в поле 1,7 МГц, как предложено Dollet et al.27. Таким образом, ожидаются аналогичные номера режимов формы и, следовательно, микропотоковые шаблоны.

Для того, чтобы вызвать несферические колебания границы раздела пузырьков, необходимо превысить определенный порог давления, зависящий от радиуса, как показано на рисунке 1. Существующие экспериментальные методы основаны на увеличении акустического давления для запуска поверхностных мод (проиллюстрированных траекторией (1) на рисунке 1) либо путем ступенчатого повышениядавления 28 , либо путем возбуждения с модулированной амплитудой, ответственного за периодическое возникновение и исчезновение поверхностных мод29. Основными недостатками этих методов являются: (i) случайная ориентация оси симметрии поверхностных колебаний, которые не могут контролироваться в плоскости изображения, (ii) короткое время жизни колебаний в форме пузырьков, что затрудняет анализ индуцированных потоков жидкости в больших временных масштабах, и (iii) частое срабатывание неустойчивых мод формы. Мы предлагаем альтернативный метод пересечения порога давления при постоянном акустическом давлении на карте радиус/давление, как показано на пути (2) на рисунке 1. Для этого необходимо увеличить размер пузырька так, чтобы он находился в зоне нестабильности. Такое увеличение выполняется методом пузырьковой коалесценции. Слияние двух, первоначально сферически колеблющихся, микропузырьков используется для создания одного деформированного пузыря. Если акустическое давление и размер пузырьков слипшегося пузырька находятся в зоне неустойчивости, срабатывают поверхностные моды. Мы также доказали, что метод коалесценции индуцирует колебания устойчивой формы в установившемся режиме, а также управляемую ось симметрии, определяемую прямолинейным движением двух приближающихся пузырьков. Поскольку колебания стабильной формы обеспечиваются в течение нескольких минут, анализ потока жидкости, вызванного пузырьками, возможен путем засева жидкой среды флуоресцентными микрочастицами, освещенными тонким лазерным листом. Регистрация движения твердых микрочастиц в непосредственной близости от границы раздела пузырьков позволяет идентифицировать закономерность индуцированного потокажидкости 30. Общий принцип срабатывания колебаний в форме пузырьков, приводящих к стабильному по времени течению жидкости, проиллюстрирован на рисунке 2.

В следующем протоколе мы описываем шаги, необходимые для создания стабильных колебаний в форме пузырьков с помощью метода коалесценции, и описываем измерения потока жидкости. Это включает в себя проектирование системы акустической левитации, акустическую калибровку, зарождение пузырьков и метод коалесценции, измерение динамики границы раздела пузырьков и окружающего потока жидкости, а также обработку изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Конструкция камеры акустической левитации

  1. Спроектируйте оптически прозрачный (похожий на ПММА) кубический резервуар (кромка 8 см и толщина 2,8 мм на грань) с модулем геометрии программного обеспечения для мультифизического моделирования (таблица материалов).
  2. Вставьте цилиндрическую поверхность (Ø = 35 мм) по центру в нижней части резервуара, чтобы смоделировать ультразвуковой преобразователь.
  3. Установите граничные условия равным нулевому давлению на каждую стенку с нормальным смещением амплитуды 1 мкм на поверхности преобразователя.
  4. Используя модуль частотной области, смоделируйте функцию частотной характеристики (FRF) резервуара в диапазоне частот [10 - 40] кГц в трех произвольных местах: loc1 = (0,01375, 0,01375, 0,04125), loc2 = (0, 0, 0,0088) и loc3 = (0,021725, 0,023375, 0,00935).
  5. Отрегулируйте размер бака таким образом, чтобы один из акустических режимов резонатора соответствовал номинальной частоте преобразователя (здесь 31,2 кГц). Таким образом, FRF содержит один резонансный пик, близкий к этой частоте, как показано на рисунке 3.
  6. Постройте поле давления внутри резервуара, как показано на рисунке 4. Выбранная резонансная мода должна содержать, по крайней мере, одну пучность давления во внутренней части контейнера, на которой будет захвачен акустический пузырь.
  7. При проектировании резервуара спроектируйте подвижную верхнюю поверхность с направляющей канавкой на каждом краю, чтобы плотно закрывать поверхности резервуара. Просверлите крошечное отверстие на верхней поверхности, чтобы заполнить резервуар жидкой средой.
  8. Поместите резервуар для воды на самодельную раму, содержащую ультразвуковой преобразователь (типа Ланжевена, номинальная частота 31,2 кГц). Используйте эхографический гель для соединения датчика с нижней стенкой резервуара.
  9. Поместите систему резервуара и рамы на стол смещения в трех направлениях с помощью микрометрических винтов.
  10. Наполните бак микрофильтрованной, деминерализованной и водой (не дегазированной, объемом ~ 500 мл, насыщение кислородом примерно 8 мг· Л-1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование недегазированной воды вместо дегазированной позволяет поддерживать стабильные пузырьки на протяжении всего эксперимента. Использование дегазированной воды ускорит сжатие пузырьков из-за диффузии газа, даже если оно немного уравновешено ректифицированной (опосредованной ультразвуком) диффузией.

