Summary
提出了一种快速可靠的技术来控制单个捕获声气泡的形状振荡，该技术基于两个气泡之间的聚结技术。稳态、对称控制的气泡形状振荡允许分析气泡界面附近产生的流体流动。
Abstract
当位于生物屏障附近时，振荡微泡可能会增加细胞膜通透性，从而实现药物和基因内化。实验观察表明，这些屏障的暂时透化可能是由于空化微流对细胞组织施加的剪切应力。空化微流是在振荡的超声波微泡周围产生的涡流的产生。为了产生这样的液体流动，气泡振荡必须偏离纯粹的球形振荡，并包括平移不稳定性或形状模式。由于难以以稳定可控的方式捕获微气泡的形状变形，因此对附近表面的气泡诱导流动和剪切应力的实验研究范围通常受到限制。我们描述了用于研究对称控制非球形振荡的声学悬浮室的设计。这种控制是通过在足够强烈的超声场中使用两个接近的气泡之间的聚结技术来执行的。对非球形振荡的控制为自由表面振荡微气泡的受控空化微流开辟了道路。高帧率相机允许在声学时间尺度上准同时研究非球形气泡动力学和在较低时间尺度上的液体流动。结果表明，可以获得多种流体模式，并且它们与气泡界面的模态内容相关。我们证明，如果界面动力学包含多种模式，即使是高阶形状模式也可以创建大距离流体模式，突出了非球形振荡在靶向和局部药物递送方面的潜力。
Introduction
在医学上，给药的药物必须穿透生命系统中的许多障碍才能达到预期目标。然而，大多数药物会迅速从血液中清除。靶向效率低，不易穿过细胞膜，导致药物递送无效。目前，微泡与超声结合使用已被提出为一种将药物和基因无创、精确和靶向递送到病理组织和细胞的创新方法1。在这种方法中，微气泡可以作为载体发挥作用，其中游离药物要么与气泡悬浮液共同注射，要么加载在其表面上。微泡还可以作为局部载体，重新聚焦超声能量，以便与细胞相互作用。基本上，在超声波照射下，气泡稳定地压缩和膨胀，这种状态称为稳定空化，产生液体流动，从而对附近的物体产生剪切应力。在惯性空化状态下，微气泡也可能非线性振荡并膨胀直到坍塌，产生从坍塌部位径向传播的冲击波2。已经表明，空化，无论是稳定的还是惯性的，都会增强细胞膜的透化，从而增强药物内化到细胞中3。
在治疗应用中，了解气泡细胞相互作用的机制非常重要，但是从科学和技术方面来看，存在一些障碍，阻碍了我们的知识进步。首先，捕获细胞响应气泡诱导的机械刺激的动力学是非常困难的4。在声学时间尺度上，一阶微气泡振荡可以导致膜通道的激活，促进分子通过生物界面。这是通过细胞膜的直接振荡发生的，也称为“细胞按摩”5。使用膜片钳技术证明了直接机械应力后的通道激活，该技术测量了超声暴露期间和之后细胞膜的电生理特性6。在声学时间尺度上测量气泡诱导的细胞动力学（意味着细胞膜的完整变形场），还将提供诱导孔进入细胞膜所需的膜面积扩展阈值Δ A/ A的见解7。第二个屏障是控制破裂的气泡状态，以避免微气泡诱导的细胞裂解。气泡坍塌和诱导微射流已被确定为发生膜穿孔的机制8，9。一旦透化，细胞膜通过脂质双层的钙自密封和细胞内囊泡的融合进行修复9。气泡坍塌的发生也可能对细胞造成致命的损害，并在周围细胞中引起不必要的副作用。在超声波介导的血脑屏障打开等敏感应用中，人们普遍认为应避免惯性气泡坍塌10。
因此，目前在超声发射序列的设计上投入了巨大的精力，再加上被动空化监测和控制，以确保微气泡的稳定振荡11。在这种稳定的状态下，假设稳定振荡的气泡通过促进细胞膜上的空间靶向剪切应力在膜透化的触发中起着重要作用7。剪切应力是由振荡气泡附近产生的液体流动引起的。这些液体流动被称为空化微流，如上所述，它们是负责增强细胞外分子摄取的几种可能机制之一。当处理气泡或细胞悬浮液（例如体外生物转染测定12）时，通过微流透化可能比通过气泡塌陷进行透化更有效。这可以通过简单的几何考虑来证明。在细胞悬液中，如果大多数悬浮细胞受到足够大的机械效应（导致膜透化），则超声处理将是有效的。众所周知，气泡坍塌是沿着各向同性对称性破坏的方向定向的，例如气泡壁轴13 或气泡-气泡和气泡细胞线连接其质心14。因此，产生的微射流是一种空间定位现象，沿着连接细胞和气泡中心的有限数量的线。根据细胞和气泡浓度以及气泡-细胞距离，这种效应可能不是渗透整个悬浮细胞数量的最有效效果。相比之下，空化微流是一种在缓慢的时间尺度上发生的现象，与气泡半径相比，空间膨胀很大。此外，液体流动分布在气泡周围，因此可能会在很远的范围内影响更多的细胞。因此，了解振荡气泡周围产生的空化微流是控制和量化施加到细胞的气泡诱导剪切应力的先决条件。
