Summary
2つの気泡間の合体技術に基づく単一のトラップ音響気泡の形状振動を制御するための高速で信頼性の高い技術が提案されています。定常状態で対称的に制御された気泡形状振動により、気泡界面近傍で発生する流体の流れを解析できます。
Abstract
生物学的障壁の近くに位置する場合、振動するマイクロバブルは細胞膜透過性を高め、薬物および遺伝子の内在化を可能にする可能性がある。実験的観察は、これらの障壁の一時的な透過処理が、キャビテーションマイクロストリーミングによって細胞組織に及ぼされるせん断応力によるものである可能性があることを示唆している。キャビテーションマイクロストリーミングは、振動する超音波マイクロバブルの周りに発生する渦流の生成です。このような液体の流れを生成するには、気泡振動が純粋に球面振動から逸脱し、並進不安定性または形状モードのいずれかを含む必要があります。気泡誘起流れや近傍表面におけるせん断応力の実験的研究は、マイクロバブルの形状変形を安定して制御して捉えることが難しいため、その範囲が限定されることが多い。対称制御された非球面振動の研究のための音響浮上室の設計について説明します。このような制御は、十分に強い超音波場において2つの接近気泡間の合体技術を使用することによって行われる。非球面振動の制御は、自由表面振動マイクロバブルの制御されたキャビテーションマイクロストリーミングへの道を開きます。高フレームレートカメラは、音響時間スケールでの非球面気泡ダイナミクスと、より低い時間スケールでの液体の流れを準同時に調査することができます。多種多様な流体パターンが得られ、それらが気泡界面のモード含有量と相関していることを示しています。界面ダイナミクスに複数のモードが含まれていれば、高次形状モードでも長距離の流体パターンを作成できることを示し、標的および局所的な薬物送達のための非球面振動の可能性を強調しています。
Introduction
医学では、投与された薬物は、所望の標的に到達する前に、生体系の多くの障害物を貫通しなければならない。しかし、ほとんどの薬は血流から急速に取り除かれます。ターゲティング効率が低く、細胞膜を容易に通過できないため、薬物送達が効果がありません。現在、マイクロバブルと超音波の組み合わせは、病理学的組織および細胞への薬物および遺伝子の非侵襲的、正確かつ標的化された送達のための革新的な方法として提案されている1。このアプローチでは、マイクロバブルは、遊離薬物が気泡懸濁液と同時注入されるか、またはその表面に装填される担体としての役割を果たすことができる。マイクロバブルは、細胞と相互作用するために超音波エネルギーを再集束させるための局所ベクトルとしても作用することができる。基本的に、超音波照射下では、気泡は安定して圧縮および膨張し、液体の流れを生成し、したがって近くの物体にせん断応力を発生させる安定キャビテーションと呼ばれる体制である。マイクロバブルはまた、慣性キャビテーションの領域で非線形に振動し、崩壊するまで膨張し、崩壊部位2から放射状に伝播する衝撃波を生成する可能性があります。安定または慣性のいずれかのキャビテーションは、細胞膜の透過処理を促進し、したがって細胞内への薬物の内在化を促進することが示されている3。
治療用途では、気泡と細胞の相互作用のメカニズムを理解することは非常に重要ですが、科学的側面と技術的側面の両方から、私たちの知識の進歩を妨げるいくつかの障壁があります。まず、気泡が誘発する機械的刺激に応答する細胞の動態を捉えることは非常に困難です4。音響時間スケールでは、一次マイクロバブル振動は膜チャネルの活性化につながり、生物学的界面を横切る分子通過を促進することができます。これは、「細胞マッサージ」5とも呼ばれる細胞膜の直接振動によって起こります。直接的な機械的ストレス後のチャネル活性化は、超音波曝露中および曝露後の細胞膜の電気生理学的特性を測定するパッチクランプ技術を使用して証明されました6。気泡誘起細胞動態(細胞膜の変形の完全な場を意味する)を音響タイムスケールで測定することは、細胞膜7に孔を誘導するために必要な膜面積拡大ΔA / Aの閾値に関する洞察も提供するであろう。第2の障壁は、マイクロバブルによる細胞溶解を回避するために、崩壊する気泡レジームを制御することです。気泡崩壊と誘起マイクロジェットは、膜穿孔が起こるメカニズムとして同定されています8,9。透過処理されると、細胞膜は脂質二重層のカルシウム自己封鎖および細胞内小胞の融合によって修復される9。気泡崩壊の発生はまた、細胞に致命的な損傷を引き起こし、周囲の細胞に不必要な副作用を引き起こす可能性があります。超音波を介した血液脳関門開口部などの敏感なアプリケーションでは、慣性気泡の崩壊を避けるべきであると一般に認められています10。
したがって、マイクロバブル11の安定した振動を確保するために、パッシブキャビテーションの監視および制御と相まって、超音波放出シーケンスの設計に現在多大な努力が払われている。この安定な領域において、安定に振動する気泡は、細胞膜7上の空間的に標的化されたせん断応力を促進することによって、膜透過処理の誘発に強い役割を果たすという仮説が立てられている。せん断応力は、振動する気泡の近傍で発生する液体の流れから生じます。これらの液体の流れはキャビテーションマイクロストリーミングと呼ばれ、前述のように、細胞外分子の取り込みの促進に関与するいくつかの可能なメカニズムの1つです。インビトロ生物学的トランスフェクションアッセイ12のような気泡または細胞の懸濁液を扱う場合、マイクロストリーミングによる透過処理は、気泡崩壊による透過処理よりもはるかに効率的であり得る。これは、単純な幾何学的考察によって示すことができます。細胞懸濁液では、懸濁細胞の大部分が十分に大きな機械的効果(膜透過処理につながる)に服従する場合、ソノポレーションは効率的になります。気泡崩壊は、気泡壁軸13 や気泡-気泡と気泡セル線がそれらの重心14を結合するような等方対称性の破れ方向に沿って方向付けられることが知られている。したがって、生成されたマイクロジェットは、細胞の中心と気泡の中心を結ぶ有限数の線に沿った空間的に局在する現象です。細胞および気泡濃度、ならびに気泡-細胞間距離によっては、この効果は、浮遊細胞の総数を透過させるのに最も効率的ではない場合があります。対照的に、キャビテーションマイクロストリーミングは、気泡半径に比べて大きな空間膨張を伴う、遅い時間スケールで発生する現象です。また、液体の流れは気泡の周囲全体に分布しているため、非常に長い範囲でより多くのセルに影響を与える可能性があります。したがって、振動気泡の周囲に発生するキャビテーションマイクロストリーミングを理解することは、細胞に加えられる気泡誘起せん断応力を制御および定量化するための前提条件です。