2. Генерация пузырьков и акустическая калибровка

  1. Подготовьте экспериментальную установку, используемую для лазерно-индуцированного зарождения пузырьков, акустического возбуждения и высокоскоростной записи (рис. 5a, b, c). Экспериментальная установка состоит из (A) системы акустической левитации, (B) источника питания лазера и (C) лазерной головки, (D) одной сферической вогнутой линзы, (E) одной плосковогнутой линзы и одной асферической линзы, (F) высокоскоростной камеры, (G) непрерывного светодиода. Позже, для измерений потоков жидкости (рис. 5d) (H) будет добавлен один непрерывный лазерный источник, (I) цилиндрическая плосковогнутая линза, за которой следует цилиндрическая плосковогнутая линза, вставленная за первой линзой и ориентированная на ортогональную ось.
  2. Подключите ультразвуковой преобразователь к генератору функций. Установите сигнал возбуждения как: синусоидальная форма волны, непрерывная волна, частота 31,2 кГц. Амплитуда является единственным переменным параметром.
  3. Поместите линзу (D) на расстоянии примерно 6 см перед лазерной головкой (C).
  4. Установите объектив (E) на расстоянии примерно 12 см перед объективом (D).
  5. Поместите резервуар для воды (A) таким образом, чтобы точка фокусировки лазера располагалась внутри резервуара для воды, что приводит к генерации искры для каждого лазерного импульса (5-10 мДж). Лазерная искра должна располагаться примерно на 3 см ниже целевого пучности давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без ультразвука (УЗИ) пузырь с лазерным ядром поднимется на верхнюю поверхность из-за плавучести.
  6. Включите ультразвуковой преобразователь. Увеличивайте приложенное напряжение до тех пор, пока пузырь не перестанет подниматься вертикально, а будет отклоняться в сторону пучности давления и, при достаточно высоком давлении, задерживаться.
  7. Установите подсветку (непрерывный светодиод) и высокоскоростную камеру, чтобы наблюдать за захваченным пузырем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При зарождении нового пузырька лазерной искрой легко уловить траекторию пузырька, приближающегося к месту его захвата.
  8. Переместите местоположение лазерной искры в резервуар для воды так, чтобы траектория пузырька оставалась внутри фокальной плоскости камеры.
  9. Поймайте один пузырь и захватите его радиальные колебания со следующими параметрами: размер кадра 128 x 128 пикселей, частота захвата 180 кГц. Пример радиальных колебаний большой амплитуды в течение двух акустических периодов приведен на рисунке 6. Типичный размер пузырьков газа колеблется от 30 до 80 мкм.
  10. Запишите радиальные колебания пузырьков в течение 3-30 миллисекунд, чтобы запечатлеть от сотен до тысяч колебаний пузырьков. Повторите эту запись для увеличения приложенных напряжений преобразователя. Типичные приложенные напряжения находятся в диапазоне от 0 до 8 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При изменении приложенного напряжения положение равновесия захваченного пузырька немного перемещается по вертикали. Чтобы следить за колебаниями, не перемещая подсветку и камеру, поместите систему (датчик и резервуар для воды) на подвижный стол в трех направлениях с микрометрической точностью.
  11. Включите ультразвуковой датчик и сделайте одно изображение фона для последующего анализа.
  12. Обработайте серию видео, выполнив следующую процедуру:
    1. Запустите исполняемый файл VoltagePressure.exe. Интерфейс, показанный на рисунке 7 , должен открыться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сценарий доступен в качестве дополнительного документа.
    2. Укажите физические и экспериментальные параметры в левом столбце (рис. 7А).
    3. Укажите значения приложенного напряжения для серии записей в таблице справа внизу (рис. 7B).
    4. На панели анализа радиуса пузыря нажмите на Загрузить параметры (рисунок 7C) и выберите папку, содержащую все файлы вашего видеоряда, а затем фоновое изображение (обязательно).
    5. Выбор разрешен между анализом всех видео сразу, нажатием « Авто» или поочередным нажатием « Шаг за шагом».
    6. Для каждого видеофайла эволюция радиуса пузырька строится на графике за один акустический период, и накладывается числовое соответствие. Красная кривая соответствует линеаризованному моделированию Рэлея-Плессета. Отображается радиус равновесного пузырька (рис. 7D).
    7. Согласно числовой подгонке, приложенное давление для этого напряжения отображается на панели графика «Давление (напряжение)» (рис. 7E). Значение приложенного давления также отображается в таблице в правом нижнем углу (рис. 7B). Типичные приложенные давления, соответствующие динамике напряжения 0 - 8 В, составляют 0 - 25 кПа.
    8. После того, как все видео будут обработаны, нажмите кнопку «Линейная регрессия», чтобы выполнить линейную подгонку кривой давления/напряжения. Данные (значения напряжения и давления) сохраняются в .txt файле, расположенном в текущем каталоге. Наклон подгонки предусмотрен.

3. Техника коалесценции

  1. Включите ультразвуковой преобразователь. Установите приложенное напряжение достаточно высоким, чтобы соответствующее акустическое давление могло привести к возникновению поверхностной неустойчивости, в соответствии с числовой диаграммой давления/радиуса зон нестабильности, как показано на рисунке 8.
  2. Зародите пузырь, который затем мигрирует в место захвата. Если захваченный пузырь проявляет только сферические колебания, переходите к следующему шагу. При появлении несферических колебаний:
    1. Выключите питание ультразвука, чтобы пузырь поднялся на верхнюю поверхность.
    2. Измените энергию лазера (путем точной настройки на несколько мДж) или уменьшите напряжение преобразователя.
    3. Включите питание ультразвука.
    4. Зародышеобразно образуется новый пузырь.
    5. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока размер пузырьков не приведет к чисто сферическим колебаниям.
  3. Когда захваченный пузырь проявляет только сферические колебания, генерирует новую лазерную искру. Когда новый пузырь достигает места захвата, происходит слияние.
  4. Если слившийся пузырь проявляет только сферические колебания, создайте новый пузырь. Для достижения радиуса пузырька, при котором происходят несферические деформации, может потребоваться многократное слияние. Пример слияния пузырьков, приводящего к несферическим колебаниям, показан на рисунке 9.
  5. Как только слившийся пузырь проявляет несферические колебания, запишите колебания пузырька в течение примерно от 3 до 30 миллисекунд.
  6. Определите количество мод колебаний формы, см. рисунок 10.