为此，初步步骤包括控制超声波驱动气泡的球形和非球形振荡，因为产生的液体流动是由气泡界面15，16的运动引起的。特别是，必须触发微气泡的形状振荡并保持稳定。此外，必须控制气泡形状振荡的方向，以正确分析气泡界面动力学与诱导微流模式之间的相关性。在总结现有文献时，很明显，空化诱导微流的详细实验结果仅适用于附着在表面上的气泡。壁挂式微气泡通常用于在超快显微镜系统下评估微米级的精确界面动力学和细胞相互作用。当考虑位于细胞膜上的振动微泡时，这种配置具有治疗相关性17，18，19。然而，对基板附着气泡的研究可能会使气泡动力学的分析更加复杂，部分原因是接触线动力学20的复杂性，以及不对称形状模式21的触发。在医疗和生物应用中，未附着在壁上的气泡通常存在于受限几何形状中，例如小容器。这显著影响气泡动力学和形状不稳定性。特别是，附近壁的存在将形状模式触发的压力阈值转移到较低的压力值，具体取决于形状模式数和气泡大小22。壁还影响气泡诱导的微流，对于产生的流动23，其强度可能更高。
在微气泡可能经历的所有可能情况（自由或附着，靠近墙壁，坍塌或稳定振荡）中，我们建议研究远离任何边界的单个气泡的非球形动力学。实验设置基于声学悬浮系统24，其中使用驻留超声波来捕获气泡。这种情况与医疗应用一致，例如，在超声转染室中，一组悬浮气泡和细胞共存。只要气泡和细胞不太接近，假设细胞的存在不会影响气泡界面动力学。当细胞遵循空化诱导的微流的环状轨迹时，它们周期性地接近并从气泡位置排斥，我们可以假设细胞的存在既不影响流动模式，也不会影响其平均速度。此外，从理论角度来看，非球形动力学和来自远离边界的单个气泡的诱导微流是众所周知的。为了将气泡诱导的液体流动与气泡轮廓动力学联系起来，需要准确表征气泡界面动力学。为此，最好在实验研究中调整与治疗中使用的时空尺度，以便通过使用以较低频率激发的大气泡来使用普通高速相机（低于100万帧/秒）进行采集。当考虑未涂层的气泡时，给定模式n的特征频率ωn与气泡大小相关，为
25。当考虑带壳气泡26时，这种半径-特征频率关系略有修改，但特征频率ωn的数量级保持不变。因此，在30kHz超声场中研究平衡半径~50μm的气泡类似于研究1.7 MHz场中半径~3μm的涂层气泡，正如Dollet等人提出的27。因此，预计会出现相似的形状模式编号和微流模式。
为了触发气泡界面的非球形振荡，必须超过与半径相关的特定压力阈值，如图 1所示。现有的实验技术依赖于声压的增加来触发表面模式（如图1中的路径（ 1）所示），要么通过逐步增加压力28 或通过负责表面模式29周期性开始和消退的调制幅度激励。这些技术的主要缺点是（i）表面振荡对称轴的随机取向，无法控制在成像平面中，（ii）气泡形状振荡的寿命短，使得在更大的时间尺度上难以分析感应液体流动，以及（iii）频繁触发不稳定的形状模式。我们提出了一种替代技术，可以在半径/压力图中以恒定的声压跨越压力阈值，如图 1中的路径（2）所示。为此，需要增加气泡尺寸，使其处于不稳定区域。这种增加是通过气泡聚结技术进行的。利用两个最初是球形振荡的微气泡的聚结来产生一个变形的气泡。如果聚结气泡的声压和气泡尺寸处于不稳定区，则会触发表面模式。我们还证明，聚结技术在稳态状态下诱导稳定的形状振荡，以及由两个接近的气泡的直线运动定义的受控对称轴。由于在几分钟内确保稳定的形状振荡，因此可以通过在液体介质中注入荧光微粒来分析气泡引起的流体流动，并由薄激光片照射。记录固体微粒在气泡界面附近的运动允许识别诱导流体流动的模式30。触发气泡形状振荡的总体原理，导致时间稳定的流体流动，如图 2所示。
在下面的协议中，我们概述了通过聚结技术创建稳定的气泡形状振荡所需的步骤，并描述了流体流动的测量。这包括声学悬浮系统的设计、声学校准、气泡成核和聚结技术、气泡界面动力学和周围流体流动的测量以及图像处理。
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Protocol
1. 声学悬浮室的设计
- 使用多物理场仿真软件（材料表）的几何模块设计一个光学透明（类似PMMA）的立方体储罐（每个面8厘米边缘和2.8毫米厚度）。
- 在水箱底部的中心插入一个圆柱形表面（Ø = 35 mm），以模拟超声换能器。
- 将每壁的边界条件设置为零压力，探头表面的振幅正常位移为1 μm。
- 使用频域模块，在三个任意位置 loc1 = （0.01375， 0.01375， 0.04125）、loc2 = （0， 0， 0.0088） 和 loc3 = （0.021725， 0.023375， 0.00935） 处，在频率范围 [10 - 40] kHz 中仿真储罐的频率响应函数 （FRF）。