そうするために、予備ステップは、生成された液体の流れが気泡界面15、16の運動によって誘導されるので、超音波駆動気泡の球状および非球形振動を制御することからなる。特に、マイクロバブルの形状振動をトリガーし、安定に保つ必要があります。さらに、気泡界面ダイナミクスと誘起マイクロストリーミングパターンとの相関を適切に解析するために、気泡形状振動の向きを制御する必要があります。既存の文献を要約すると、キャビテーション誘起マイクロストリーミングの詳細な実験結果は、表面に付着した気泡についてのみ利用可能であることは明らかです。壁に取り付けられたマイクロバブルは、超高速顕微鏡システムの下でマイクロメートルスケールで正確な界面ダイナミクスと細胞相互作用を評価するために一般的に使用されます。この構成は、細胞膜17、18、19上に位置する振動性マイクロバブルを考慮する場合に治療的に関連する。しかし、基板付着気泡の研究は、接触線ダイナミクス20の複雑な性質と非対称形状モード21のトリガーのために、気泡ダイナミクスの分析をより複雑にする可能性があります。医療および生物学的用途では、壁に付着していない気泡は、小さな容器などの限られた形状によく見られます。これは、気泡のダイナミクスと形状の不安定性に大きな影響を与えます。特に、近くの壁の存在は、形状モードトリガの圧力閾値を、形状モード数および気泡サイズ22に応じてより低い圧力値にシフトする。壁はまた、気泡誘起マイクロストリーミングにも影響を及ぼし、生成された流れ23に対しておそらくより高い強度を有する。
マイクロバブルが経験する可能性のあるすべてのシナリオ(自由または付着、壁の近く、崩壊または安定して振動)の中で、境界から遠く離れた単一の気泡の非球面ダイナミクスを調査することを提案します。実験セットアップは、気泡をトラップするために定在超音波が使用される音響浮上システム24に基づいている。このシナリオは、例えば、浮遊気泡と細胞の集合体がソノトランスフェクションチャンバー内に共存する医療アプリケーションと一致している。気泡と細胞が近すぎない限り、細胞の存在は気泡界面のダイナミクスに影響を与えないと仮定される。細胞がキャビテーション誘起マイクロストリーミングのループ状の軌跡をたどるとき、それらは周期的に気泡位置から接近して反発しており、細胞の存在はストリーミングパターンとその平均速度に影響を与えないと考えることができます。また、境界から遠く離れた単一気泡からの非球面ダイナミクスや誘起マイクロストリームは、理論的な観点からもよく知られています。気泡誘起液体の流れを気泡輪郭ダイナミクスにリンクさせるためには、気泡界面ダイナミクスを正確に特徴付ける必要があります。そのためには、治療に用いるものに対して時空間スケールを適応させ、一般的な高速度カメラ(100万フレーム/秒以下)で、低周波数で励起された大きな気泡を用いて取得できるようにすることが好ましい。コーティングされていない気泡を考える場合、与えられたモードnの固有周波数ωnは、25として
気泡サイズに関係します。この半径-固有周波数関係は、殻付き気泡26を考えると若干修正されるが、固有振動数ωnの大きさの程度は変わらない。したがって、30kHzの超音波場で平衡半径~50μmの気泡を調べることは、Dolletらによって提案されたように、1.7MHzの磁場で半径~3μmのコーティングされた気泡を研究することに似ています27。したがって、同様の形状モード番号、したがってマイクロストリーミングパターンが予想されます。
気泡界面の非球面振動をトリガするには、図1に示すように、半径に依存する特定の圧力閾値を超える必要があります。既存の実験技術は、段階的な圧力上昇28または表面モードの周期的な開始と消滅の原因となる変調振幅励起29のいずれかによって、表面モードをトリガーするための音圧の増加に依存しています(図1の経路(1)で示されています)。これらの技術の主な欠点は、(i)表面振動の対称軸のランダムな配向が結像面にあるように制御できないこと、(ii)気泡形状振動の寿命が短いため、より大きなタイムスケールで誘導された液体の流れの分析が困難になること、および(iii)不安定な形状モードが頻繁にトリガーされることです。図1の経路(2)に示すように、半径/圧力マップで一定の音圧で圧力しきい値を超える代替手法を提案します。そのためには、不安定ゾーンになるようにバブルサイズを大きくする必要があります。このような増加は、気泡合体技術によって行われる。最初は球状に振動する2つのマイクロバブルの合体を利用して、1つの変形気泡を作成します。合体気泡の音圧と気泡サイズが不安定ゾーンにある場合、サーフェスモードがトリガーされます。また、合体法が定常状態で安定した形状振動を誘起し、接近する2つの気泡の直線運動によって定義される対称軸を制御することも証明しました。安定した形状振動が数分にわたって確保されるため、薄いレーザーシートで照明された蛍光微粒子を液体媒体に播種することにより、気泡誘起流体の流れの分析が可能です。気泡界面近傍における固体微粒子の運動を記録することは、誘導流体流30のパターンを識別することを可能にする。気泡形状振動のトリガーの全体的な原理は、時間的に安定した流体の流れにつながることを図2に示します。
以下のプロトコルでは、合体技術を介して安定した気泡形状の振動を作成するために必要な手順の概要を説明し、流体の流れの測定について説明します。これには、音響浮上システムの設計、音響キャリブレーション、気泡核生成および合体技術、気泡界面ダイナミクスおよび周囲の流体流の測定、および画像処理が含まれます。
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Protocol
1.音響浮上室の設計
- マルチフィジックスシミュレーションソフトウェア(材料表)のジオメトリモジュールを使用して、光学的に透明な(PMMAのような)立方体タンク(エッジ8 cm、面あたり厚さ2.8 mm)を設計します。
- タンクの底部を中心とする円筒面(Ø=35mm)を挿入し、超音波探触子をモデル化する。
- 境界条件を、探触子表面での振幅1 μmの垂直変位で各壁の圧力をゼロに設定します。
- 周波数領域モジュールを使用して、loc1 = (0.01375, 0.01375, 0.04125), loc2 = (0, 0, 0.0088), および loc3 = (0.021725, 0.023375, 0.00935) の 3 つの任意の位置で、周波数範囲 [10 - 40] kHz のタンクの周波数応答関数 (FRF) をシミュレートします。
- キャビティの音響モードの1つがトランスデューサの公称周波数(ここでは31.2 kHz)に対応するようにタンクサイズを調整します。したがって、FRFには、 図3に示すように、この周波数に近い共振ピークが1つ含まれています。
- 図4に示すように、タンク内の圧力場をプロットします。選択された共振モードは、音響気泡が閉じ込められる容器の内側に少なくとも1つの圧力反節を含まなければならない。
- タンクを設計するときは、タンク面をしっかりと閉じるために、各端にガイド溝がある可動上面を設計します。タンクを液体媒体で満たすために、上面に小さな穴を開けます。
- 超音波トランスデューサ(ランジュバンタイプ、公称周波数31.2 kHz)を含む自家製フレームの上に水タンクを置きます。エコーゲルを使用して、トランスデューサーをタンク底壁に結合します。
- タンクとフレームシステムを、マイクロメトリックネジを使用して3方向変位テーブルの上に配置します。
- タンクにマイクロフィルター、脱塩、水(脱気なし、容量~500mL、酸素飽和度約8mg·L-1)。
注:脱気の代わりに脱気水を使用しないと、実験期間中安定した気泡を維持することができます。脱気水を使用すると、整流(超音波媒介)拡散によってわずかに相殺されても、ガス拡散による気泡収縮が加速します。