4. Измерение расхода жидкости

  1. В случае кавитационных измерений микропотока частицы флуоресцентного индикатора должны быть добавлены в воду до зарождения пузырьков. В этом исследовании используются частицы размером 0,71 мкм (Таблица материалов). Они достаточно малы, чтобы быть акустически прозрачными (не подверженными влиянию силы акустического излучения) и точно следовать за потоком, а также достаточно большими, чтобы рассеивать лазерный свет. Используйте три капли для объема резервуара для воды, что примерно соответствует 2,104 частицы / мм3.
  2. Перед проведением измерений задайте следующие параметры для фиксации динамики пузырьков (с высокой временной шкалой) и (с низкой временной шкалой) потока жидкости:
    1. Создайте разбиение диска записи камеры на разделы.
    2. В качестве альтернативы определите параметры записи следующим образом:
      1. Частота кадров 180 кГц, размер кадра 128 x 128 пикселей и время экспозиции 1 мкс за одну запись динамики пузырькового интерфейса
      2. Частота кадров 600 Гц, размер кадра 1024 x 768 пикселей и время экспозиции 1 мс за одну запись движения индикаторов красителей.
  3. Используйте лазер непрерывного действия.
  4. Создайте тонкий лазерный лист, последовательно пропуская лазерный луч через цилиндрическую плосковогнутую линзу и цилиндрическую плоско-выпуклую линзу, ориентированную по ортогональной оси. Можно получить ширину луча около 160 мкм.
  5. Настройте лазерный лист так, чтобы он соответствовал плоскости изображения:
    1. Установите лазер на подвижное устройство так, чтобы лазерный лист можно было перемещать параллельно плоскости изображения.
    2. Отрегулируйте положение так, чтобы освещенные частицы были видны камере.
    3. Зародыше и ловушка пузыря.
    4. Отрегулируйте положение лазерного листа дальше, чтобы за пузырем стала видна тень. Пузырь теперь находится внутри лазерного листа, как показано на рисунке 11.
  6. Индуцируйте слияние пузырьков до тех пор, пока не станет очевиден стабильно колеблющийся режим формы.
  7. Сделайте несколько записей, переключаясь между динамикой пузырьков и микростримингом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выключайте лазер непрерывного действия, когда он не нужен. Нагрев может создавать нежелательные конвективные потоки. Кроме того, выключайте светодиод при выполнении измерений потокового потока.

5. Обработка изображений для визуализации кавитационных микропотоковых паттернов

  1. Установите программное обеспечение для визуализации ImageJ для обработки и анализа изображений на Java. Также установите плагин CINE File Reader для того, чтобы открывать файлы высокоскоростной камеры.
  2. Нажмите « Файл» | Импорт | CineFile и выберите видео *.cine, содержащее захват движения частицы.
  3. Выберите «Использовать виртуальный стек» в новом окне, теперь видео загружено.
  4. Для того, чтобы наблюдать за движением частиц без отображения картины потока, нажмите на Изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность | Авто. Темный фон теперь заменяется автоматически оптимизированным изображением.
  5. Для того, чтобы отобразить полученный узор, нажмите на Изображение | Стеки | Z Project и выберите параметр «Максимальная интенсивность» для проекции изображения. Отображается выходное изображение с пикселями, содержащими максимальное значение по всем изображениям в стеке. При необходимости отрегулируйте контрастность изображения, как описано на шаге 5.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Получается потоковая картина, подобная показанной на рисунках 12b и 12d .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Полная последовательность слияния пузырьков, приводящих к стабильным во времени, контролируемым симметрией несферическим колебаниям, представлена на рисунке 9. Приближающаяся фаза двух сферически колеблющихся пузырьков заканчивается, когда тонкая жидкая пленка между двумя пузырьками разрывается. Стоит отметить, что на последней стадии перед слиянием границы раздела пузырьков отклоняются от сферичности. Оба пузырька удлиняются по эллипсоидальной форме по пути прямолинейного движения сближения. После момента слияния остается один пузырь, который проявляет несферические колебания сложной формы в течение нескольких акустических периодов. Это соответствует переходному режиму колебаний, следующему за возбуждением любой динамической системы. Через десяток-сотню акустических периодов колебания формы стабилизируются на установившемся колебании, показанном здесь для моды 4, как можно вывести из интерпретации рисунка 10. Этот режим может сохраняться в течение тысяч акустических периодов, от нескольких миллисекунд до нескольких минут. Это позволяет проводить квазиодновременные измерения пузырьковых потоков жидкости.

Как только пузырь захвачен и демонстрирует колебания устойчивой формы, фиксируется движение флуоресцентных индикаторов в окрестностях пузырька, как показано на рисунке 11. Прежде всего, отсутствие движения частиц для пузырька, демонстрирующего чисто сферические колебания, согласуется с несколькими кавитационными микропотоковыми моделями31, которые свидетельствуют о том, что завихренность не индуцируется чистыми радиальными колебаниями. Когда происходят колебания формы, движение жидкости создается в непосредственной близости от границы раздела пузырьков, как показано на рисунке 12. Альтернативная регистрация динамики границы раздела пузырьков на акустическом временном масштабе (рис. 12a, c) и движения частиц на более низком временном масштабе (рис. 12b, d) позволяет соотнести картину микропотока с заданным номером моды формы. На рисунке 12а представлена серия снимков динамики пузырьков для пузырька со средним радиусом R0 = 70,5 мкм, приводимого в движение при акустическом давлении Pa = 12,8 кПа, который колеблется преимущественно в моде 3. Связанный с ним микропотоковый паттерн, показанный на рисунке 12b, состоит из шести лепестков. Хорошо видно сохранение оси симметрии между колебаниями моды формы и рисунком микропотока. На рисунке 12c представлена серия снимков динамики пузырьков для пузырька со средним радиусом R0 = 55,7 мкм, приводимого в движение при акустическом давлении Pa = 23,6 кПа, который колеблется преимущественно в моде 4. Связанный с ним микропотоковый паттерн на рисунке 12d состоит из восьми маленьких лепестков размером с диаметр пузырька. Еще раз отчетливо видно сохранение оси симметрии между колебаниями моды формы и паттерном микропотока. Эти результаты, по-видимому, подтверждают, что чем выше моды формы, тем меньше микропотоковый узор и тем более ограничены они в непосредственной близости от пузырька.