- 调整油箱尺寸，使腔体的声学模式之一对应于换能器的标称频率（此处为31.2 kHz）。因此，FRF包含一个接近该频率的谐振峰，如图 3所示。
- 绘制储罐内的压力场图，如图 4所示。选择的共振模式必须在容器内部至少包含一个压力反节点，声学气泡将被困在该反节点上。
- 设计储罐时，设计一个可移动的顶面，每个边缘都有一个导向槽，以紧紧关闭储罐面。在顶面钻一个小孔，以便用液体介质填充罐。
- 将水箱放在包含超声换能器的自制框架上（Langevin型，标称频率31.2 kHz）。使用超声凝胶将探头耦合到储罐底壁。
- 将储罐和框架系统放在带有测微螺钉的三向位移台上。
- 用微滤、软化和水（未脱气，体积~500mL，氧饱和度约为8mg·L-1）。
注意：使用非脱气水代替脱气水可以在实验期间保持稳定的气泡。使用脱气水会加速由于气体扩散而导致的气泡收缩，即使通过整流（超声介导的）扩散略微平衡。
2. 气泡产生和声学校准
- 准备用于激光诱导气泡成核，声学激发和高速记录的实验装置（图5a，b，c）。实验装置包括（A）声学悬浮系统，（B）激光电源和（C）激光头，（D）一个球面凹透镜，（E）一个平凹透镜和一个非球面透镜，（F）高速相机，（G）连续发光二极管。稍后，为了测量液体流量（图5d）（H）一个连续波激光源，（I）一个圆柱形平凹透镜，然后插入第一个透镜后面并朝向正交轴的圆柱形平凹透镜。
- 将超声换能器插入函数发生器。将激励信号设置为：正弦波形，连续波，频率31.2 kHz。振幅是唯一的可变参数。
- 将镜头 （D） 放置在激光头 （C） 前方约 6 cm 处。
- 将镜头 （E） 放置在镜头 （D） 前方约 12 厘米处。
- 放置水箱（A），使激光的聚焦点位于水箱内，导致每个激光脉冲（5 -10 mJ）产生火花。激光火花应位于目标压力反节点下方约 3 厘米处。
注意：如果没有超声波（美国），激光成核气泡将由于浮力而上升到顶面。 - 打开超声换能器。增加施加的电压，直到气泡不再垂直上升，而是偏离压力反节点，并且在足够的高压下被捕获。
- 设置背光照明（连续发光二极管）和高速摄像机，以观察被困的气泡。
注意：当用激光火花对新气泡进行成核时，很容易捕获气泡接近其捕获位置的轨迹。 - 在水箱内移动激光火花的位置，使气泡轨迹保持在相机的焦平面内。
- 捕获一个气泡并使用以下参数捕获其径向振荡：帧尺寸 128 x 128 像素，采集速率 180 kHz。 图6提供了两个声学周期内大振幅径向振荡的示例。典型的气泡尺寸范围为 30 至 80 μm。
- 记录 3 到 30 毫秒内的气泡径向振荡，以捕获数百到数千个气泡振荡。重复此记录以增加传感器的施加电压。典型施加电压在 0 - 8 V 范围内。
注意：修改施加的电压时，捕获气泡的平衡位置略微垂直移动。要在不移动背光照明和相机的情况下跟踪振荡，请将系统（传感器和水箱）以微米精度放置在三向可移动工作台上。 - 打开超声换能器并捕获背景图像以进行后期分析。
- 按照以下过程对视频系列进行后处理：
- 运行可执行文件电压压力.exe。 图 7 中所示的界面应打开。
注意：该脚本可作为补充文档提供。 - 在左栏中指定物理和实验参数（图7A）。
- 在右下角的表格中指定一系列记录的施加电压值（图7B）。
- 在 气泡半径分析 面板中，单击 加载参数 （图 7C），然后选择包含视频系列所有文件的文件夹，然后选择背景图像（必填）。
- 允许选择一次分析所有视频，单击自动，或单击逐步分析。
- 对于每个视频文件，将绘制一个声学周期内气泡半径的演变，并叠加数值拟合。红色曲线对应于线性化的瑞利-普莱塞特建模。显示平衡气泡半径（图7D）。
- 根据数值拟合，该电压的施加压力显示在 压力（电压） 图面板中（图7E）。施加的压力值也显示在右下角的表格中（图7B）。对应于 0 - 8 V 电压动态的典型施加压力为 0 - 25 kPa。
- 处理完所有视频后，单击“线性 回归 ”按钮以执行压力/电压曲线的线性拟合。数据（电压和压力值）保存到位于当前目录中的.txt文件中。提供了拟合的斜率。
- 运行可执行文件电压压力.exe。 图 7 中所示的界面应打开。
3. 聚结技术
- 打开超声换能器。根据失稳区的数值压力/半径图，将施加的电压设置得足够高，以使相应的声压可能导致表面不稳定的触发，如图 8所示。
- 成核气泡，然后迁移到其捕获位置。如果被捕获的气泡仅表现出球形振荡，请继续下一步。如果出现非球面振荡：