2. 気泡発生と音響校正
- レーザー誘起気泡核生成、音響励起、高速記録に使用する実験セットアップを準備します(図5a、b、c)。実験のセットアップは、(A)音響浮上システム、(B)レーザー電源と(C)レーザーヘッド、(D)1つの球面凹レンズ、(E)1つの平凹レンズと1つの非球面レンズ、(F)高速度カメラ、(G)連続発光ダイオードで構成されています。その後、液体の流れの測定(図5d)(H)1つの連続波レーザー光源、(I)円筒平凹レンズ、続いて第1レンズの後ろに挿入し直交軸に向けられた円筒平凹レンズを追加します。
- 超音波トランスデューサをファンクションジェネレータに接続します。励起信号を正弦波波形、連続波、周波数31.2kHzに設定します。振幅は唯一の可変パラメータです。
- レンズ(D)をレーザーヘッド(C)の約6cm前に配置します。
- レンズ(E)をレンズ(D)の約12cm前に配置します。
- レーザーの集束点が水タンクの内側に位置するように水タンク(A)を配置し、レーザーパルス(5-10 mJ)ごとに火花を発生させます。レーザースパークは、ターゲット圧力反節の約3 cm下に配置する必要があります。
注:超音波(US)がないと、浮力によりレーザー核気泡が上面に上昇します。 - 超音波トランスデューサの電源を入れます。気泡が垂直に上昇しなくなるまで印加電圧を上げますが、圧力の反節に向かって偏り、十分な高圧の場合は閉じ込められます。
- 閉じ込められた気泡を観察するために、バックライト付き照明(連続発光ダイオード)と高速度カメラを設定します。
注:レーザースパークで新しい気泡を核形成する場合、トラップ位置に近づく気泡の軌道を簡単にキャプチャできます。 - 水タンク内のレーザースパークの位置を移動して、気泡の軌道がカメラの焦点面内に留まるようにします。
- 1つのバブルをトラップし、次のパラメータを使用してその半径方向の振動をキャプチャします:フレームサイズ128 x 128ピクセル、取得レート180 kHz。2つの音響周期にわたる大振幅の半径方向振動の例を 図6に示します。典型的な気泡のサイズは30〜80μmの範囲です。
- 数百から数千の気泡振動をキャプチャするために、3〜30ミリ秒の間に気泡半径方向振動を記録します。この記録を繰り返して、トランスデューサーの印加電圧を上げます。標準的な印加電圧は0〜8Vの範囲です。
注意: 印加電圧を変更すると、閉じ込められた気泡の平衡位置がわずかに垂直に移動します。バックライト付き照明とカメラを動かさずに振動を追跡するには、システム(トランスデューサーと水タンク)をマイクロメトリック精度で3方向可動テーブルに配置します。 - 超音波トランスデューサのスイッチを入れ、後分析のために背景の画像を1つキャプチャします。
- 次の手順に従って、ビデオシリーズを後処理します。
- 実行可能ファイル VoltagePressure.exe を実行します。 図 7 に示すインターフェイスが開きます。
注: このスクリプトは補足ドキュメントとして入手できます。 - 左側の列に物理パラメータと実験パラメータを指定します(図7A)。
- 一連の記録の印加電圧の値を右下の表に指定します(図7B)。
- バブル半径分析パネルで、[パラメーターの読み込み](図7C)をクリックし、ビデオシリーズのすべてのファイルを含むフォルダーを選択してから、背景画像(必須)を選択します。
- すべてのビデオを一度に分析するか、[ 自動]をクリックして分析するか、[ ステップバイステップ]をクリックして1つずつ分析するかを選択できます。
- ビデオファイルごとに、バブル半径の進化が1つの音響周期にわたってプロットされ、数値フィットが重ね合わされます。赤い曲線は、線形化されたレイリー・プレセットモデリングに対応しています。平衡気泡半径が表示されます(図7D)。
- 数値フィッティングに従って、この電圧に適用される圧力が 圧力(電圧)グラフ パネルに表示されます(図7E)。加えられた圧力の値は、右下の表にも表示されます(図7B)。0〜8Vの電圧ダイナミクスに対応する典型的な印加圧力は0〜25kPaです。
- すべてのビデオが処理されたら、[線形回帰]ボタンをクリックして、圧力/電圧曲線の 線形 フィットを実行します。データ(電圧値と圧力値)は、現在のディレクトリにある.txtファイルに保存されます。はめあいの勾配が提供されます。
- 実行可能ファイル VoltagePressure.exe を実行します。 図 7 に示すインターフェイスが開きます。
3.合体技術
- 超音波トランスデューサの電源を入れます。図8に示すように、不安定ゾーンの数値圧力/半径 図に従って、対応する音圧が表面の不安定性のトリガーにつながるように、印加電圧を十分に高く設定します。
- 気泡を核形成すると、気泡はそのトラップ位置に移動します。閉じ込められた気泡が球形の振動のみを示す場合は、次の手順に進みます。非球面振動が現れた場合:
- 超音波電源をオフにして、気泡を上面に上昇させます。
- レーザーエネルギーを変更するか(数mJで微調整することにより)、トランスデューサ電圧を下げます。
- 超音波電源をオンにします。
- 新しいバブルを核形成します。
- 気泡サイズが純粋に球形の振動になるまで、この手順を繰り返します。
- 閉じ込められた気泡が球形の振動のみを示す場合、新しいレーザー火花を生成します。新しいバブルがトラップ位置に到達すると、合体が発生します。
- 合体気泡が球状振動のみを示す場合は、新しい気泡を生成します。非球面変形が発生する気泡半径に到達するには、複数の合体が必要になる場合があります。非球面振動につながる気泡合体の例を 図9に示します。
- 合体した気泡が非球面振動を示したら、気泡振動を約3〜30ミリ秒の期間記録します。
- 形状振動のモード数は 図10を参照して特定する。
4. 流体流量測定
- キャビテーションマイクロストリーミング測定の場合、気泡核形成の前に蛍光トレーサー粒子を水に添加する必要があります。この研究では、0.71μmの粒子を使用しています(材料表)。それらは、音響的に透明であり(音響放射力の影響を受けない)、流れに正確に追従するのに十分な大きさであり、レーザー光を散乱させるのに十分な大きさである。水タンクの容量には、約2.104 粒子/ mm 3に相当する3滴を使用します。
- 測定を行う前に、(高速タイムスケール)気泡ダイナミクスと(低タイムスケール)流体の流れの両方をキャプチャするために、次のパラメータを設定します。
- カメラ録画ディスクのパーティションを作成します。
- または、記録パラメータを次のように定義します。
- フレームレート180kHz、フレームサイズ128 x 128ピクセル、露光時間1μsでバブル界面のダイナミクスを1回記録
- フレームレート600Hz、フレームサイズ1024×768ピクセル、露光時間1msで色素トレーサーの動きを1回記録。
- 連続レーザーを使用してください。
- レーザービームを直交軸に向けられた円筒平凹レンズと円筒平凸レンズを連続して通過させることで、薄いレーザーシートを作成します。約160μmのビーム幅が得られます。