Это предположение о более узком шаблоне потоковой передачи для режимов более высокого порядка не так очевидно и зависит от модального содержания динамики пузырькового интерфейса. Действительно, мы должны вспомнить, что индуцированный пузырьками поток жидкости является результатом взаимодействия между двумя модами формы, колеблющимися с одной и той же частотой, или самовзаимодействия моды с самой собой31. Пузырь, колеблющийся преимущественно в заданной моде формы, например, рассмотрим моду 3, может также возбуждать другие несферические колебания посредством нелинейной связи между модами29. Если динамика пузырькового интерфейса содержит дополнительные моды, такие как вторая и четвертая (например), то поток микропотока может быть значительно изменен из-за множественных взаимодействий между модами, которые будут генерировать определенные паттерны. Это проиллюстрировано на рисунке 13 для двух пузырьков, колеблющихся преимущественно в моде 3, которые индуцируют два разных паттерна микропотока. На рисунке 13a,b,c пузырь равновесного радиуса R0 = 70,1 мкм, движимый при акустическом давлении Pa=12,4 кПа, колеблющийся в моде 3, представляет собой лепестковую картину. Анализ динамики границы раздела (рис. 13b) показывает, что преобладающими модами являются радиальная (колеблющаяся на частоте возбуждения f 0), поступательная (мода с номером 1, колеблющаяся на половине частоты управления f 0), третья (колеблющаяся при f 0/2) и относительно небольшая четвертая и шестая моды (обе колеблются при f 0). Можно предположить, что основным вкладом в поток микропотока является взаимодействие между радиальной модой и модами 4 и 6, что приводит к лепестковому рисунку31. На рисунке 13d,e,f пузырь равновесного радиуса R0 = 68,6 мкм, приводимый в движение при акустическом давлении Pa = 13,3 кПа, колеблющийся в моде 3, представляет собой картину крестового типа с удлинением потока на большие расстояния. Анализ динамики раздела (рис. 13d) показывает, что преобладающими модами являются радиальная, поступательная (мода с номером 1), третья и шестая. В соответствии с высокой амплитудой моды 3 можно предположить, что основным вкладом в поток микропотока является самовзаимодействие моды 3, приводящее к паттерну32 крестового типа.