- 关闭超声波电源，让气泡上升到顶部表面。
- 修改激光能量（通过微调几mJ）或降低换能器电压。
- 打开超声波电源。
- 成核一个新的气泡。
- 重复此过程，直到气泡尺寸导致纯球形振荡。
- 当被捕获的气泡仅表现出球形振荡时，产生新的激光火花。当新气泡到达捕获位置时，会发生聚结。
- 如果聚结的气泡仅表现出球形振荡，则生成一个新气泡。可能需要多次聚结才能达到发生非球形变形的气泡半径。气泡聚结导致非球形振荡的示例如图 9所示。
- 一旦聚结气泡表现出非球形振荡，记录气泡振荡的持续时间约为 3 到 30 毫秒。
- 通过参考 图10确定形状振荡的模式数。
4. 流体流量测量
- 在空化微流测量的情况下，必须在气泡成核之前将荧光示踪剂颗粒添加到水中。在这项研究中，使用了0.71μm颗粒（材料表）。它们足够小，可以达到声学透明（不受声辐射力的影响）并精确地跟随流动，并且足够大以散射激光。使用三滴水箱的容积，对应于大约 2.104 个颗粒/mm3。
- 在进行测量之前，请设置以下参数以捕获（快速时间尺度）气泡动力学和（低时间尺度）流体流动：
- 创建摄像机记录盘的分区。
- 或者，将记录参数定义为：
- 帧速率 180 kHz，帧尺寸 128 x 128 像素，曝光时间 1 μs，一次气泡界面动态记录
- 帧速率 600 Hz，帧大小 1024 x 768 像素，曝光时间 1 毫秒，记录一次染料示踪剂的运动。
- 使用连续激光。
- 通过连续让激光束通过圆柱形平凹透镜和沿正交轴定向的圆柱形平凸透镜来创建薄激光片。可以获得约160μm的光束宽度。
- 设置激光片以对应于成像平面：
- 将激光放在可移动设备上，以便激光片可以平行于成像平面移动。
- 调整位置，使相机可以看到被照亮的粒子。
- 成核并捕获气泡。
- 进一步调整激光片的位置，使气泡后面可见阴影。气泡现在位于激光片内，如图 11所示。
- 诱导气泡聚结，直到出现稳定振荡的形状模式。
- 在气泡动力学和微流之间来回切换进行多次录制。
注意：不需要时关闭连续激光。加热会产生不需要的对流。此外，在执行流的测量时关闭发光二极管。
5. 图像处理以可视化空化微流模式
- 安装可视化软件ImageJ，用于Java中的图像处理和分析。还要安装插件CINE文件阅读器，以打开高速相机文件。
- 点击 “文件”|”进口 |CineFile 并选择包含粒子运动捕获的视频 *.cine。
- 在新窗口中选择 使用虚拟堆栈 ，视频现已加载。
- 要在不显示流模式的情况下观察粒子运动，请单击 “图像 |调整 |亮度/对比度 |自动。深色背景现在被自动优化的图像所取代。
- 要显示结果图案，请单击“图像 |堆栈 |Z 投影，然后选择图像投影的最大强度选项。将显示一个输出图像，其像素包含堆栈中所有图像的最大值。如有必要，请按照步骤 5.4 中所述调整图像对比度。
注意：获得如图 12b 和 图 12d 所示的流模式。
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Representative Results
图9显示了导致时间稳定、对称控制的非球形振荡的完整气泡聚结序列。当两个气泡之间的薄液膜破裂时，两个球形振荡气泡的接近阶段结束。值得注意的是，在聚结前的最后阶段，气泡界面偏离了球形度。两个气泡沿直线运动的路径以椭圆形拉长。在聚结的瞬间之后，单个气泡仍然存在，并在几个声学周期内表现出具有复杂形状的非球形振荡。这对应于任何动力系统激励后的瞬态振荡状态。经过十几到一百个声学周期后，形状振荡稳定在稳态振荡上，此处显示了模式4，从图10的解释中可以推断出来。此模式可能会持续数千个声学周期，持续几毫秒到几分钟。这允许准同时测量气泡引起的液体流量。
一旦气泡被捕获并表现出稳定的形状振荡，就会捕获荧光示踪剂在气泡附近的运动，如图11所示。首先，表现出纯球形振荡的气泡没有粒子运动与几个空化微流模型31一致，这些模型证明纯径向振荡没有引起涡度。当发生形状振荡时，在气泡界面附近产生液体运动，如图12所示。在声学时间尺度上气泡界面的动力学（图12a，c）和在较低时间尺度上粒子运动（图12b，d）的替代记录允许将微流模式与给定的形状模式编号相关联。图12a显示了平均半径R0=70.5 μm的气泡的气泡动力学快照系列，在声压Pa = 12.8 kPa下驱动，该气泡主要在模式3上振荡。图12b中的相关微流模式由六个波瓣组成。形状模态振荡和微流模式之间的对称轴守恒清晰可见。图12c显示了平均半径R0=55.7 μm的气泡的气泡动力学快照系列，在声压Pa = 23.6 kPa下驱动，该气泡主要在模式4上振荡。图12d中的相关微流模式由八个气泡直径大小的小裂片组成。再一次，形状模态振荡和微流模式之间的对称轴守恒清晰可见。这些结果似乎证实了形状模式越高，微流模式越小，它们在气泡附近的限制就越大。