- イメージング面に対応するようにレーザーシートを設定します。
- レーザーシートを撮像面と平行に移動できるように、可動装置にレーザーをセットします。
- 照らされたパーティクルがカメラから見えるように位置を調整します。
- 気泡を核形成してトラップします。
- レーザーシートの位置をさらに調整して、バブルの後ろに影が見えるようにします。 これで、図 11 に示すように、バブルがレーザー シートの内側に配置されます。
- 安定して振動する形状モードが明らかになるまで気泡合体を誘導します。
- バブルダイナミクスとマイクロストリーミングを切り替えて、いくつかの録音を行います。
注意: 不要な場合は、連続レーザーの電源を切ってください。加熱は望ましくない対流を作り出す可能性があります。また、ストリーミングフローの測定を行うときは発光ダイオードをオフにしてください。
5. キャビテーションマイクロストリーミングパターンを可視化する画像処理
- 画像処理・解析用の可視化ソフトウェアImageJをJavaでインストールします。また、プラグインCINEファイルリーダーをインストールして、高速カメラファイルを開きます。
- ファイルをクリック |インポート |CineFile を選択し、パーティクル モーションのキャプチャを含むビデオ *.cine を選択します。
- 選択する 仮想スタックを使用する 新しいウィンドウで、ビデオがロードされます。
- ストリーミング パターンを表示せずにパーティクルの動きを観察するには、[ 画像] |調整 |明るさ/コントラスト |自動。暗い背景は、自動的に最適化された画像に置き換えられます。
- 結果のパターンを表示するには、画像|スタック |[Z プロジェクト]をクリックし、画像投影の[最大強度]オプションを選択します。スタック内のすべてのイメージの最大値を含むピクセルを含む出力イメージが表示されます。必要に応じて、手順 5.4 の説明に従って画像のコントラストを調整します。
メモ: 図 12b および 図 12d に示すようなストリーミングパターンが得られます。
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Representative Results
時間安定で対称的に制御された非球面振動につながる気泡合体の完全なシーケンスを 図9に示します。2つの球状に振動する気泡の接近相は、2つの気泡の間の薄い液体膜が破裂したときに終了します。合体前の最後の段階で、バブル界面が球形度から逸脱することは注目に値します。両方の気泡は、接近の直線運動の経路に沿って楕円体形状に伸びる。合体モーメントの後、単一の気泡が残り、いくつかの音響周期の間に複雑な形状の非球形振動を示します。これは、任意の動的システムの励起に続く振動の過渡領域に対応します。図 10の解釈から推測できるように、数十から100の音響周期の後、形状振動は定常状態の振動で安定します(ここではモード4の場合)。このモードは、数千の音響期間、数ミリ秒から数分間持続する場合があります。これにより、気泡誘起液体の流れの準同時測定が可能になります。
気泡がトラップされ、定常形状の振動を示すと、図11に示すように、気泡近傍の蛍光トレーサーの動きが捕捉されます。まず第一に、純粋に球形の振動を示す気泡の粒子運動がないことは、純粋な半径方向振動によって渦度が誘発されないことの証拠であるいくつかのキャビテーションマイクロストリーミングモデル31と一致している。形状振動が発生すると、図12に示すように、気泡界面付近で液体の動きが発生します。音響タイムスケールでの気泡界面のダイナミクス(図12a、c)とより低いタイムスケールでの粒子の運動(図12b、d)の代替記録により、マイクロストリーミングパターンを特定の形状モード番号に関連付けることができます。図12aは、モード3で主に振動している音圧Pa = 12.8 kPaで駆動される平均半径R0 = 70.5 μmの気泡の気泡ダイナミクスのスナップショットシリーズを示しています。関連するマイクロストリーミング パターン (図 12b 参照) は、6 つのローブで構成されています。形状モード振動とマイクロストリーミングパターンの間の対称軸の保存がはっきりと見えます。図12cは、モード4で主に振動している音圧Pa = 23.6 kPaで駆動される平均半径R0 = 55.7 μmの気泡のバブルダイナミクスのスナップショットシリーズを示しています。図12dの関連するマイクロストリーミングパターンは、バブル直径のサイズの8つの小さなローブで構成されています。ここでも、形状モード振動とマイクロストリーミングパターンの間の対称軸の保存がはっきりと見えます。これらの結果は、形状モードが高いほどマイクロストリーミングパターンが小さくなり、バブル近傍に閉じ込められていることを裏付けているようです。
高次モードのストリーミングパターンが狭くなるというこの仮定は、それほど明白ではなく、バブルインターフェイスダイナミクスのモーダルコンテンツに依存します。実際、気泡誘起の液体の流れは、同じ周波数で振動する2つの形状モード間の相互作用、またはモード自体との自己相互作用から生じることを思い出さなければなりません31。例えば、モード3を考えてみましょう、与えられた形状モードで主に振動する気泡は、モード29間の非線形結合を通して他の非球面振動を励起するかもしれません。バブルインターフェイスのダイナミクスに2番目と4番目のモードなどの補足モードが含まれている場合、特定のパターンを生成するモード間の複数の相互作用により、マイクロストリーミングフローが大幅に変更される可能性があります。これは、主にモード3で振動する2つの気泡について図13に示されており、2つの異なるマイクロストリーミングパターンを誘導します。図13a,b,cでは、モード3で振動する音圧Pa=12.4kPaで駆動される平衡半径R0 = 70.1μmの気泡がローブ型パターンを示している。界面ダイナミクスの分析(図13b)は、主要なモードが半径方向のモード(駆動周波数f0で振動)、並進モード(番号1のモード、駆動周波数f0の半分で振動)、3番目のモード(f 0/2で振動)、および比較的小さな第4および第6モード(両方ともf0で振動)であることがわかります).マイクロストリーミングフローへの主な寄与は、ラジアルモードとモード4および6との間の相互作用であり、ローブ型パターン31につながるという仮説を立てることができる。図13d,e,fでは、モード3で振動する音圧Pa=13.3kPaで駆動される平衡半径R0 = 68.6μmの気泡は、長距離の流れが伸びるクロスタイプのパターンを示しています。界面ダイナミクスの分析(図13d)は、主なモードが放射状のモード、並進モード(番号1のモード)、3番目と6番目のモードであることを示しています。モード3の高振幅によれば、マイクロストリーミングフローへの主な寄与はモード3の自己相互作用であり、クロスタイプパターン32につながるという仮説を立てることができる。