Figure 1
Рисунок 1. Иллюстрация метода запуска колебаний формы. Карта давления/радиуса содержит одну зону нестабильности для каждой моды данного градуса. Порог давления для достижения этой зоны может быть преодолен путем (1) увеличения приложенного акустического давления, которое приводит в движение газовый пузырь фиксированного радиуса, до тех пор, пока не появятся режимы формы, или (2) увеличения размера пузырька при постоянном приложенном акустическом давлении. Такое увеличение объема пузырька происходит медленно, когда происходит ректифицированная диффузия, в то время как слияние пузырьков значительно ускоряет процесс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Иллюстрация метода пузырьковой коалесценции. Приближающаяся фаза (А) состоит из лазерного зарождения двух пузырьков, которые сталкиваются друг с другом в одном и том же месте захвата внутри контейнера. При их встрече происходит слияние: разрыв тонкой пленки жидкости между пузырьками (В) приводит к образованию одного, изначально деформированного, пузырька. Этот деформированный пузырь приводится в движение монохроматическим ультразвуковым полем и проявляет сначала переходные колебания (C), прежде чем войти в стационарный режим. В стационарном режиме (D) слившийся пузырь проявляет стабильные во времени, контролируемые симметрией колебания формы. При засеивании среды флуоресцентными наночастицами улавливается индуцированный пузырьками поток жидкости (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Частотная характеристика Функция поля давления в системе левитации. Амплитуда акустического давления отображается в зависимости от частоты для трех мест внутри резервуара, соответствующих следующим координатам (x, y, z): (1) синий, (2,05,2,05,6) см, (2) красный, (0,0,1,28) см и (3) черный, (3,23,3,48,1,36) см, где начало системы координат берется в центре нижней поверхности кубического резервуара. Вблизи 31,5 кГц хорошо виден резонансный режим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Распределение акустического давления в левитационной камере. (A) Трехмерное представление поля давления в кубическом резервуаре для воды для выбранного резонансного режима. Этот режим происходит на частоте 31,2 кГц, соответствующей частоте источника ультразвука. b) Распределение акустического давления в диагональной плоскости цистерны. С) Распределение акустического давления в горизонтальной плоскости (высота z = постоянная). Высота выбрана такая, чтобы она соответствовала расположению пучности давления в верхней части бака. Амплитуды цветной полосы получаются наложением нормального смещения 1 мкм на поверхность преобразователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5. Фотографии и схемы экспериментальной установки. Он состоит из (A) системы акустической левитации, (B-C) импульсного лазерного усилителя и лазерной головки, (D-E) набора фокусирующих линз, (F) высокоскоростной камеры, (G) светоизлучающего диода, (H) лазера непрерывной волны и (I) набора формирующих линз. а) вид сбоку и б) вид сверху на экспериментальную установку. c) Иллюстрация материалов, необходимых для улавливания колебаний пузырьков. Обратите внимание, что непрерывный лазер (H) отключается во время этого процесса. d) Иллюстрация материалов, необходимых для улавливания потоков жидкости. Обратите внимание, что импульсный лазер (C) для зарождения пузырьков выключен, в то время как непрерывный лазер (H) для генерации лазерного листа, освещающего индикаторы микрочастиц, включен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6. Серия снимков пузыря, управляемого ультразвуком, демонстрирующего сферические колебания большой амплитуды. Радиус равновесия пузырька составляет ~ 60 мкм, а движущее акустическое давление составляет ~ 15 кПа. Временной интервал между двумя последовательными изображениями составляет 5,6 мкс. Вся серия соответствует двум акустическим периодам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7. Интерфейсная панель исполняемого скрипта PVR_Interface.exe. Скрипт запускает графический пользовательский интерфейс, который содержит (A) панель для настройки физических параметров, (B) таблицу для настройки приложенного электрического напряжения, приложенного к преобразователям, (C) возможность загрузки всего набора записанных видео, которые подвергаются постобработке и обеспечивают радиус равновесного пузырька (D) и приложенное акустическое давление (B), график соотношения давления и напряжения (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8. Диаграмма давления/радиуса зон неустойчивости. Каждая цветная область соответствует зоне нестабильности для данного режима формы: (синяя область) Режим 2, (зеленая область) Режим 3 и (красная область) Режим 4. Белая область соответствует случаю, когда микропузырьки проявляют только сферические колебания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9. Серия снимков слияния пузырьков, приводящих к колебаниям формы. После сближения фазы двух пузырьков тонкая пленка между ними разрывается и происходит коалесценция. Один пузырь теперь приводится в движение ультразвуковым полем, сначала в режиме переходных колебаний. Через несколько акустических периодов установился установившийся режим на осесимметричной моде формы, здесь мода 4. Промежуток времени между двумя последовательными фотографиями составляет 30 мкс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10. Первые пять осесимметричных режимов формы, включая радиальный режим. Вид сбоку контура пузырьковой границы раздела показан на двух экстремумах амплитуды колебаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 11
Рисунок 11. Флуоресцентные индикаторные частицы вокруг сферически колеблющихся микропузырьков. Оба изображения соответствуют суперпозиции из 100 снимков продолжительностью 0,25 с. (a) Движение частиц-индикаторов не наблюдается, если нет колебаний формы. (b) Паразитный средний поток, видимый во всем поле зрения, может появиться, например, из-за нагрева листа Lase. Этот поток, однако, не связан с движением пузырька. На обоих изображениях хорошо видна тень, индуцированная лазерным листом за пузырем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 12
Рисунок 12. Квазиодновременная регистрация динамики пузырьков и индуцированного микростриминга. Левый столбец: Серия снимков одного пузырька, демонстрирующего колебания моды формы порядка 3 (a) и индуцированного микропотока (b). Правый столбец: Серия снимков одного пузырька, демонстрирующего колебания формы порядка 4 (c) и индуцированный микропоток (d). Для всех рисунков красная пунктирная линия соответствует оси симметрии как колебаний формы пузырька, так и потоков жидкости, определяемой прямолинейным движением двух приближающихся пузырьков до слияния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 13
Рисунок 13. Пример двух потоковых паттернов, индуцированных пузырьком, колеблющимся преимущественно в моде 3. (а,г) Иллюстрация и снимок пузырькового интерфейса, (b,e) разложение моды пузырькового интерфейса и (c,f) связанный с ним шаблон потоковой передачи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленная процедура заключается в использовании пузырьковой коалесценции для того, чтобы вызвать стационарные, контролируемые симметрией колебания формы пузырьков, что позволяет изучать долгосрочный поток жидкости, индуцированный этими колебаниями. Основной проблемой в технике является управление несферическими колебаниями для пузыря, находящегося в ловушке, вдали от каких-либо границ.

Большинство существующих методов, предложенных в литературе, сосредоточены на пузырьках, прикрепленных к подложке 7,16, так как отсутствие движения центра пузырька облегчает захват его границы раздела в акустическом масштабе времени (до сотен кГц). В то время как превышение порога давления, необходимого для запуска мод формы, в этом случае является легкой задачей, управление колебаниями формы усложняется из-за нарушения симметрии, вызванного подложкой. Прикрепленный к стене пузырь контактирует с подложкой под определенным углом контакта, что приводит к срабатыванию асимметричных мод21 поверхности. В дополнение к сложности интерпретации трехмерных, асимметричных мод только с одной камеры, возникает резкий переход к хаотическому режиму колебаний поверхности33. Таким образом, основная задача состоит в том, чтобы уловить колебания формы одиночного, захваченного пузыря вдали от каких-либо границ, чтобы получить осесимметричные несферические колебания. Такие условия позволяют сравнивать эксперименты с большим разнообразием аналитических исследований, доступных в литературе. Основная экспериментальная трудность заключается в позиционной устойчивости микропузыря. Чтобы преодолеть эту проблему, оптический пинцет был использован для управления улавливанием пузырьков34, а амплитудно-модулированные ультразвуковые поля используются для улавливания и управления колебаниямипузырьков 29. В обоих случаях один пузырь попадает в ловушку и срабатывают несферические моды. Кроме того, в случае амплитудно-модулированного поля вождения моды формы существуют только в течение небольшого периода времени, поскольку они периодически возникают и исчезают. Кроме того, ориентация колебаний формы пузырька не контролируется и приводит к смещению при анализе движения границы раздела.