这种对高阶模式的较窄流模式的假设并不那么明显，并且取决于气泡界面动态的模态内容。事实上，我们必须记住，气泡引起的液体流动是由两种以相同频率振荡的形状模式之间的相互作用，或者一种模式与自身的自相互作用引起的31.主要在给定形状的模式上振荡的气泡，例如，让我们考虑模式3，也可能通过模式29之间的非线性耦合激发其他非球形振荡。如果气泡接口的动态包含补充模式，例如第二和第四种模式，则由于模式之间的多种交互将生成特定模式，因此可以显着修改微流流。图 13 说明了两个主要在模式 3 上振荡的气泡，它们诱导出两种不同的微流模式。在图13a，b，c中，平衡半径R0 = 70.1 μm的气泡在声压Pa = 12.4 kPa下驱动，在模式3上振荡，呈现瓣型模式。对界面动力学的分析（图13b）显示，主要模式是径向模式（在驱动频率f 0处振荡）、平移模式（数字为1的模式，以驱动频率f 0的一半振荡）、第三种模式（在f 0/2处振荡）和相对较小的第四和第六模式（均在f 0).可以假设，对微流流的主要贡献是径向模式与模式4和模式6之间的相互作用，导致叶型模式31。在图13d，e，f中，平衡半径R0 = 68.6 μm的气泡，在声压Pa = 13.3 kPa下驱动，在模式3上振荡，呈现十字型模式，具有大距离流动延伸。对界面动力学的分析（图13d）表明，主要模式是径向模式、平移模式（模式为1）、第三和第六个模式。根据模式3的高振幅，可以假设对微流流的主要贡献是模式3的自相互作用，导致交叉型模式32。
图1.触发形状振荡的方法图示。 压力/半径图包含给定度的每个模式的一个不稳定区域。达到该区域的压力阈值可以通过（1）增加驱动固定半径的气泡的施加声压，直到出现形状模式，或（2）在恒定施加的声压下增加气泡尺寸。当发生整流扩散时，气泡体积的这种增加缓慢发生，而气泡聚结显着加快了该过程。 请点击此处查看此图的大图。
图2.气泡聚结技术的图解。 接近阶段（A）由激光成核两个气泡组成，这两个气泡在容器内的同一捕获位置相互相遇。当它们相遇时，会发生聚结：气泡（B）之间的薄液膜破裂导致产生单个初始变形的气泡。这种变形的气泡由单色超声场驱动，在进入稳态状态之前在第一次瞬态振荡（C）时表现出来。在稳态状态（D）中，聚结气泡表现出时间稳定的对称控制形状振荡。通过用荧光纳米颗粒接种培养基，捕获气泡诱导的流体流动（E）。 请点击此处查看此图的大图。
图3.悬浮系统内压力场的频率响应函数。 声压的幅度显示为频率的函数，对于罐内的三个位置，对应于以下 （x，y，z） 坐标：（1） 蓝色，（2.05，2.05，6）cm，（2） 红色，（0，0，1.28）cm 和 （3） 黑色，（3.23，3.48，1.36）cm，其中坐标系的原点位于立方体罐底面的中心。在接近31.5kHz时，谐振模式清晰可见。 请点击此处查看此图的大图。
图4.悬浮室内声压的分布。 （A） 所选共振模式立方体水箱内压力场的三维表示。该模式发生在对应于超声源频率的频率31.2 kHz处。（B）声压在罐体对角平面上的分布。（C）声压在水平（高度z=恒定）平面上的分布。高度的选择使其对应于压力反节点在坦克上部的位置。色条的振幅是通过在换能器表面施加1μm的法向位移获得的。 请点击此处查看此图的大图。
图5.实验装置的照片和示意图。 它由（A）声学悬浮系统，（B-C）脉冲激光放大器和激光头，（D-E）聚焦透镜组，（F）高速相机，（G）发光二极管，（H）连续波激光器和（I）整形透镜组组成。（a）实验装置的侧面和（b）顶视图。（c） 说明捕捉气泡振荡所需的材料。请注意，在此过程中，连续激光（H）被关闭。（d） 说明捕获液体流动所需的材料。请注意，用于气泡成核的脉冲激光器（C）关闭，而用于生成照亮微粒示踪剂的激光片的连续激光（H）打开。 请点击此处查看此图的大图。
图6.超声波驱动气泡的快照系列，表现出大振幅的球形振荡。 气泡平衡半径为~60μm，驱动声压为~15kPa。两个连续图像之间的时间间隔为5.6 μs。整个系列对应于两个声学周期。 请点击此处查看此图的大图。