図 1.形状振動をトリガーする方法の説明図。 圧力/半径マップには、特定の次数のモードごとに1つの不安定ゾーンが含まれます。このゾーンに到達するための圧力しきい値は、(1)形状モードが現れるまで固定半径の気泡を駆動する適用音圧を増加させるか、(2)一定の適用音圧で気泡サイズを大きくすることによって超えることができます。このような気泡体積の増加は、整流拡散が起こるとゆっくりと起こり、気泡合体はプロセスを大幅に固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.バブル合体技術の図。 接近相(A)は、容器内の同じトラップ位置で互いに遭遇する2つの気泡をレーザー核形成することからなる。それらが出会うと、合体が起こります:気泡(B)の間の薄い液体膜の破裂は、単一の、最初に変形した気泡の生成につながります。この変形した気泡は、単色超音波場によって駆動され、定常状態領域に入る前に、最初は過渡振動(C)を示します。定常状態領域(D)では、合体気泡は時間安定で対称的に制御された形状振動を示します。蛍光ナノ粒子を培地に播種することにより、気泡誘起流体の流れが捕捉される(E)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.浮上システム内の圧力場の周波数応答関数。 音圧の振幅は、次の(x、y、z)座標に対応するタンク内の3つの場所について、周波数の関数として表示されます:(1)青、(2.05,2.05,6)cm、(2)赤、(0,0,1.28)cmおよび(3)黒(3.23,3.48,1.36)cmで、座標系の原点は立方体タンクの底面の中心にあります。31.5kHz付近では、共振モードがはっきりと見えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.浮上室内の音圧分布。 (A)選択した共振モードの立方体水タンク内の圧力場の3次元表現。このモードは、超音波源の周波数に対応する周波数31.2kHzで発生します。(B)タンクの対角面における音圧の分布。(C)水平面(高さz=一定)における音圧の分布。高度は、タンクの上部にある圧力反節の位置に対応するように選択されています。カラーバーの振幅は、探触子表面に1μmの垂直変位を課すことによって得られます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.実験セットアップの写真と概略図。 (A)音響浮上システム、(B-C)パルスレーザ増幅器及びレーザヘッド、(D-E)集束レンズセット、(F)高速度カメラ、(G)発光ダイオード、(H)連続波レーザ及び(I)整形レンズセットから構成される。(a)側面および(b)実験セットアップの上面図。(c)気泡振動を捕捉するために必要な材料の図。このプロセス中、連続レーザー(H)はオフになることに注意してください。(d)液体の流れを捉えるために必要な材料の図。なお、気泡核生成用のパルスレーザ(C)はオフに切り替わり、一方、微粒子トレーサーを照明するレーザシートを生成する連続レーザ(H)はオンである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.大振幅球面振動を示す超音波駆動気泡のスナップショットシリーズ。 気泡平衡半径は~60μm、駆動音圧は~15kPaです。連続する2つの画像間の時間間隔は5.6μsです。シリーズ全体は2つの音響周期に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.実行可能スクリプトPVR_Interface.exeのインターフェースパネル。 スクリプトは、(A)物理的パラメータを設定するためのパネル、(B)トランスデューサに印加される印加電圧を設定するためのテーブル、(C)後処理され、平衡気泡半径(D)および加えられた音圧(B)を提供する記録されたビデオのセット全体をロードする可能性を含むグラフィカルユーザーインターフェイスを起動します。 圧力/電圧関係(E)のプロット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 8.不安定ゾーンの圧力/半径図。 各色付きの領域は、特定の形状モードの不安定ゾーンに対応します:(青色の領域)モード2、(緑色の領域)モード3、および(赤色の領域)モード4。白い部分は、マイクロバブルが球状の振動のみを示す場合に相当する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 9.形状振動につながる気泡合体のスナップショットシリーズ。 2つの気泡の接近相の後、それらの間の薄膜が破裂し、合体が起こる。単一の気泡は、最初に過渡振動領域において、超音波場によって駆動される。いくつかの音響期間の後、定常状態レジームは軸対称形状モード、ここではモード4で確立されます。連続する2枚の写真の時間間隔は30μsです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 10.放射状モードを含む最初の5つの軸対称形状モード。 振動振幅の2つの極値で示した気泡界面の輪郭の側面図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 11.球状に振動するマイクロバブルの周りの蛍光トレーサー粒子。 どちらの画像も、0.25秒をカバーする100個のスナップショットの重ね合わせに対応しています。(a)形状振動がない場合、トレーサー粒子の運動は観測できません。(b)視野全体に見える寄生虫の平均流れは、例えば、レースシートの加熱のために現れる可能性があります。ただし、このフローはバブルの動きにリンクされていません。どちらの画像でも、バブルの後ろのレーザーシートによって誘発された影がはっきりと見えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 12.気泡ダイナミクスと誘起マイクロストリーミングの準同時記録。 左列:次数3(a)と誘導マイクロストリーミング(b)の形状モード振動を示す1つの気泡のスナップショットシリーズ。右列:次数4の形状モード振動を示す1つの気泡のスナップショットシリーズ(c)と誘導マイクロストリーミング(d)。すべての図について、赤い破線は、合体前の2つの接近気泡の直線運動によって決定される、気泡形状振動と液体の流れの両方の対称軸に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 13.主にモード3で振動する気泡によって誘発される2つのストリーミングパターンの例。 (a,d)バブル インターフェイスの図とスナップホット、(b、e) バブル インターフェイスのモード分割、および (c、f) 関連するストリーミング パターン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示された手順は、定常状態の対称制御された気泡形状振動をトリガーするために気泡合体を使用することで構成され、これらの振動によって引き起こされる長期的な流体の流れの研究を可能にします。この技術の主な課題は、境界から遠く離れた気泡が閉じ込められている場合の非球面振動の制御です。