Альтернативой, которую мы предлагаем, является использование импульсного лазера для зарождения одного пузыря, который позже попадает в пучность давления резонансной левитационной камеры. Зарождая последовательные пузырьки с течением времени, каждый ядерный пузырь движется к своему месту захвата, которое уже занято другим пузырьком. Происходит слияние, которое индуцирует первоначально деформированную границу раздела пузырьков. Если движущее давление достаточно сильное, колебания формы сохраняются. Лазерное зарождение было предпочтительнее других методов зародышеобразования, таких как, например, электролиз, поскольку оно позволяет быстро и надежно генерировать пузырьки. Как показано на рисунке 9, ось симметрии колебаний формы задается осью сближения пузырьков до слияния. Однако этот основной результат требует относительно длительного времени для настройки экспериментальной установки, поскольку требуется, чтобы пузырьки оставались внутри фокальной плоскости камеры во время фазы приближения коалесценции (чтобы сориентировать ось симметрии в этой плоскости). Для этого вносятся небольшие изменения в место зарождения пузырьков, чтобы оптимизировать траекторию, по которой пузырьки движутся и сталкиваются друг с другом. Изменение места зарождения пузырьков требует точной модификации местоположения резервуара относительно траектории лазера и выполняется с помощью трехнаправленного каскада с микрометрической точностью. Кроме того, выполняется тонкая настройка энергии лазера с целью оптимизации размера зародышеобразного пузырька. Слишком большие пузырьки сразу же генерируют моды формы с большим числом мод и приближаются к объемному резонансу пузырьков. Это приводит к высокой позиционной неустойчивости пузырькового центра. Слишком маленькие пузырьки потребуют большого количества процессов коалесценции, прежде чем достигнут соответствующего размера для запуска режимов формы.

Основным преимуществом предложенной методики является установление установившегося режима для управляемых симметрией колебаний формы. Поскольку движение границы раздела поддерживается в течение относительно длительного времени (от секунд до минут), улавливание потока жидкости, индуцированного пузырьками, возможно путем переключения экспериментальной установки на отслеживание флуоресцентных наночастиц, засеянных в жидкую среду. Стоит отметить, что до сих пор в литературе не существует экспериментальных исследований микропотоков, индуцированных пузырьком в бесконечной жидкости. Кроме того, даже когда кавитационный микропоток исследуется для пузырьков, прикрепленных к субстрату, анализ ограничивается качественными наблюдениями без учета связи с динамикой пузырьков16. Измерение движения частиц выполняется в тонком лазерном листе, обеспечиваемом лазером непрерывного действия. Поскольку необходимо выполнять квазиодновременно (i) лазерное зарождение импульсным лазером, (ii) отслеживание частиц с помощью лазерного листа и (iii) запись высокоскоростной камерой, особое внимание должно быть уделено потенциальному засорению материалов, окружающих резервуар для воды. Это приводит к компактной установке со многими ограничениями на расположение устройств, как показано на рисунке 5. При захвате микропотокового паттерна, индуцированного колеблющимся пузырьком, необходимо в качестве альтернативы отслеживать динамику интерфейса пузырьков, как упоминалось на шаге 4.2. Действительно, переключение между альтернативными последовательностями динамики пузырьков и визуализацией потока жидкости позволяет безопасно связать микропотоковый паттерн с колебаниями заданной формы. Эта альтернативная процедура является обязательной, так как (i) колебания формы могут отключиться, (ii) стабильность пузырька может резко возрасти, что приведет к позиционной нестабильности пузырька, (iii) пузырь может фрагментироваться при возникновении больших деформаций. Даже если эти события редки, важно убедиться, что динамика пузырьков остается неизменной, записывая ее как до, так и после съемки микропотокового паттерна. (Таким образом, можно быть уверенным, что движение пузыря и паттерн действительно коррелируют).

Доказано, что пузырь, колеблющийся преимущественно на заданном номере моды, приводит к определенному микропотоковому паттерну, как показано на рисунке 12. Паттерн уникален и зависит от модального содержания движения интерфейса. Как показано на рисунке 13, одно и то же преобладающее число мод может индуцировать вихри на больших или малых расстояниях в зависимости от количества, амплитуды и фазы возбуждаемых вторичных мод.

Эти наблюдения могут иметь практическое применение в медицинских приложениях, таких как, например, адресная и локализованная ультразвуковая доставка лекарств. Известно, что пузырьки действуют как векторы для проникновения в плотные соединения между клетками и даже в саму клеточную мембрану, что приводит к сонопорации1. В случае стабильно колеблющихся микропузырьков это явление может быть вызвано напряжением сдвига или градиентаминапряжения сдвига 35, индуцированными колебаниями пузырьков, посредством генерации потоков микропотока. Напомним, что микростриминг — явление нелинейного второго порядка. Во-первых, масштабирование наблюдаемых потоковых паттернов до уровня, полученного для терапевтических, панцирных, микропузырьков с меньшими размерами (радиус ~ 3 мкм) не является простым. Во введении мы уже показали, как можно масштабировать несферическую динамику свободных или покрытых глазами пузырьков с разницей в один порядок: собственная частота ω n данной моды n связана с размером пузырька как Equation 125. В Dollet et al.27 моды формы порядка 4 были захвачены для микрометрических пузырьков с покрытием, возбуждаемых на частоте 1,7 МГц, аналогично наблюдаемому номеру моды формы в нашем эксперименте. Кроме того, приложенное давление сильно различается, так как давление до 200 кПа требуется для запуска режимов формы на микропузырьках27 ультразвукового контрастного вещества. В предлагаемой установке максимальное приложенное давление не превышает 25 кПа. Сильная разница в приложенном давлении возникает в результате срабатывания поверхностных неустойчивостей, поскольку моды формы появляются выше определенного порога давления. Для экспериментальных условий на частоте 1,7 МГц, приведенных в Dollet et al. 27, было показано, что порог давления, приводящий к нестабильности формы, составляет около 150 кПа для моды 436. Для частоты управления 30 кГц требуется всего 10 кПа амплитуда управляющего поля, чтобы вызвать нестабильность формы на пузырьке ~ 50 мкм. После срабатывания нестабильность формы развивается после нескольких акустических циклов и демонстрирует плато насыщения амплитуды моды. Амплитудное насыщение наблюдалось как для свободных пузырьков 24,29, так и для пузырьков с покрытием27. Это указывает на возможность достижения стационарных колебаний формы для свободных пузырьков или пузырьков с покрытием с колебаниями формы от 25 до 50% от амплитуды радиальной моды27,37. Используя наш экспериментальный подход, мы получаем экстремальные деформации формы в конфигурацииEquation 2 (где n - амплитуда моды формы), как показано на рисунке 13.