图7.可执行脚本PVR_Interface.exe的接口面板。 该脚本启动一个图形用户界面，其中包含 （A） 用于设置物理参数的面板，（B） 用于设置施加到换能器的施加电压的表格，（C） 加载整组录制视频的可能性，这些视频经过后处理并提供平衡气泡半径 （D） 和施加的声压 （B）， 压力/电压关系图（E）。 请点击此处查看此图的大图。
图8.不稳定区的压力/半径图。 每个彩色区域对应于给定形状模式的不稳定区域：（蓝色区域）模式 2、（绿色区域）模式 3 和（红色区域）模式 4。白色区域对应于微气泡仅表现出球形振荡的情况。 请点击此处查看此图的大图。
图9.气泡聚结导致形状振荡的快照系列。 在两个气泡接近阶段后，它们之间的薄膜破裂并发生聚结。单个气泡现在由超声场驱动，首先是在瞬态振荡状态下。经过一段时间后，稳态状态建立在轴对称形状模式上，这里是模式4。两张连续照片之间的时间间隔为30 μs。 请点击此处查看此图的大图。
图 10.前五种轴对称形状模式，包括径向模式。 气泡界面轮廓的侧视图显示在振荡幅度的两个极值处。 请点击此处查看此图的大图。
图 11.球形振荡微泡周围的荧光示踪剂颗粒。 两个图像都对应于 100 个快照的叠加，覆盖 0.25 秒。（a） 如果不存在形状振荡，则无法观察到示踪剂颗粒的运动。（b） 例如，由于拉塞片的加热，可能会出现在整个视野中可见的寄生虫平均流。然而，这种流动与气泡运动无关。在两幅图像上，气泡后面的激光片引起的阴影清晰可见。 请点击此处查看此图的大图。
图 12.准同时记录气泡动力学和诱导微流。 左列：一个气泡的快照系列，表现出 3 阶 （a） 和感应微流 （b） 的形状模式振荡。右列：一个气泡的快照系列，表现出 4 阶 （c） 和感应微流 （d） 的形状模式振荡。对于所有图形，红色虚线对应于气泡形状振荡和液体流动的对称轴，由两个接近的气泡在聚结前的直线运动决定。 请点击此处查看此图的大图。
图 13.由主要在模式 3 上振荡的气泡引起的两种流模式的示例。 （一、四）气泡接口的图示和快照，（b，e） 气泡接口的模式分解和 （c，f） 关联的流模式。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
所提出的程序包括使用气泡聚结来触发稳态，对称控制的气泡形状振荡，从而可以研究由这些振荡引起的长期流体流动。该技术的主要挑战是控制气泡被捕获的非球形振荡，远离任何边界。
文献中提出的大多数现有技术都集中在基板附着的气泡7，16上，因为气泡中心的无运动使得在声学时间尺度（高达数百kHz）下捕获其界面变得更加容易。虽然在这种情况下，超过触发形状模式所需的压力阈值是一件容易的事，但由于基板引起的对称性断裂，形状振荡的控制很复杂。壁附气泡以特定的接触角接触基板，导致触发不对称表面模式21。除了仅用单个相机视图解释三维非对称模式的复杂性之外，还出现了突然过渡到混沌表面振荡状态的情况33。因此，主要挑战在于捕获远离任何边界的单个捕获气泡的形状振荡，以获得轴对称非球形振荡。这样的条件使得实验与文献中可用的各种分析研究之间的比较成为可能。主要的实验难点在于微气泡的位置稳定性。为了克服这个问题，光镊已被用于控制气泡捕获34，调幅超声场用于捕获和驱动气泡振荡29。在这两种情况下，单个气泡都被捕获并触发非球形模式。此外，在调幅驱动场的情况下，形状模式只存在一小段时间，因为它们周期性地开始和消失。此外，气泡形状振荡的方向不受控制，导致界面运动分析中的偏差。
我们提出的替代方案是使用脉冲激光对单个气泡进行成核，然后将其捕获在共振悬浮室的压力反节点处。通过随着时间的推移连续成核气泡，每个有核气泡都向已经被另一个气泡占据的捕获位置移动。发生聚结并诱导初始变形的气泡界面。如果驱动压力足够强，则形状振荡保持不变。激光成核比其他成核技术（例如电解）更受欢迎，因为它可以快速可靠地产生气泡。如图 9所示，形状振荡的对称轴由聚结前的气泡进近轴给出。然而，这一主要结果需要相对较长的时间来设置实验设置，因为在聚结的接近阶段，气泡需要留在相机的焦平面内（以便定位该平面中的对称轴）。为此，对气泡成核位点进行细微更改，以优化气泡移动和相互相遇的路径。改变为气泡成核部位需要相对于激光路径对储罐位置进行微调，并且以微米精度的三向平台进行。此外，还对激光能量进行微调，以优化有核气泡尺寸。太大的气泡会立即产生具有高模数的形状模态，并接近体积气泡共振。这导致气泡中心的高度位置不稳定性。太小的气泡需要大量的聚结过程才能达到触发形状模式的适当大小。
该技术的主要优点是建立了对称控制的形状振荡的稳态制度。由于界面运动持续相对较长的时间（从几秒钟到几分钟），因此可以通过将实验设置切换到跟踪接种到液体介质中的荧光纳米颗粒来捕获气泡引起的流体流动。值得注意的是，迄今为止，文献中还没有关于无限液体中气泡诱导微流的实验研究。此外，即使对基底附着的气泡进行空化微流研究，分析也仅限于定性观察，而不考虑与气泡动力学的联系16。粒子运动的测量是在连续波激光器提供的薄激光片中进行的。由于必须准同时（i）脉冲激光进行激光成核，（ii）使用激光片进行粒子跟踪，以及（iii）通过高速摄像机进行记录，因此必须特别注意水箱周围材料的潜在障碍物。这导致了一个紧凑的设置，对器件配置有许多限制，如图 5所示。当捕获由形状振荡气泡诱导的微流模式时，有必要交替跟踪气泡界面动态，如步骤4.2中所述。事实上，在气泡动力学和流体流动可视化的替代序列之间切换，可以安全地将微流模式与给定的形状振荡相关联。这种替代程序是强制性的，因为（i）形状振荡可能会关闭，（ii）气泡稳定性可能会突然增加，导致气泡的位置不稳定，（iii）当发生大变形时，气泡可能会碎裂。即使这些事件很少见，通过在拍摄微流模式之前和之后记录气泡动力学来验证气泡动力学是否保持不变也很重要。（通过这种方式，可以确保气泡运动和图案确实相关）。
是否证明主要在给定模式数上振荡的气泡会导致特定的微流模式，如图 12 所示。该模式是唯一的，取决于界面运动的模态内容。如图 13所示，相同的主模数可能会诱发大距离或小距离涡旋，具体取决于被激励的次级模态的数量、幅度和相位。
这些观察结果可能具有实际用途，例如靶向和局部超声介导的药物递送。众所周知，气泡充当透化细胞之间紧密连接甚至细胞膜本身的载体，导致声波1。在稳定振荡的微气泡的情况下，这种现象可能是由气泡振荡引起的剪切应力或剪切应力梯度35引起的，通过微流的产生。我们记得微流是一种非线性的二阶现象。首先，将观察到的流模式缩放到为较小尺寸（~3μm半径）的治疗性，带壳，微气泡获得的模式并不简单。我们已经在引言中证明了如何缩放一个数量级大小差异的自由或涂层气泡的非球形动力学：给定模式n的特征频率ωn与气泡大小相关为25。在Dollet等人27中，对于在1.7 MHz激发的涂层微米气泡，已经捕获了4阶的形状模式，类似于我们实验中观察到的形状模式数。此外，施加的压力有很大差异，因为需要高达200kPa的压力才能触发超声造影剂微气泡27上的形状模式。在建议的设置中，最大施加压力不超过 25 kPa。施加压力的强烈差异是由于触发表面不稳定性，因为形状模式出现在某个压力阈值以上。对于Dollet等人27中给出的1.7 MHz实验条件，已经表明，对于模式436，导致形状不稳定的压力阈值约为150 kPa。对于30 kHz的驱动频率，只需要10 kPa的驱动场幅度即可触发~50 μm气泡上的形状不稳定。一旦触发，形状不稳定会在几个声学周期后发展，并表现出模态幅度的平台饱和。观察到自由气泡24，29和涂层气泡27的振幅饱和。它表明自由或涂层气泡有可能达到稳态形状振荡，形状振荡大至径向模式振幅25，37 的 50%。使用我们的实验方法，我们在配置中达到了极端的形状变形（
其中n是形状模态幅度），如图13所示。
总而言之，所提出的实验设置允许缩放微气泡非球形振荡的主要特征，即使对于几乎一个数量级的尺寸变化也是如此。关于微流，流速的缩放可能正在研究表现出横向和径向振荡的气泡7，或自相互作用的非球形模式32。在这两种情况速的比例为 v ~ ωR0 a i a j，其中 i， j 表示由气泡半径归一化的所考虑的模式幅度。对于非球面膨胀参数 ai 的相似值，当 ωR0 ~ 常数时获得相同的流速。将我们的实验条件与用于治疗性带壳微泡27的实验条件进行比较，流速的理论预测仅与因子2.5不同。通过粒子跟踪测速法测量流速，导致在此介绍的设置中估计出1mm/s的速度大小。该值类似于研究超声造影剂19诱导的微流时获得的值。关于流模式的空间组织，气泡界面周围流动涡流的角度分布与气泡半径31无关。只有流场的径向扩展受气泡大小修改的影响。此径向膨胀缩放为 
，其中是与所研究的振数相关的系数。很明显，流模式的整体形状是守恒的，因为径向膨胀由气泡半径 R0 决定。但是，如图 13 所示，即使考虑相同的形状模式编号，流模式也可能有很大差异。图13突出显示了气泡界面动力学对流模式的巨大影响，特别是对速度场的空间变化率。剪切应力的空间分布或剪切应力梯度已被指示为声波效率的适当指标35。在我们提出的实验装置中，在这个阶段只能评估散装流体中的剪切应力。壁剪切应力的进一步扩展将需要在气泡附近添加附近的表面。可以预见的是，气泡附近的表面会通过局部改变驻波场来干扰气泡位置稳定性。确保气泡在与壁的距离很近的地方保持稳定性仍然是一个挑战，可以通过增加一个专门用于气泡捕获的次级超声场来解决，其波长与气泡壁距离相同。这种双频声学悬浮室已经设计用于研究气泡对动力学和相互作用力38。不幸的是，这里研究的气泡与生物细胞之间的大尺寸差异（典型半径~10μm）使得直接使用该实验装置无法进行生物学研究。然而，我们期望我们的实验结果与气泡诱导微流的最新理论发展相结合，将有助于改进这种建模，并为细胞膜附近气泡诱导剪切应力或剪切应力梯度的理论预测提供信心。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了里昂大学LabEx CeLyA（ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspherical lens | Thorlabs | AL4050 | Lens of focus 40 mm |
| Continuous wave laser source | CNI | MLL6FN | DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW |
| Cylindrical plano-concave lens | Thorlabs | LJ1277L1-A | lens of focus -25?4mm |
| Cylindrical plano-concave lens | Thorlabs | LK1900L1 | lens of focus 250 mm |
| Fluorescent particles | Duke Scientific | R700 | Red polymer fluorescent microspheres |
| Function generator | Agilent | HP33120 | Generator of function feeding the ultrasound transducer |
| High-speed camera | Vision Research | Phantom v12.0 | High-speed recording up to 1 Mfps |
| Liquid medium | Carlo Erba | Water for analysis | Demineralized, undegassed water |
| Multiphysics software | Comsol | None | Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber |
| Nd:Yag pulsed laser | New Wave Research | Solo III-15 | 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ |
| Plano-concave lens | Thorlabs | N-BK7 | lens of focus 125 mm |
| Spherical concave lens | Thorlabs | N-SF11 | Bi-concave lens of focus -25mm |
| Ultrasound transducer | SinapTec | Custom-made | Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter |
| Visualization software | NIH | ImageJ | Software for image processing and analysis in Java |
| XY Linear stage | Newport | M-406 | Displacement stage with micrometric screw |
| Z-axis linear stage | Edmund Optics | 62-299 | Vertical displacement stage with micrometric screw |
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