文献で提案されている既存の技術のほとんどは、気泡中心の動きがないため、音響タイムスケール(最大数百kHz)での界面の捕捉が容易になるため、基板に取り付けられた気泡7、16に焦点を当てていました。この場合、形状モードをトリガーするために必要な圧力しきい値を超えることは簡単な作業ですが、基板によって誘発される対称性の破れにより、形状振動の制御が複雑になります。壁に取り付けられた気泡は、特定の接触角で基板に接触しており、非対称表面モード21のトリガーにつながる。単一のカメラビューのみで3次元の非対称モードを解釈する複雑さに加えて、カオス表面振動レジームへの突然の移行が発生します33。したがって、主な課題は、軸対称の非球面振動を得るために、境界から遠く離れた単一のトラップされた気泡の形状振動をキャプチャすることにあります。このような条件により、実験と文献で入手可能な多種多様な分析研究との比較が可能になります。実験上の主な困難は、マイクロバブルの位置安定性にあります。この問題を克服するために、気泡トラップ34を制御するために光ピンセットが使用され、気泡振動をトラップおよび駆動するために振幅変調超音波場が使用されてきた29。どちらの場合も、1 つのバブルがトラップされ、非球面モードがトリガーされます。また、振幅変調駆動場の場合、形状モードは周期的に開始および消失するため、短時間しか存在しません。また、気泡形状振動の向きが制御されず、界面運動の解析に偏りが生じます。
我々が提案する代替案は、パルスレーザーを使用して単一の気泡を核形成し、後に共鳴浮上室の圧力反節に閉じ込めることである。時間の経過とともに連続する気泡を核形成することにより、各有核気泡は、すでに別の気泡によって占められているトラップ位置に向かって移動します。合体が発生し、最初に変形した気泡界面を誘導します。駆動圧力が十分に強い場合、形状振動は持続する。レーザー核生成は、高速で信頼性の高い気泡生成を可能にするため、電気分解などの他の核生成技術よりも好まれてきました。 図9に示すように、形状振動の対称軸は、合体前の気泡接近軸によって与えられる。ただし、この主要な結果は、合体の接近段階で気泡がカメラの焦点面内に留まる必要があるため(この平面に対称軸を向けるために)、実験セットアップの設定に比較的長い時間を必要とします。そのために、気泡が移動して互いに遭遇する経路を最適化するために、気泡核形成部位のわずかな変更が行われます。気泡核生成部位への変化は、レーザー経路に対してタンク位置を微細に修正する必要があり、マイクロメトリック精度の3方向ステージで行われます。さらに、有核気泡サイズを最適化するために、レーザーエネルギーの微調整が行われる。気泡が大きすぎると、モード数の多い形状モードがすぐに生成され、体積気泡共振に近づきます。これは、バブル中心の高い位置不安定性をもたらす。気泡が小さすぎると、形状モードをトリガーするのに適切なサイズに達するまでに、多数の合体プロセスが必要になります。
提案された技術の主な利点は、対称制御された形状振動のための定常状態レジームの確立です。界面運動は比較的長い時間(数秒から数分)持続するため、実験セットアップを液体媒体に播種された蛍光ナノ粒子の追跡に切り替えることで、気泡誘起流体の流れを捉えることができます。無限液体中の気泡によって誘発されるマイクロストリーミングの実験的研究は、これまでのところ文献に存在しないことは注目に値する。また、基板付着気泡についてキャビテーションマイクロストリーミングを調べる場合でも、気泡ダイナミクスとの関連を考慮せずに定性的な観察に限定して解析を行う16。粒子運動の測定は、連続波レーザーによって提供される薄いレーザーシートで行われます。(i)パルスレーザによるレーザ核生成、(ii)レーザシートによる粒子追跡、(iii)高速度カメラによる記録を準同時に行う必要があるため、水槽周辺の物質の閉塞の可能性に特に注意が必要である。これにより、 図5に示すように、デバイスの配置に多くの制限があるコンパクトなセットアップになります。形状振動気泡によって誘発されるマイクロストリーミングパターンをキャプチャする場合、ステップ4.2で述べたように、気泡界面ダイナミクスを代わりに追跡する必要があります。実際、気泡ダイナミクスと流体の流れの視覚化の代替シーケンスを切り替えることで、マイクロストリーミングパターンを特定の形状振動に安全に関連付けることができます。この代替手順は、(i)形状振動がオフになる可能性がある、(ii)気泡の安定性が急激に増加して気泡の位置が不安定になる可能性がある、(iii)大きな変形が発生すると気泡が破片になる可能性があるため、必須です。これらのイベントがまれであっても、マイクロストリーミングパターンを撮影する前と後の両方で記録することにより、バブルダイナミクスが同じままであることを確認することが重要です。(このようにして、バブルの動きとパターンが実際に相関していることを保証できます)。
図12に示すように、特定のモード番号で主に振動するバブルが特定のマイクロストリーミングパターンにつながることが証明されていますか?パターンは一意であり、インターフェースモーションのモーダルコンテンツに依存します。図13に示すように、同じ優勢モード数は、励起される二次モードの数、振幅、および位相に応じて、大距離または短距離の渦を誘発する可能性があります。
これらの観察は、例えば、標的および局所超音波媒介薬物送達などの医療用途において実用的であり得る。気泡は、細胞間のタイトジャンクション、さらには細胞膜自体を透過させるためのベクターとして作用することが知られており、ソノポレーション1につながる。この現象は、安定に振動するマイクロバブルの場合、マイクロストリーミングフローの発生を通じて、気泡振動によって誘起されるせん断応力またはせん断応力勾配35によって誘起され得る。マイクロストリーミングは非線形の2次現象であることを思い出してください。最初に、観察されたストリーミングパターンを、より小さなサイズ(~3μm半径)の治療的シェルマイクロバブルで得られたパターンにスケーリングすることは容易ではありません。1桁のサイズ差の自由気泡または被覆気泡の非球面ダイナミクスがどのようにスケーリングされるかをすでに証明しました:与えられたモードnの固有周波数ωnは、25として気泡サイズに関連しています。Dolletら27では、1.7MHzで励起されたコーティングされたマイクロメトリック気泡について、我々の実験で観測された形状モード数と同様に、次数4の形状モードが捕捉されている。また、超音波造影剤マイクロバブル27上の形状モードをトリガするには最大200kPaの圧力が必要となるため、印加圧力は大きく異なる。提案されたセットアップでは、最大印加圧力は25kPaを超えません。加えられた圧力の大きな差は、形状モードが特定の圧力しきい値を超えて現れるため、表面の不安定性のトリガーに起因します。Dolletら27で与えられた1.7MHzでの実験条件では、形状不安定性につながる圧力閾値はモード436で約150kPaであることが示されています。30kHzの駆動周波数の場合、10kPaの駆動場振幅のみで、~50μmの気泡の形状不安定性をトリガーできます。トリガーされると、形状の不安定性は数回の音響サイクル後に発生し、モード振幅のプラトー飽和を示します。振幅飽和は、自由気泡24、29および被覆気泡27の両方について観察された。これは、ラジアルモード振幅27,37の25〜50%ほどの形状振動で、自由気泡またはコーティング気泡の定常状態形状振動に達する可能性を示しています。実験的アプローチを使用して、図13に示すように、構成内の極端な形状変形(ここで、
nは形状モードの振幅)に到達します。
要約すると、提案された実験セットアップは、ほぼ1桁の大きさで変化するサイズであっても、マイクロバブルの非球面振動の主な特徴をスケーリングすることを可能にする。マイクロストリーミング流れに関しては、流速のスケーリングは、横方向と半径方向の両方の振動を示す気泡7、または自己相互作用する非球面モード32を調べることができます。どちらの場合も、ストリーミング速度はv~ωR0 a ia jとしてスケーリングされ、ここでi、jはバブル半径で正規化された考慮されたモード振幅を示します。非球面膨張パラメータaiの類似値に対して、ωR0~Constantのとき同一の流入速度が得られる。我々の実験条件を治療用殻付きマイクロバブル27に用いた条件と比較すると、流入速度の理論的予測は係数2.5とのみ異なる。粒子追跡速度測定による流入速度の測定により、ここで提示されたセットアップでは1mm / sの速度の大きさが推定されました。この値は、超音波造影剤19によって誘発されるマイクロストリーミングを調査するときに得られるものと同様である。流入パターンの空間構成に関しては、気泡界面周辺の流れ渦の角度分布は気泡半径31とは無関係である。ストリーミング フィールドの半径方向の拡張のみが、バブル サイズの変更の影響を受けます。この動径展開は、 としてスケーリングされます
。 ここで、 は調査されたモード数にリンクされた係数です。動径方向の膨張が気泡半径R0によって支配されるため、ストリーミングパターンの全体的な形状が保存されていることは明らかです。ただし、図13に示すように、同じ形状モード数を考慮しても、ストリーミングパターンは大きく異なる場合があります。図13は、バブル界面ダイナミクスがストリーミングパターン、特に速度場の空間変化率に大きな影響を与えることを強調しています。せん断応力の空間分布、またはせん断応力勾配は、ソノポレーション効率35の適切な指標として示されている。我々が提案する実験セットアップでは、この段階ではバルク流体のせん断応力のみを評価できます。壁のせん断応力をさらに拡張するには、気泡の近くに近くのサーフェスを追加する必要があります。気泡近傍の表面は、定在波場を局所的に変化させることで気泡の位置安定性を乱すことが予測可能である。壁から近い距離で気泡の安定性を確保することは依然として課題であり、気泡-壁間距離と同じ波長の気泡トラップ専用の二次超音波フィールドを追加することで部分的に解決できる可能性があります。このような二周波音響浮上チャンバは、気泡対のダイナミクスおよび相互作用力を調査するために既に設計されていた38。残念ながら、ここで調査した気泡と生体細胞(典型的な半径~10μm)のサイズ差が大きいため、この実験装置を直接生物学的研究に使用することは不可能です。しかし、我々の実験結果と気泡誘起マイクロストリーミングに関する最新の理論的発展を組み合わせることで、このようなモデリングの改善に役立つだけでなく、気泡誘起せん断応力や細胞膜近傍のせん断応力勾配の理論的予測に自信が持てるようになると期待しています。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、リヨン大学のLabEx CeLyA(ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspherical lens | Thorlabs | AL4050 | Lens of focus 40 mm |
| Continuous wave laser source | CNI | MLL6FN | DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW |
| Cylindrical plano-concave lens | Thorlabs | LJ1277L1-A | lens of focus -25?4mm |
| Cylindrical plano-concave lens | Thorlabs | LK1900L1 | lens of focus 250 mm |
| Fluorescent particles | Duke Scientific | R700 | Red polymer fluorescent microspheres |
| Function generator | Agilent | HP33120 | Generator of function feeding the ultrasound transducer |
| High-speed camera | Vision Research | Phantom v12.0 | High-speed recording up to 1 Mfps |
| Liquid medium | Carlo Erba | Water for analysis | Demineralized, undegassed water |
| Multiphysics software | Comsol | None | Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber |
| Nd:Yag pulsed laser | New Wave Research | Solo III-15 | 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ |
| Plano-concave lens | Thorlabs | N-BK7 | lens of focus 125 mm |
| Spherical concave lens | Thorlabs | N-SF11 | Bi-concave lens of focus -25mm |
| Ultrasound transducer | SinapTec | Custom-made | Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter |
| Visualization software | NIH | ImageJ | Software for image processing and analysis in Java |
| XY Linear stage | Newport | M-406 | Displacement stage with micrometric screw |
| Z-axis linear stage | Edmund Optics | 62-299 | Vertical displacement stage with micrometric screw |
References
- Roovers, S., et al. The role of ultrasound-driven microbubble dynamics in drug delivery: from microbubble fundamentals to clinical translation. Langmuir. 35 (31), 10173-10191 (2019).
- Liu, H. L., Fan, C. H., Ting, C. Y., Yeh, C. K. Combining microbubbles and ultrasound for drug delivery to brain tumors: current progress and overview. Theranostics. 4 (4), 432-444 (2014).
- Lammertink, B. H. A., et al. Sonochemotherapy: from bench to bedside. Frontiers in Pharmacology. 6, 138 (2015).
- Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10, 011501 (2016).
- Van Wamel, A., Bouakaz, A., Versluis, M., de Jong, N. Micromanipulation of endothelial cells: ultrasound-microbubble-cell interaction. Ultrasound in Medicine and Biology. 30, 1255-1258 (2004).
- Tran, T. A., Roger, S., Le Guennec, J. Y., Tranquart, F., Bouakaz, A. Effect of ultrasound-activated microbubbles on the cell electrophysiological properties. Ultrasound in Medicine and Biology. 33, 158-163 (2007).
- Marmottant, P., Hilgenfeldt, S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature. 423 (6936), 153-156 (2003).
- Prentice, P. A., Cuschieri, K., Dholakia, K., Prausnitz, M., Campbell, P. Membrane disruption by optically controlled microbubble cavitation. Nature Physics. 1, 107-110 (2005).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophysical Journal. 96, 4866-4876 (2009).
- Novell, A., et al. A new safety index based on intrapulse monitoring of ultra-harmonic cavitation during ultrasound-induced blood-brain barrier opening procedures. Scientific Reports. 10, 10088 (2020).
- Cornu, C., et al. Ultrafast monitoring and control of subharmonic emissions of an unseeded bubble cloud during pulsed sonication. Ultrasonics Sonochemistry. 42, 697-703 (2018).
- Reslan, L., Mestas, J. L., Herveau, S., Béra, J. C., Dumontet, C. Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation. Journal of Controlled Release. 142 (2), 251-258 (2010).
- Reuter, F., Gonzalez-Avila, S. R., Mettin, R., Ohl, C. D. Flow fields and vortex dynamics of bubbles collapsing near a solid boundary. Physical Review Fluids. 2, 064202 (2017).
- Chew, L. W., Klaseboer, E., Ohl, S. W., Khoo, B. C. Interaction of two differently sized oscillating bubbles in a free field. Physical Review E. 84, 066307 (2011).
- Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
- Tho, P., Manasseh, R., Ooi, A. Cavitation microstreaming patterns in single and multiple bubble systems. Journal of Fluid Mechanics. 576, 191-233 (2007).
- Van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. Journal of Controlled Release. 112, 149-155 (2006).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. PNAS. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterization of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12, 034109 (2018).
- Shklyaev, S., Straube, A. V. Linear oscillations of a compressible hemispherical bubble on a solid substrate. Physics of Fluids. 20, 052102 (2008).
- Fauconnier, M., Bera, J. C., Inserra, C. Nonspherical modes non-degeneracy of a tethered bubble. Physical Review E. 102, 033108 (2020).
- Xi, X., Cegla, F., Mettin, R., Holsteyns, F., Lippert, A. Study of non-spherical bubble oscillations near a surface in a weak acoustic standing wave field. The Journal of the Acoustical Society of America. 135, 1731 (2014).
- Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Effect of a distant rigid wall on microstreaming generated by an acoustically driven gas bubble. Journal of Fluid Mechanics. 742, 425-445 (2014).
- Cleve, S., Guédra, M., Inserra, C., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Surface modes with controlled axisymmetry triggered by bubble coalescence in a high-amplitude acoustic field. Physical Review E. 98, 033115 (2018).
- Lamb, H. Hydrodynamics. 6th ed. , University Press. Cambridge. (1932).
- Liu, Y., Wang, Q. Stability and natural frequency of nonspherical mode of an encapsulated microbubble in a viscous liquid. Physics of Fluids. 28, 062102 (2016).
- Dollet, B., et al. Nonspherical oscillations of ultrasound contrast agent microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (9), 1465-1473 (2008).
- Versluis, M., et al. Microbubble shape oscillations excited through ultrasonic parametric driving. Physical Review E. 82, 026321 (2010).
- Guédra, M., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Dynamics of nonspherical microbubble oscillations above instability threshold. Physical Review E. 96, 063104 (2017).
- Cleve, S., Guédra, M., Mauger, C., Inserra, C., Blanc-Benon, P. Microstreaming induced by acoustically trapped, non-spherically oscillating microbubbles. Journal of Fluid Mechanics. 875, 597-621 (2019).
- Doinikov, A. A., Cleve, S., Regnault, G., Mauger, C., Inserra, C. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. I. Case of modes 0 and m. Physical Review E. 100, 033104 (2019).
- Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Doinikov, A. A. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. III. Case of self-interacting modes n-n. Physical Review E. 101, 013111 (2020).
- Prabowo, F., Ohl, C. D. Surface oscillations and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrasonics Sonochemistry. 18 (1), 431-435 (2011).
- Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined; optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90, 114103 (2007).
- Collis, J., et al. Cavitation microstreaming and stress fields created by microbubbles. Ultrasonics. 50, 273-279 (2010).
- Loughran, J., Eckersley, R. J., Tang, M. X. Modeling non-spherical oscillations and stability of acoustically driven shelled microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4349-4357 (2012).
- Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall - a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
- Regnault, G., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Secondary radiation force between two closely spaced acoustic bubbles. Physical Review E. 102, 031101 (2020).