Подводя итог, можно сказать, что предложенная экспериментальная установка позволяет масштабировать основные особенности несферических колебаний микропузырьков даже для размеров, варьирующихся почти на порядок. Что касается микропотокового потока, масштабирование скорости потока может быть исследовано для пузырьков, проявляющих как боковые, так и радиальные колебания7 или несферическую моду, которая является самовзаимодействующей32. В обоих случаях масштаб скоростей потока равен v ~ ωR0a i a j, где i, j обозначает рассматриваемые амплитуды мод, нормализованные радиусом пузырька. Для аналогичных значений параметра несферического расширения ai получаются идентичные скорости потока при ωR0 ~ Constant. Сравнивая наши экспериментальные условия с теми, которые использовались для терапевтических микропузырьков27 с оболочкой, теоретические предсказания скоростей потока отличаются только в 2,5 раза. Измерения скоростей потока с помощью трекинговой скорости частиц привели к оценке величины скорости 1 мм/с в представленной здесь установке. Это значение аналогично тому, которое получено при исследовании микропотоков, индуцированных ультразвуковыми контрастными веществами19. Что касается пространственной организации картины потока, то угловое распределение вихрей потока вокруг границы раздела пузырьков не зависит от радиусапузырька 31. Изменение размера пузырька влияет только на радиальное расширение поля потока. Это радиальное расширение масштабируется как Equation 3, где — коэффициент, связанный с исследуемым числом моды. Понятно, что общая форма картины потока сохраняется, так как радиальное расширение управляется радиусом пузырька R0. Однако, как показано на рисунке 13, шаблон потоковой передачи может значительно отличаться даже при рассмотрении одного и того же номера режима формы. На рисунке 13 показано огромное влияние динамики границы раздела пузырьков на картину потоков и, в частности, на пространственную скорость изменения поля скоростей. Пространственное распределение напряжения сдвига, или градиента напряжения сдвига, было указано в качестве соответствующего показателя эффективности сонопорации35. В предлагаемой нами экспериментальной установке на этом этапе можно оценить только напряжение сдвига в объемной жидкости. Дальнейшее расширение напряжения сдвига стенки потребует добавления близлежащей поверхности, близкой к пузырю. Можно предсказать, что поверхность в окрестностях пузырька нарушит позиционную стабильность пузырька, локально изменяя поле стоячей волны. Обеспечение стабильности пузырьков на близком расстоянии от стенки по-прежнему является проблемой, которая может быть частично решена путем добавления вторичного ультразвукового поля, предназначенного для улавливания пузырьков, с длиной волны, идентичной расстоянию между пузырьком и стенкой. Такая двухчастотная акустическая левитационная камера уже была разработана для исследования динамики пузырьковых пар и сил взаимодействия38. К сожалению, большая разница в размерах между исследуемыми здесь пузырьками и биологическими клетками (типичный радиус ~ 10 мкм) делает прямое использование этой экспериментальной установки невозможным для биологических исследований. Тем не менее, мы ожидаем, что наши экспериментальные результаты в сочетании с самыми последними теоретическими разработками по пузырьковой микропотоковой передаче помогут улучшить такое моделирование, а также обеспечат уверенность в теоретическом прогнозировании напряжения сдвига, вызванного пузырьками, или градиентов напряжения сдвига в непосредственной близости от клеточной мембраны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана LabEx CeLyA Лионского университета (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspherical lens Thorlabs AL4050 Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source CNI MLL6FN DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LJ1277L1-A lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LK1900L1 lens of focus 250 mm
Fluorescent particles Duke Scientific R700 Red polymer fluorescent microspheres
Function generator Agilent HP33120 Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera Vision Research Phantom v12.0 High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium Carlo Erba Water for analysis Demineralized, undegassed water
Multiphysics software Comsol None Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser New Wave Research Solo III-15 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens Thorlabs N-BK7 lens of focus 125 mm
Spherical concave lens Thorlabs N-SF11 Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer SinapTec Custom-made Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software NIH ImageJ Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage Newport M-406 Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage Edmund Optics 62-299 Vertical displacement stage with micrometric screw

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roovers, S., et al. The role of ultrasound-driven microbubble dynamics in drug delivery: from microbubble fundamentals to clinical translation. Langmuir. 35 (31), 10173-10191 (2019).
  2. Liu, H. L., Fan, C. H., Ting, C. Y., Yeh, C. K. Combining microbubbles and ultrasound for drug delivery to brain tumors: current progress and overview. Theranostics. 4 (4), 432-444 (2014).
  3. Lammertink, B. H. A., et al. Sonochemotherapy: from bench to bedside. Frontiers in Pharmacology. 6, 138 (2015).
  4. Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10, 011501 (2016).
  5. Van Wamel, A., Bouakaz, A., Versluis, M., de Jong, N. Micromanipulation of endothelial cells: ultrasound-microbubble-cell interaction. Ultrasound in Medicine and Biology. 30, 1255-1258 (2004).
  6. Tran, T. A., Roger, S., Le Guennec, J. Y., Tranquart, F., Bouakaz, A. Effect of ultrasound-activated microbubbles on the cell electrophysiological properties. Ultrasound in Medicine and Biology. 33, 158-163 (2007).
  7. Marmottant, P., Hilgenfeldt, S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature. 423 (6936), 153-156 (2003).
  8. Prentice, P. A., Cuschieri, K., Dholakia, K., Prausnitz, M., Campbell, P. Membrane disruption by optically controlled microbubble cavitation. Nature Physics. 1, 107-110 (2005).
  9. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophysical Journal. 96, 4866-4876 (2009).
  10. Novell, A., et al. A new safety index based on intrapulse monitoring of ultra-harmonic cavitation during ultrasound-induced blood-brain barrier opening procedures. Scientific Reports. 10, 10088 (2020).
  11. Cornu, C., et al. Ultrafast monitoring and control of subharmonic emissions of an unseeded bubble cloud during pulsed sonication. Ultrasonics Sonochemistry. 42, 697-703 (2018).
  12. Reslan, L., Mestas, J. L., Herveau, S., Béra, J. C., Dumontet, C. Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation. Journal of Controlled Release. 142 (2), 251-258 (2010).
  13. Reuter, F., Gonzalez-Avila, S. R., Mettin, R., Ohl, C. D. Flow fields and vortex dynamics of bubbles collapsing near a solid boundary. Physical Review Fluids. 2, 064202 (2017).
  14. Chew, L. W., Klaseboer, E., Ohl, S. W., Khoo, B. C. Interaction of two differently sized oscillating bubbles in a free field. Physical Review E. 84, 066307 (2011).
  15. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  16. Tho, P., Manasseh, R., Ooi, A. Cavitation microstreaming patterns in single and multiple bubble systems. Journal of Fluid Mechanics. 576, 191-233 (2007).
  17. Van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. Journal of Controlled Release. 112, 149-155 (2006).
  18. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. PNAS. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  19. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterization of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12, 034109 (2018).
  20. Shklyaev, S., Straube, A. V. Linear oscillations of a compressible hemispherical bubble on a solid substrate. Physics of Fluids. 20, 052102 (2008).
  21. Fauconnier, M., Bera, J. C., Inserra, C. Nonspherical modes non-degeneracy of a tethered bubble. Physical Review E. 102, 033108 (2020).
  22. Xi, X., Cegla, F., Mettin, R., Holsteyns, F., Lippert, A. Study of non-spherical bubble oscillations near a surface in a weak acoustic standing wave field. The Journal of the Acoustical Society of America. 135, 1731 (2014).
  23. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Effect of a distant rigid wall on microstreaming generated by an acoustically driven gas bubble. Journal of Fluid Mechanics. 742, 425-445 (2014).
  24. Cleve, S., Guédra, M., Inserra, C., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Surface modes with controlled axisymmetry triggered by bubble coalescence in a high-amplitude acoustic field. Physical Review E. 98, 033115 (2018).
  25. Lamb, H. Hydrodynamics. 6th ed. , University Press. Cambridge. (1932).
  26. Liu, Y., Wang, Q. Stability and natural frequency of nonspherical mode of an encapsulated microbubble in a viscous liquid. Physics of Fluids. 28, 062102 (2016).
  27. Dollet, B., et al. Nonspherical oscillations of ultrasound contrast agent microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (9), 1465-1473 (2008).
  28. Versluis, M., et al. Microbubble shape oscillations excited through ultrasonic parametric driving. Physical Review E. 82, 026321 (2010).
  29. Guédra, M., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Dynamics of nonspherical microbubble oscillations above instability threshold. Physical Review E. 96, 063104 (2017).
  30. Cleve, S., Guédra, M., Mauger, C., Inserra, C., Blanc-Benon, P. Microstreaming induced by acoustically trapped, non-spherically oscillating microbubbles. Journal of Fluid Mechanics. 875, 597-621 (2019).
  31. Doinikov, A. A., Cleve, S., Regnault, G., Mauger, C., Inserra, C. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. I. Case of modes 0 and m. Physical Review E. 100, 033104 (2019).
  32. Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Doinikov, A. A. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. III. Case of self-interacting modes n-n. Physical Review E. 101, 013111 (2020).
  33. Prabowo, F., Ohl, C. D. Surface oscillations and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrasonics Sonochemistry. 18 (1), 431-435 (2011).
  34. Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined; optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90, 114103 (2007).
  35. Collis, J., et al. Cavitation microstreaming and stress fields created by microbubbles. Ultrasonics. 50, 273-279 (2010).
  36. Loughran, J., Eckersley, R. J., Tang, M. X. Modeling non-spherical oscillations and stability of acoustically driven shelled microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4349-4357 (2012).
  37. Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall - a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
  38. Regnault, G., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Secondary radiation force between two closely spaced acoustic bubbles. Physical Review E. 102, 031101 (2020).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 171 Кавитация микропузырь колебания формы микропоток высокоскоростная визуализация слияние пузырьков
Индукция микропотоков несферическими пузырьковыми колебаниями в системе акустической левитации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inserra, C., Regnault, G., Cleve,… More

Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Induction of Microstreaming by Nonspherical Bubble Oscillations in an Acoustic Levitation System. J. Vis. Exp. (171), e62044, doi:10.3791/62044 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter