Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Induktion af mikrostreaming ved ikke-sfæriske bobleoscillationer i et akustisk levitationssystem

Published: May 9, 2021 doi: 10.3791/62044
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Univ Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Centre Léon Bérard, INSERM, UMR 1032, LabTAU, France, 2Univ Lyon, Ecole Centrale de Lyon, INSA de Lyon, CNRS, LMFA UMR 5509, France

Summary

En hurtig og pålidelig teknik foreslås til at kontrollere formsvingningerne af en enkelt, fanget akustisk boble, der er baseret på koalescensteknik mellem to bobler. De symmetristyrede bobleformsvingninger i steady-state tillader analyse af væskestrømmen, der genereres i nærheden af boblegrænsefladen.

Abstract

Når de er placeret nær biologiske barrierer, kan oscillerende mikrobobler øge cellemembranpermeabiliteten, hvilket muliggør internalisering af lægemidler og gener. Eksperimentelle observationer tyder på, at den midlertidige permeabilisering af disse barrierer kan skyldes forskydningsspænding, der udøves på cellevæv ved kavitationsmikrostreaming. Kavitation mikrostreaming er generering af hvirvelstrømme, der opstår omkring oscillerende ultralydmikrobobler. For at producere sådanne væskestrømme skal boblesvingninger afvige fra rent sfæriske svingninger og omfatte enten en translationel ustabilitet eller formtilstande. Eksperimentelle undersøgelser af bobleinducerede strømme og forskydningsspænding på nærliggende overflader er ofte begrænsede i deres omfang på grund af vanskeligheden ved at fange formdeformationer af mikrobobler på en stabil og kontrollerbar måde. Vi beskriver designet af et akustisk levitationskammer til undersøgelse af symmetristyrede ikke-sfæriske svingninger. En sådan kontrol udføres ved anvendelse af en koalescensteknik mellem to nærliggende bobler i et tilstrækkeligt intenst ultralydfelt. Kontrollen af ikke-sfæriske svingninger åbner vejen for en kontrolleret kavitationsmikrostreaming af en fri overfladeoscillerende mikroboble. Kameraer med høj billedhastighed gør det muligt at undersøge næsten samtidig den ikke-sfæriske bobledynamik på den akustiske tidsskala og væskestrømmen på en lavere tidsskala. Det er vist, at der kan opnås en lang række væskemønstre, og at de er korreleret med boblegrænsefladens modale indhold. Vi demonstrerer, at selv de højordens formtilstande kan skabe væskemønstre med stor afstand, hvis grænsefladedynamikken indeholder flere tilstande, hvilket fremhæver potentialet for ikke-sfæriske svingninger til målrettet og lokaliseret lægemiddelafgivelse.

Introduction

I medicin skal et administreret lægemiddel trænge igennem mange forhindringer i det levende system, inden de når de ønskede mål. Imidlertid rengøres de fleste lægemidler hurtigt væk fra blodstrømmen. Målretningseffektiviteten er lav, og de kan ikke let krydse cellemembraner, hvilket fører til ineffektiv lægemiddelafgivelse. I øjeblikket er brugen af mikrobobler i kombination med ultralyd blevet foreslået som en innovativ metode til ikke-invasiv, præcis og målrettet levering af lægemidler og gener til patologiske væv og celler1. I denne tilgang kan mikrobobler spille en rolle som bærere, hvor gratis lægemidler enten injiceres sammen med en gasboblesuspension eller belastes på overfladen. Mikrobobler kan også fungere som en lokal vektor til refokusering af ultralydsenergien for at interagere med cellerne. Dybest set, under ultralydseksponering, komprimerer og udvider bobler stabilt, et regime kaldet stabil kavitation, der genererer væskestrømme og dermed forskydningsspænding på nærliggende genstande. Mikrobobler kan også svinge ikke-lineært og ekspandere indtil sammenbrud i regimet med inertikavitation, der producerer chokbølger, der formerer sig radialt fra sammenbrudsstedet2. Det har vist sig, at kavitation, enten stabil eller inerti, forbedrer permeabiliseringen af cellemembraner og dermed forbedrer internaliseringen af lægemidler i cellen3.

I terapeutiske anvendelser er det meget vigtigt at forstå mekanismen for boble-celle-interaktionen, men der er flere barrierer, både fra videnskabelige og tekniske sider, der forhindrer vores viden i at komme videre. For det første er det meget vanskeligt at fange cellernes dynamik som reaktion på bobleinducerede mekaniske stimuli4. På den akustiske tidsskala kan førsteordens mikroboblesvingninger føre til aktivering af membrankanaler, hvilket letter molekylær passage på tværs af biologiske grænseflader. Dette sker gennem direkte svingning af cellemembranen, også kaldet "cellulær massage"5. Kanalaktivering efter direkte mekanisk belastning blev påvist ved hjælp af patch-clamp-teknikker, der målte elektrofysiologiske egenskaber af cellemembraner under og efter ultralydseksponering6. Måling af bobleinduceret celledynamik (hvilket betyder det komplette deformationsfelt af cellemembranen) på den akustiske tidsskala ville også give indsigt i tærsklen for membranarealudvidelse Δ A/ A, der kræves for at inducere porer i cellemembranen7. Den anden barriere er at kontrollere det kollapsende bobleregime for at undgå mikroboble-induceret cellelyse. Boblekollaps og inducerede mikrojets er blevet identificeret som en mekanisme, hvorigennem membranperforering forekommer 8,9. Når den er permeabiliseret, repareres cellemembranen gennem calciumforsegling af lipiddobbeltlagene og fusion af intracellulære vesikler9. Forekomsten af boblekollapser kan også forårsage dødelige skader på cellen og fremkalde unødvendige bivirkninger i de omkringliggende. I følsomme applikationer såsom ultralydmedieret blod-hjerne-barriereåbning er det generelt accepteret, at inertiboblekollaps bør undgås10.

Derfor er der i øjeblikket en enorm indsats for design af ultralydemissionssekvenser kombineret med passiv kavitationsovervågning og kontrol for at sikre stabile svingninger af mikrobobler11. I dette stabile regime er det blevet antaget, at stabilt oscillerende bobler spiller en stærk rolle i udløsningen af membranpermeabilisering ved at fremme rumligt målrettet forskydningsspænding på cellemembranen7. Forskydningsspændingen skyldes væskestrømmene, der skabes i nærheden af de oscillerende bobler. Disse væskestrømme kaldes kavitationsmikrostreaming, og som nævnt ovenfor er de en af de mange mulige mekanismer, der er ansvarlige for forbedret optagelse af ekstracellulære molekyler. Når man beskæftiger sig med suspension af bobler eller celler, såsom in vitro biologiske transfektionsassays12, kan permeabilisering ved mikrostreaming være meget mere effektiv end permeabilisering ved boblekollaps. Dette kan vises ved en simpel geometrisk overvejelse. I cellesuspensioner vil sonoporation være effektiv, hvis størstedelen af de suspenderede celler udsættes for tilstrækkeligt store mekaniske virkninger (hvilket fører til membranpermeabilisering). Det er kendt, at boblekollapser er rettet langs retningen af isotrop symmetribrud, såsom boblevægsaksen13 eller bobleboblen og boblecellelinjen, der forbinder deres massecenter14. Den producerede mikrojet er derfor et rumligt lokaliseret fænomen langs et begrænset antal linjer, der forbinder celle- og boblecentrene. Afhængigt af celle- og boblekoncentrationen samt boblecelleafstanden er denne effekt muligvis ikke den mest effektive til at permeabilisere hele antallet af suspenderede celler. I modsætning hertil er kavitationsmikrostreaming et fænomen, der forekommer på en langsom tidsskala med en stor rumlig udvidelse i forhold til bobleradius. Væskestrømmen fordeles også rundt om boblen og kan derfor påvirke et større antal celler på meget lang afstand. Derfor er forståelse af den genererede kavitationsmikrostreaming omkring en oscillerende boble en forudsætning for at kontrollere og kvantificere den bobleinducerede forskydningsspænding, der påføres celler.

For at gøre dette består et indledende trin i at kontrollere de sfæriske og ikke-sfæriske svingninger i en ultralyddrevet boble, da de genererede væskestrømme induceres af bevægelsen af boblegrænsefladen15,16. Især formsvingninger af mikrobobler skal udløses og holdes stabile. Desuden skal orienteringen af bobleformsvingningerne kontrolleres for korrekt at analysere sammenhængen mellem boblegrænsefladedynamikken og det inducerede mikrostreamingmønster. Når man opsummerer den eksisterende litteratur, er det indlysende, at detaljerede eksperimentelle resultater af kavitationsinduceret mikrostreaming kun er tilgængelige for bobler fastgjort til en overflade. Vægbundne mikrobobler bruges almindeligvis til vurdering af nøjagtig grænsefladedynamik og celleinteraktioner på mikrometerskala under et ultrahurtigt mikroskopisystem. Denne konfiguration er terapeutisk relevant, når man overvejer vibrerende mikrobobler placeret på cellemembranen17,18,19. Undersøgelsen af substratbundet boble kan dog gøre analysen af bobledynamik mere kompliceret, dels på grund af den komplekse karakter af kontaktlinjedynamik20 og udløsningen af asymmetriske formtilstande21. I medicinske og biologiske applikationer findes bobler, der ikke er fastgjort til en væg, almindeligvis i begrænsede geometrier såsom små kar. Dette påvirker bobledynamikken betydeligt og former ustabiliteten. Især tilstedeværelsen af en nærliggende væg forskyder tryktærsklen for formtilstand, der udløser til lavere trykværdier afhængigt af formtilstandsnummeret og boblestørrelsen22. Væggen påvirker også den bobleinducerede mikrostreaming med muligvis højere intensitet for det producerede flow23.

Blandt alle de mulige scenarier, som mikrobobler kan opleve (fri eller fastgjort, tæt på en væg, kollapsende eller stabilt svingende), foreslår vi at undersøge den ikke-sfæriske dynamik i en enkelt boble langt fra enhver grænse. Den eksperimentelle opsætning er baseret på et akustisk levitationssystem24, hvor en stående ultralydbølge bruges til at fange boblen. Dette scenario er i overensstemmelse med medicinske anvendelser, hvor en samling suspenderede bobler og celler sameksisterer i et sonotransfektionskammer, for eksempel. For så vidt bobler og celler ikke er for tætte, antages det, at tilstedeværelsen af en celle ikke påvirker boblegrænsefladedynamikken. Når celler følger de loop-lignende baner af kavitationsinduceret mikrostreaming, nærmer de sig cyklisk og frastøder fra boblens placering, og vi kan antage, at celletilstedeværelsen hverken påvirker strømningsmønsteret eller dets middelhastighed. Derudover er ikke-sfærisk dynamik og induceret mikrostreaming fra enkeltbobler langt fra grænsen velkendte fra et teoretisk synspunkt. For at forbinde den bobleinducerede væskestrøm til boblekonturdynamikken er det nødvendigt at karakterisere boblegrænsefladedynamikken nøjagtigt. For at gøre dette foretrækkes det at tilpasse den rumlige tidsmæssige skala i eksperimentelle undersøgelser med hensyn til dem, der anvendes i terapi, således at erhvervelse med almindelige højhastighedskameraer (under 1 million billeder / sekund) er mulig ved hjælp af store bobler exciteret ved lavere frekvenser. Når ubelagte bobler overvejes, er egenfrekvensen ω n for en given modus n relateret til boblestørrelsen som Equation 125. Dette radius-egenfrekvensforhold ændres en smule, når man overvejer afskallede bobler26, men størrelsesordenen af egenfrekvensen ωn forbliver den samme. Undersøgelse af bobler med ligevægtsradier ~ 50 μm i et 30 kHz ultralydfelt svarer således til at studere coatede bobler af radier ~ 3 μm i et 1,7 MHz felt, som foreslået af Dollet et al.27. Lignende formtilstandstal og dermed mikrostreamingmønstre forventes derfor.

For at udløse ikke-sfæriske svingninger i boblegrænsefladen er det nødvendigt at overskride en bestemt tryktærskel, der er radiusafhængig, som vist i figur 1. Eksisterende eksperimentelle teknikker er afhængige af stigningen i det akustiske tryk for at udløse overfladetilstande (illustreret ved sti (1) i figur 1), enten ved trinvis trykforøgelse28 eller ved excitation med moduleret amplitude, der er ansvarlig for periodisk begyndelse og udryddelse af overfladetilstande29. De største ulemper ved disse teknikker er (i) en tilfældig orientering af symmetriaksen for overfladesvingningerne, der ikke kan kontrolleres til at være i billedplanet, (ii) en kort levetid for bobleformsvingningerne, der gør analysen af de inducerede væskestrømme vanskelig ved større tidsskalaer, og (iii) den hyppige udløsning af ustabile formtilstande. Vi foreslår en alternativ teknik til at krydse trykgrænsen ved et konstant akustisk tryk i radius/trykkortet, som illustreret af stien (2) i figur 1. For at gøre dette er det nødvendigt at øge boblestørrelsen, så den vil være i ustabilitetszonen. En sådan stigning udføres ved hjælp af en boblekoalescensteknik. Sammensmeltningen af to, oprindeligt sfærisk oscillerende mikrobobler udnyttes til at skabe en enkelt deformeret boble. Hvis det akustiske tryk og boblestørrelsen af den sammensmeltede boble er i ustabilitetszonen, udløses overfladetilstande. Vi viste også, at koalescensteknikken inducerer stabile formsvingninger i et steady-state-regime såvel som en kontrolleret symmetriakse defineret af den retlinede bevægelse af de to nærliggende bobler. Fordi en stabil formsvingning sikres over minutter, er analysen af bobleinduceret væskestrøm mulig ved såning af det flydende medium med fluorescerende mikropartikler, oplyst af et tyndt laserark. Registrering af bevægelsen af de faste mikropartikler i nærheden af boblegrænsefladen gør det muligt at identificere mønsteret for den inducerede væskestrøm30. Det overordnede princip for udløsning af bobleformsvingninger, der fører til en tidsstabil væskestrøm, er illustreret i figur 2.

I den følgende protokol skitserer vi de trin, der kræves for at skabe stabile bobleformsvingninger via koalescensteknikken og beskriver målingerne af væskestrømmen. Dette omfatter design af det akustiske levitationssystem, akustisk kalibrering, boblenukleation og koalescensteknikken, måling af boblegrænsefladedynamik og omgivende væskestrøm og billedbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design af det akustiske levitationskammer

  1. Design en optisk gennemsigtig (PMMA-lignende) kubisk tank (8 cm kant og 2,8 mm tykkelse pr. Flade) med geometrimodulet i en multifysiksimuleringssoftware (materialetabel).
  2. Indsæt en cylindrisk overflade (Ø = 35 mm) centreret i bunden af tanken for at modellere ultralydstransduceren.
  3. Indstil grænsebetingelserne til nultryk på hver væg med en normal forskydning på amplitude 1 μm ved transduceroverfladen.
  4. Brug et frekvensdomænemodul til at simulere tankens frekvensresponsfunktion (FRF) i frekvensområdet [10 - 40] kHz på de tre vilkårlige steder loc1 = (0,01375, 0,01375, 0,04125), loc2 = (0, 0, 0,0088) og loc3 = (0,021725, 0,023375, 0,00935).
  5. Tilpas tankstørrelsen, så en af hulrummets akustiske tilstande svarer til transducerens nominelle frekvens (her 31,2 kHz). FRF indeholder derfor en resonanstop, der ligger tæt på denne frekvens, som illustreret i figur 3.
  6. Trykfeltet plottes inde i tanken, som vist i figur 4. Den valgte resonanstilstand skal indeholde mindst en trykantinode i beholderens indre, hvorpå den akustiske boble vil blive fanget.
  7. Når du designer tanken, skal du designe en bevægelig overflade med en styrende rille på hver kant for tæt at lukke tankfladerne. Bor et lille hul på oversiden for at fylde tanken med det flydende medium.
  8. Placer vandtanken oven på en hjemmelavet ramme, der indeholder ultralydstransduceren (Langevin-type, 31,2 kHz nominel frekvens). Brug ekkografisk gel til at koble transduceren til tankens bundvæg.
  9. Placer tanken og rammesystemet oven på et forskydningsbord i tre retninger med mikrometriske skruer.
  10. Fyld tanken med mikrofiltreret, demineraliseret og vand (ikke afgasset, volumen ~ 500 ml, iltmætning på ca. 8 mg · L-1).
    BEMÆRK: Brug af ikke afgasset vand i stedet for afgasset gør det muligt at opretholde stabile bobler i forsøgets varighed. Brug af afgasset vand vil fremskynde boblekrympning på grund af gasdiffusion, selvom det er lidt opvejet af korrigeret (ultralydmedieret) diffusion.

2. Boblegenerering og akustisk kalibrering

  1. Forbered den eksperimentelle opsætning, der anvendes til laserinduceret boblekernedannelse, akustisk excitation og højhastighedsoptagelse (figur 5a, b, c). Den eksperimentelle opsætning består af (A) det akustiske levitationssystem, (B) laserstrømforsyningen og (C) laserhovedet, (D) en sfærisk konkav linse, (E) en plano-konkav linse og en asfærisk linse, (F) højhastighedskameraet, (G) den kontinuerlige lysemitterende diode. Senere tilføjes en kontinuerlig bølgelaserkilde, (I) en cylindrisk plano-konkav linse efterfulgt af en cylindrisk plano-konkav linse indsat bag den første linse og orienteret på den ortogonale akse til måling af væskestrømme (figur 5d) (H).
  2. Sæt ultralydstransduceren til en funktionsgenerator. Indstil excitationssignalet som: sinusformet bølgeform, kontinuerlig bølge, frekvens 31, 2 kHz. Amplituden er den eneste variable parameter.
  3. Placer objektivet (D) i en afstand af ca. 6 cm foran laserhovedet (C).
  4. Placer objektivet (E) i en afstand af ca. 12 cm foran objektivet (D).
  5. Vandtanken (A) anbringes således, at laserens fokuspunkt er placeret inde i vandtanken, hvilket fører til gnistdannelse for hver laserpuls (5-10 mJ). Lasergnisten skal placeres ca. 3 cm under den målrettede trykantinode.
    BEMÆRK: Uden ultralyd (US) vil laserkernet boble stige til oversiden på grund af opdrift.
  6. Tænd ultralydstransduceren. Forøg den påførte spænding, indtil boblen ikke længere stiger lodret, men afviges mod trykantinoden og for et tilstrækkeligt højt tryk fanges.
  7. Indstil baggrundsbelysningen (kontinuerlig lysemitterende diode) og højhastighedskameraet for at observere den fangede boble.
    BEMÆRK: Når du kerner en ny boble med en lasergnist, er det let at fange boblens bane, der nærmer sig dens fangststed.
  8. Flyt placeringen af lasergnisten inde i vandtanken, så boblebanen forbliver inde i kameraets brændplan.
  9. Trap en boble og fang dens radiale svingninger med følgende parametre: rammestørrelse 128 x 128 pixels, erhvervelseshastighed 180 kHz. Et eksempel på radiale svingninger med stor amplitude over to akustiske perioder er vist i figur 6. Typiske gasbobler størrelse varierer fra 30 til 80 μm.
  10. Optag boblens radiale svingninger i løbet af 3 til 30 millisekunder for at fange hundreder til tusinder af boblesvingninger. Gentag denne optagelse for at øge transducerens påførte spændinger. Typiske anvendte spændinger ligger i området 0 - 8 V.
    BEMÆRK: Når den påførte spænding ændres, bevæger ligevægtsplaceringen af den fangede boble sig lidt lodret. For at følge svingningerne uden at flytte baggrundsbelysningen og kameraet skal du placere systemet (transducer og vandtank) på et bevægeligt bord i tre retninger med mikrometrisk nøjagtighed.
  11. Tænd ultralydstransduceren, og tag et billede af baggrunden til efteranalyse.
  12. Efter behandling af videoserien efter denne procedure:
    1. Kør den eksekverbare fil VoltagePressure.exe. Grænsefladen vist i figur 7 skal åbnes.
      BEMÆRK: Scriptet er tilgængeligt som et supplerende dokument.
    2. Angiv de fysiske og eksperimentelle parametre i venstre kolonne (figur 7A).
    3. Angiv værdierne for anvendt spænding for serien af optagelser i tabellen nederst til højre (figur 7B).
    4. I bobleradiusanalysepanelet skal du klikke på Indlæs parametre (figur 7C) og vælge den mappe, der indeholder alle filerne i din videoserie, og derefter baggrundsbilledet (obligatorisk).
    5. Valget er tilladt mellem at analysere alle videoer på én gang ved at klikke på Auto eller en efter en ved at klikke på Trin for trin.
    6. For hver videofil plottes udviklingen af bobleradius over en akustisk periode, og en numerisk tilpasning overlejres. Den røde kurve svarer til en lineær Rayleigh-Plesset-modellering. Ligevægtsbobleradius vises (figur 7D).
    7. I henhold til den numeriske tilpasning vises det påførte tryk for denne spænding i grafpanelet Tryk (spænding) (figur 7E). Værdien af det påførte tryk vises også i tabellen nederst til højre (figur 7B). Typiske anvendte tryk svarende til 0 - 8 V spændingsdynamikken er 0 - 25 kPa.
    8. Når alle videoer er behandlet, skal du klikke på knappen Lineær regression for at udføre en lineær tilpasning af tryk/spændingskurven. Dataene (spændings- og trykværdier) gemmes i en .txt fil, der er placeret i den aktuelle mappe. Hældningen af pasformen er tilvejebragt.

3. Koalescensteknik

  1. Tænd ultralydstransduceren. Den påførte spænding indstilles så højt, at det tilsvarende akustiske tryk kan føre til udløsning af ustabilitet i overfladen i henhold til det numeriske tryk/radiusdiagram over ustabilitetszoner som vist i figur 8.
  2. Nukleere en boble, som derefter migrerer til dens fangststed. Hvis den fangede boble kun udviser sfæriske svingninger, skal du gå videre til næste trin. Hvis der forekommer ikke-sfæriske svingninger:
    1. Sluk for ultralydseffekten for at lade boblen stige til den øverste overflade.
    2. Rediger laserenergien (ved finjustering over et par mJ) eller reducer transducerspændingen.
    3. Tænd for ultralydsstrømmen.
    4. Nukleere en ny boble.
    5. Gentag denne procedure, indtil boblestørrelsen fører til rent sfæriske svingninger.
  3. Når en fanget boble kun udviser sfæriske svingninger, skal du generere en ny lasergnist. Når den nye boble når fangststedet, opstår der sammensmeltning.
  4. Hvis den sammensmeltede boble kun udviser sfæriske svingninger, skal du generere en ny boble. Flere sammensmeltninger kan være nødvendige for at nå bobleradiusen, hvor ikke-sfæriske deformationer forekommer. Et eksempel på boblekoalescens, der fører til ikke-sfæriske svingninger, er vist i figur 9.
  5. Når den sammensmeltede boble udviser ikke-sfæriske svingninger, registreres boblesvingningerne i en varighed på ca. 3 til 30 millisekunder.
  6. Identificer tilstandsantallet af formsvingninger ved at se figur 10.

4. Målinger af væskestrøm

  1. I tilfælde af mikrostreamingmålinger af kavitation skal fluorescerende sporstofpartikler tilsættes vandet inden boblekimdannelse. I denne undersøgelse anvendes 0,71 μm partikler (Tabel over materialer). De er tilstrækkeligt små til at være akustisk gennemsigtige (ikke påvirket af den akustiske strålingskraft) og til nøjagtigt at følge strømmen samt tilstrækkeligt store til at sprede laserlys. Brug tre dråber til vandtankens volumen, svarende til ca. 2,104 partikler/mm3.
  2. Før du foretager målinger, skal du indstille følgende parametre til registrering af både bobledynamikken (hurtig tidsskala) og (lav tidsskala) væskestrøm:
    1. Opret en partitionering af kameraets optagedisk.
    2. Alternativt kan du definere optagelsesparametrene som:
      1. Billedhastighed 180 kHz, billedstørrelse 128 x 128 pixels og eksponeringstid 1 μs for én optagelse af dynamikken i boblegrænsefladen
      2. Billedhastighed 600 Hz, billedstørrelse 1024 x 768 pixels og eksponeringstid 1 ms for én optagelse af bevægelsen af farvestofsporere.
  3. Brug en kontinuerlig laser.
  4. Opret et tyndt laserark ved successivt at lade laserstrålen passere gennem cylindrisk plano-konkav linse og cylindrisk plano-konveks linse orienteret på en ortogonal akse. Der kan opnås en strålebredde på ca. 160 μm.
  5. Indstil laserarket, så det svarer til billedplanet:
    1. Indstil laseren på en bevægelig enhed, så laserarket kan flyttes parallelt med billedplanet.
    2. Juster positionen, så de oplyste partikler er synlige for kameraet.
    3. Nukleere og fange en boble.
    4. Juster laserarkets position yderligere, så en skygge bliver synlig bag boblen. Boblen er nu inde i laserarket, som vist i figur 11.
  6. Inducer boblekoalescens, indtil en stabilt oscillerende formtilstand er tydelig.
  7. Lav flere optagelser, skift frem og tilbage mellem bobledynamik og mikrostreaming.
    BEMÆRK: Sluk for den kontinuerlige laser, når den ikke er nødvendig. Opvarmning kan skabe uønskede konvektive strømme. Sluk også for den lysemitterende diode, når du udfører målingerne af streamingflow.

5. Billedbehandling for at visualisere kavitationsmikrostreamingmønstre

  1. Installer visualiseringssoftwaren ImageJ til billedbehandling og analyse i Java. Installer også plugin CINE File Reader for at åbne højhastighedskamerafilerne.
  2. Klik på Filer | Import | CineFile og vælg videoen *.cine, der indeholder optagelsen af partikelbevægelsen.
  3. Vælg Brug virtuel stak i det nye vindue, videoen er nu indlæst.
  4. For at observere partikelbevægelsen uden at vise streamingmønsteret skal du klikke på Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast | Automatisk. Den mørke baggrund erstattes nu af et automatisk optimeret billede.
  5. For at få vist det resulterende mønster skal du klikke på Billede | Stakke | Z-projekt, og vælg indstillingen Maks. intensitet for billedprojektionen. Der vises et outputbillede med pixels, der indeholder den maksimale værdi over alle billeder i stakken. Juster billedkontrasten som beskrevet i trin 5.4, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Der opnås et streamingmønster som dem, der er vist i figur 12b og figur 12d.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 9 viser en komplet sekvens af boblesammensmeltning, der fører til tidsstabile, symmetristyrede ikke-sfæriske svingninger. Den nærliggende fase af to sfærisk oscillerende bobler slutter, når den tynde flydende film mellem de to bobler brister. Det er værd at bemærke, at boblegrænsefladerne i sidste fase før sammensmeltningen afviger fra sfæricitet. Begge bobler forlænges på en ellipsformet form langs stien af den retlinede bevægelse af tilgang. Efter koalescensøjeblikket forbliver en enkelt boble og udviser ikke-sfæriske svingninger med en kompleks form i nogle få akustiske perioder. Dette svarer til det forbigående oscillationsregime efter excitationen af ethvert dynamisk system. Efter en halv snes til hundrede akustiske perioder stabiliseres formsvingningerne ved en steady-state svingning, her vist for en modus 4, som det kan udledes af fortolkningen af figur 10. Denne tilstand kan vare i tusindvis af akustiske perioder i flere millisekunder til et par minutter. Dette muliggør kvasi-samtidige målinger af bobleinducerede væskestrømme.

Når en boble er fanget og udviser stabile formsvingninger, fanges bevægelsen af fluorescerende sporstoffer i boblens nærhed, som vist i figur 11. Først og fremmest er fraværet af partikelbevægelse for en boble, der udviser rent sfæriske svingninger, i overensstemmelse med flere kavitationsmikrostreamingmodeller31, som beviser, at ingen hvirvelhastighed induceres af rene radiale svingninger. Når der opstår formsvingninger, produceres væskebevægelse i nærheden af boblegrænsefladen, som vist i figur 12. Den alternative registrering af dynamikken i boblegrænsefladen på den akustiske tidsskala (figur 12a,c) og af partiklernes bevægelse på en lavere tidsskala (figur 12b,d) gør det muligt at korrelere mikrostreamingmønsteret til et givet formtilstandsnummer. Figur 12a viser en øjebliksbilledeserie af bobledynamikken for en boble med en middelradius R0=70,5 μm, drevet ved det akustiske tryk Pa=12,8 kPa, som overvejende svinger i en modus 3. Det tilhørende mikrostreamingmønster i figur 12b består af seks lapper. Bevarelsen af symmetriaksen mellem formtilstandssvingninger og mikrostreamingmønsteret er tydeligt synlig. Figur 12c viser en øjebliksbilledeserie af bobledynamikken for en boble med middelradius R0=55,7 μm, drevet ved det akustiske tryk Pa=23,6 kPa, som overvejende svinger i en modus 4. Det tilhørende mikrostreamingmønster i figur 12d består af otte små lapper af boblediameterens størrelse. Endnu en gang er bevarelsen af symmetriaksen mellem formtilstandssvingninger og mikrostreamingmønsteret tydeligt synlig. Disse resultater synes at bekræfte, at jo højere orden formtilstandene er, jo mindre er mikrostreamingmønsteret, og jo mere begrænsede er de i boblens nærhed.

Denne antagelse om et snævrere streamingmønster for tilstande af højere orden er ikke så indlysende og afhænger af det modale indhold i boblegrænsefladedynamikken. Faktisk må vi huske, at bobleinduceret væskestrøm skyldes interaktionerne mellem to formtilstande, der svinger med samme frekvens, eller selvinteraktionen mellem en tilstand med sig selv31. En boble, der overvejende oscillerer i en given formtilstand, lad os for eksempel overveje en modus 3, kan også excitere andre ikke-sfæriske svingninger gennem ikke-lineær kobling mellem tilstande29. Hvis dynamikken i boblegrænsefladen indeholder supplerende tilstande, såsom den anden og fjerde (for eksempel), kan mikrostreamingstrømmen ændres betydeligt på grund af de mange interaktioner mellem tilstande, der ville generere specifikke mønstre. Dette er illustreret i figur 13 for to bobler, der overvejende svinger i en tilstand 3, der inducerer to forskellige mikrostreamingmønstre. I figur 13a,b,c viser en boble med ligevægtsradius R0 = 70,1 μm, drevet ved det akustiske tryk Pa = 12,4 kPa, oscillerende i en modus 3, et lapmønster. Analyse af grænsefladedynamikken (figur 13b) afslører, at de fremherskende tilstande er den radiale (oscillerende ved kørefrekvensen f 0), den translationelle (funktionsmåde med nummer 1, der svinger ved halvdelen af kørefrekvensen f 0), den tredje (oscillerende ved f 0/2) og en relativt lille fjerde og sjette funktionsmåde (begge oscillerende ved f 0). Det kan antages, at det vigtigste bidrag til mikrostreamingstrømmen er interaktionen mellem radial tilstand og tilstand 4 og 6, hvilket fører til et lobe-type mønster31. I figur 13d,e,f viser en boble med ligevægtsradius R0 = 68,6 μm, drevet ved det akustiske tryk Pa = 13,3 kPa, oscillerende ved modus 3, et tværtypemønster med stor afstand strømningsforlængelse. Analysen af grænsefladedynamikken (figur 13d) afslører, at de dominerende tilstande er den radiale, den translationelle (tilstand med nummer 1), den tredje og den sjette. Ifølge den høje amplitude af tilstand 3 kan det antages, at det vigtigste bidrag til mikrostreamingstrømmen er selvinteraktionen af tilstand 3, hvilket fører til et krydstypemønster32.

Figure 1
Figur 1. Illustration af metoden til udløsning af formsvingninger. Tryk/radius-kortet indeholder én ustabilitetszone pr. modus af en given grad. Tryktærsklen for at nå denne zone kan krydses ved (1) at øge det påførte akustiske tryk, der driver en gasboble med fast radius, indtil formtilstande vises, eller (2) øge boblestørrelsen ved et konstant påført akustisk tryk. En sådan stigning i boblevolumenet sker langsomt, når korrigeret diffusion opstår, mens boblekoalescens signifikant fastgør processen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Illustration af boblekoalescensteknikken. Den forestående fase (A) består af laserkernedannelse af to bobler, der støder på hinanden på samme fangststed i beholderen. Når de mødes, opstår koalescens: brud på den tynde flydende film mellem bobler (B) fører til dannelsen af en enkelt, oprindeligt deformeret boble. Denne deformerede boble drives af det monokromatiske ultralydsfelt og udviser ved første forbigående svingninger (C), inden den går ind i steady-state-regimet. I steady-state-regimet (D) udviser den sammensmeltede boble tidsstabile, symmetristyrede formsvingninger. Ved såning af mediet med fluorescerende nanopartikler fanges den bobleinducerede væskestrøm (E). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Frekvensresponsfunktion af trykfeltet i levitationssystemet. Amplituden af det akustiske tryk vises som funktion af frekvensen for tre steder inde i tanken svarende til følgende (x,y,z) koordinater: (1) blå, (2,05,2,05,6)cm, (2) rød, (0,0,1,28)cm og (3) sort, (3,23,3,48,1,36)cm, hvor koordinatsystemets oprindelse tages i midten af kubiktankens underside. I nærheden af 31,5 kHz er en resonanstilstand tydeligt synlig. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Fordeling af det akustiske tryk i levitationskammeret. (A) Tredimensionel repræsentation af trykfeltet i kubikvandtanken for den valgte resonanstilstand. Denne tilstand forekommer ved frekvensen 31, 2 kHz svarende til frekvensen af ultralydskilden. (B) Fordeling af det akustiske tryk i tankens diagonale plan. (C) Fordeling af det akustiske tryk i et vandret plan (højde z = konstant). Højden er valgt således, at den svarer til placeringen af trykantinoden i den øverste del af tanken. Farvebjælkens amplituder opnås ved at pålægge en normal forskydning på 1 μm ved transduceroverfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Fotografier og skemaer af den eksperimentelle opsætning. Det består af (A) det akustiske levitationssystem, (B-C) den pulserende laserforstærker og laserhovedet, (D-E) fokuslinsesættet, (F) højhastighedskameraet, (G) den lysemitterende diode, (H) den kontinuerlige bølgelaser og (I) formlinsesættet. a) En side og b) set ovenfra af forsøgsopstillingen. c) Illustration af de materialer, der er nødvendige for at opfange boblesvingningerne. Bemærk, at den kontinuerlige laser (H) er slået fra under denne proces. d) Illustration af de materialer, der er nødvendige for at opfange væskestrømmene. Bemærk, at den pulserende laser (C) til boblenukleation er slukket, mens den kontinuerlige laser (H) til generering af et laserark, der belyser mikropartikelsporerne, er tændt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6. Snapshot-serie af en ultralyddrevet boble, der udviser store amplitude sfæriske svingninger. Bobleligevægtsradius er ~ 60 μm, og det drivende akustiske tryk er ~ 15 kPa. Tidsintervallet mellem to på hinanden følgende billeder er 5,6 μs. Hele serien svarer til to akustiske perioder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7. Interfacepanel i det eksekverbare script PVR_Interface.exe. Scriptet lancerer en grafisk brugergrænseflade, der indeholder (A) et panel til indstilling af de fysiske parametre, (B) en tabel til indstilling af den påførte elektriske spænding, der påføres transducere, (C) muligheden for at indlæse hele sættet af optagede videoer, der efterbehandles og giver ligevægtsbobleradius (D) og det påførte akustiske tryk (B), afbildningen af tryk/spændingsforholdet (E). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8. Tryk/radiusdiagram over ustabilitetszoner. Hvert farvet område svarer til en ustabilitetszone for en given formtilstand: (blåt område) Mode 2, (grønt område) Mode 3 og (rødt område) Mode 4. Det hvide område svarer til det tilfælde, hvor mikrobobler kun udviser sfæriske svingninger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9. Snapshot-serie af en boblesammensmeltning, der fører til formsvingninger. Efter den nærliggende fase af to bobler bristes den tynde film mellem dem, og der opstår sammensmeltning. En enkelt boble drives nu af ultralydsfeltet, først i et forbigående svingningsregime. Efter nogle akustiske perioder etableres steady-state-regimet på en aksisymmetrisk formtilstand, her tilstanden 4. Tidsintervallet mellem to på hinanden følgende fotografier er 30 μs. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10. De første fem aksisymmetriske formtilstande, herunder radial tilstand. Sidebillede af konturen af boblegrænsefladen vist i to ekstremer af svingningsamplituden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11. Fluorescerende sporstofferpartikler omkring sfærisk oscillerende mikrobobler. Begge billeder svarer til en superposition på 100 snapshots, der dækker 0.25s. a) Der kan ikke observeres bevægelse af sporstofpartiklerne, hvis formsvingninger ikke er til stede. b) Der kan forekomme en parasitmiddelstrøm, der er synlig i hele synsfeltet, f.eks. på grund af opvarmning af lasepladen. Denne strøm er dog ikke knyttet til boblebevægelsen. På begge billeder er skyggen induceret af laserarket bag boblen tydeligt synlig. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 12
Figur 12. Kvasi-samtidig optagelse af bobledynamikken og den inducerede mikrostreaming. Venstre kolonne: Snapshotserie af en boble, der udviser formtilstandssvingninger i orden 3 (a) og den inducerede mikrostreaming (b). Højre kolonne: Snapshot-serie af en boble, der udviser formtilstandssvingninger i rækkefølge 4 (c) og den inducerede mikrostreaming (d). For alle figurer svarer den røde stiplede linje til symmetriaksen for både bobleformsvingninger og væskestrømme, bestemt af den retlinede bevægelse af de to bobler, der nærmer sig, før de smelter sammen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 13
Figur 13. Eksempel på to streamingmønstre induceret af en boble, der overvejende oscillerer i en tilstand 3. a,d) Illustration og snaphot af boblegrænsefladen, (b,e) tilstandsnedbrydningen af boblegrænsefladen og (c,f) det tilhørende streamingmønster. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den præsenterede procedure består i at anvende boblekoalescens for at udløse steady-state, symmetristyrede bobleformsvingninger, hvilket muliggør undersøgelse af den langsigtede væskestrøm induceret af disse svingninger. Den største udfordring i teknikken er kontrollen af ikke-sfæriske svingninger for en boble, der fanges, langt fra nogen grænser.

De fleste af de eksisterende teknikker, der foreslås i litteraturen, fokuserede på substratbundne bobler 7,16, da fraværet af bevægelse af boblecentret gør det lettere at fange dets grænseflade på den akustiske tidsskala (op til hundreder af kHz). Mens overskridelse af tryktærsklen, der er nødvendig for at udløse formtilstande, er en let opgave i dette tilfælde, er styringen af formsvingninger kompliceret på grund af symmetribruddet induceret af substratet. En vægfastgjort boble kommer i kontakt med underlaget med en bestemt kontaktvinkel, hvilket fører til udløsning af asymmetriske overfladetilstande21. Ud over kompleksiteten ved at fortolke de tredimensionelle, asymmetriske tilstande med kun en enkelt kameravisning opstår der abrupt overgang til et kaotisk overfladesvingningsregime33. Derfor består hovedudfordringen i at fange formsvingninger af en enkelt, fanget boble langt fra nogen grænser for at opnå aksisymmetriske ikke-sfæriske svingninger. Sådanne betingelser muliggør sammenligning mellem eksperimenter og det store udvalg af analytiske undersøgelser, der er tilgængelige i litteraturen. Den største eksperimentelle vanskelighed ligger i mikroboblens positionelle stabilitet. For at overvinde dette problem er optiske pincetter blevet brugt til at kontrollere boblefangst34, og amplitudemodulerede ultralydfelter bruges til at fange og drive bobleoscillationer29. I begge tilfælde fanges en enkelt boble, og ikke-sfæriske tilstande udløses. I tilfælde af det amplitudemodulerede kørefelt eksisterer formtilstandene kun i en lille periode, da de periodisk begynder og forsvinder. Derudover kontrolleres orienteringen af bobleformoscillationer ikke og fører til en bias i analysen af grænsefladebevægelsen.

Det alternativ, vi foreslår, er brugen af en pulserende laser til at nukleere en enkelt boble, senere fanget ved en trykantinode i et resonanslevitationskammer. Ved at nukleere successive bobler over tid bevæger hver kerneboble sig mod sin fangstplacering, som allerede er optaget af en anden boble. Sammensmeltning opstår og inducerer en oprindeligt deformeret boblegrænseflade. Hvis drivtrykket er tilstrækkeligt stærkt, opretholdes formsvingningerne. Lasernukleation er blevet foretrukket frem for andre nukleationsteknikker, såsom elektrolyse for eksempel, da det muliggør hurtig og pålidelig boblegenerering. Som illustreret i figur 9 er symmetriaksen for formsvingninger givet ved bobleaksetilgangen før sammensmeltning. Dette store resultat kræver imidlertid relativt lang tid til indstilling af den eksperimentelle opsætning, da det kræves, at boblerne forbliver inde i kameraets brændplan under sammensmeltningsfasen (for at orientere symmetriaksen i dette plan). For at gøre dette foretages små ændringer af boblekernestedet for at optimere den vej, langs hvilken boblerne bevæger sig og støder på hinanden. Ændringen til boble-nukleationssted kræver fin modifikation af tankplaceringen i forhold til laserbanen og udføres med et treretningstrin med mikrometrisk nøjagtighed. Derudover udføres finjustering af laserenergien for at optimere kerneboblestørrelsen. Bobler, der er for store, genererer straks formtilstande med højt tilstandstal og nærmer sig den volumetriske bobleresonans. Dette fører til høj positionel ustabilitet i boblecentret. Bobler, der er for små, kræver et stort antal koalescensprocesser, før de når den passende størrelse til at udløse formtilstande.

Den største fordel ved den foreslåede teknik er etableringen af et steady-state-regime for symmetristyrede formsvingninger. Da grænsefladebevægelsen opretholdes i relativt lang tid (fra sekunder til minutter), er det muligt at fange den bobleinducerede væskestrøm ved at skifte den eksperimentelle opsætning til sporing af fluorescerende nanopartikler, der er podet ind i det flydende medium. Det er værd at bemærke, at der hidtil ikke findes eksperimentelle undersøgelser af mikrostreaming induceret af en boble i en uendelig væske i litteraturen. Selv når kavitationsmikrostreaming undersøges for substratbundet boble, er analysen begrænset til kvalitative observationer uden at overveje forbindelsen til bobledynamikken16. Måling af partikelbevægelse udføres i et tyndt laserark tilvejebragt af en kontinuerlig bølgelaser. Da det er nødvendigt at udføre næsten samtidig (i) laserkernedannelsen med pulserende laser, (ii) partikelsporing med et laserark og (iii) optagelse med højhastighedskameraet, skal der lægges særlig vægt på den potentielle blokering af materialer omkring vandtanken. Dette fører til en kompakt opsætning med mange begrænsninger på enhedens disposition, som vist i figur 5. Når du optager et mikrostreamingmønster induceret af en formoscillerende boble, er det nødvendigt alternativt at spore boblegrænsefladedynamikken som nævnt i trin 4.2. Faktisk tillader skift mellem alternative sekvenser af bobledynamik og væskestrømsvisualisering sikkert at knytte mikrostreamingmønsteret til en given formsvingning. Denne alternative procedure er obligatorisk, da (i) formsvingninger kan slukke, (ii) boblestabilitet kan stige brat, hvilket fører til boblens positionelle ustabilitet, (iii) boblen kan fragmentere, når der opstår store deformationer. Selvom disse begivenheder er sjældne, er det vigtigt at kontrollere, at bobledynamikken forbliver den samme ved at optage den både før og efter optagelse af mikrostreamingmønsteret. (På denne måde kan det sikres, at boblebevægelsen og mønsteret virkelig er korreleret).

Er det bevist, at en boble, der overvejende svinger på et givet tilstandsnummer, fører til et bestemt mikrostreamingmønster, som vist i figur 12. Mønsteret er unikt og afhænger af det modale indhold af grænsefladebevægelsen. Som illustreret i figur 13 kan det samme fremherskende tilstandstal fremkalde hvirvler med stor eller lille afstand afhængigt af antallet, amplituden og fasen af de sekundære tilstande, der er ophidsede.

Disse observationer kan have praktisk anvendelse i medicinske applikationer såsom målrettet og lokaliseret ultralydmedieret lægemiddelafgivelse, for eksempel. Bobler er kendt for at fungere som vektorer til permeabilisering af tætte kryds mellem celler og endda selve cellemembranen, hvilket fører til sonoporation1. I tilfælde af stabilt oscillerende mikrobobler kan dette fænomen induceres af forskydningsspændingen eller forskydningsspændingsgradienterne35 induceret af boblesvingninger gennem generering af mikrostreamingstrømme. Vi husker, at mikrostreaming er et ikke-lineært, andenordens fænomen. Først er det ikke ligetil at skalere de observerede strømningsmønstre til det, der opnås for terapeutiske, afskallede mikrobobler med mindre størrelser (~ 3 μm radius). Vi har allerede vist i introduktionen, hvordan ikke-sfærisk dynamik af frie eller coatede bobler af en størrelsesorden størrelsesforskel kan skaleres: egenfrekvensen ω n for en given tilstand n er relateret til boblestørrelsen som Equation 125. I Dollet et al.27 er formtilstande i rækkefølge 4 blevet fanget for coatede mikrometriske bobler exciteret ved 1,7 MHz, på samme måde som det observerede formtilstandstal i vores eksperiment. Det påførte tryk adskiller sig også stærkt, da der kræves tryk op til 200kPa for at udløse formtilstande på ultralydkontrastmiddelmikrobobler27. I den foreslåede opsætning overstiger det maksimale anvendte tryk ikke 25 kPa. Den stærke forskel i påført tryk skyldes udløsningen af overfladeustabilitet, da formtilstande vises over en bestemt tryktærskel. For de eksperimentelle betingelser ved 1,7 MHz, der er givet i Dollet et al. 27, har det vist sig, at tryktærsklen, der fører til formstabilitet, er omkring 150 kPa for en modus 436. For en 30 kHz kørefrekvens kræves kun en 10 kPa kørefeltamplitude for at udløse formstabilitet på en ~ 50 μm boble. Når den er udløst, udvikler formstabiliteten sig efter et par akustiske cyklusser og demonstrerer en plateaumætning af tilstandsamplituden. Amplitudemætning blev observeret for både frie bobler 24,29 og coatede bobler27. Det indikerer muligheden for at nå steady-state formsvingninger for frie eller coatede bobler med formsvingninger så store som 25 til 50% af radialtilstandsamplituden27,37. Ved hjælp af vores eksperimentelle tilgang når vi ekstreme formdeformationer i konfigurationenEquation 2 (hvor an er formtilstandsamplitude), som illustreret i figur 13.

For at opsummere tillader den foreslåede eksperimentelle opsætning skalering af hovedtræk ved ikke-sfæriske oscillationer af mikrobobler, selv for størrelser, der varierer med næsten en størrelsesorden. Med hensyn til mikrostreamingstrømmen kan skaleringen af strømningshastigheden undersøges for bobler, der udviser både laterale og radiale svingninger7 eller en ikke-sfærisk tilstand, der er selvinteragerende32. I begge tilfælde skaleres strømningshastighederne som v ~ ωR0 a i a j, hvor i, j betegner de betragtede tilstandsamplituder normaliseret af bobleradiusen. For lignende værdier af den ikke-sfæriske ekspansionsparameter ai opnås identiske strømningshastigheder, når ωR0 ~ konstant. Når vi sammenligner vores eksperimentelle betingelser med den, der anvendes til terapeutiske afskallede mikrobobler27, adskiller teoretiske forudsigelser af strømningshastigheder sig kun fra en faktor 2,5. Målinger af strømningshastigheder ved hjælp af partikelsporingshastighed førte til estimater af hastighedsstørrelsen på 1 mm / s i den her præsenterede opsætning. Denne værdi svarer til den, der opnås ved undersøgelse af mikrostreaming induceret af ultralydkontrastmidler19. Med hensyn til den rumlige organisering af strømningsmønsteret er vinkelfordelingen af strømningshvirvlerne omkring boblegrænsefladen uafhængig af bobleradius31. Kun den radiale udvidelse af streamingfeltet påvirkes af ændringen af boblestørrelsen. Denne radiale ekspansion skaleres som Equation 3, hvor er en koefficient, der er knyttet til det undersøgte tilstandstal. Det er klart, at den overordnede form af streamingmønsteret bevares, da den radiale ekspansion styres af bobleradius R0. Som illustreret i figur 13 kan streamingmønsteret imidlertid variere betydeligt, selv når man overvejer det samme formtilstandsnummer. Figur 13 fremhæver boblegrænsefladens enorme indvirkning på streamingmønsteret og især på den rumlige ændringshastighed i hastighedsfeltet. Den rumlige fordeling af forskydningsspænding eller forskydningsspændingsgradient er angivet som en passende indikator for sonoporationseffektivitet35. I vores foreslåede eksperimentelle opsætning kan kun forskydningsspændingen i bulkvæsken vurderes på dette stadium. Yderligere forlængelse af vægforskydningsspændingen ville kræve tilføjelse af en nærliggende overflade tæt på boblen. Det er forudsigeligt, at en overflade i boblens nærhed vil forstyrre boblens positionsstabilitet ved lokalt at ændre det stående bølgefelt. At sikre boblestabilitet i tæt afstand fra en væg er stadig en udfordring, der delvist kan løses ved at tilføje et sekundært ultralydsfelt dedikeret til boblefangst med en bølgelængde, der er identisk med boblevægafstanden. Et sådant dobbeltfrekvent akustisk levitationskammer var allerede designet til at undersøge boblepardynamik og interaktionskræfter38. Desværre gør den store størrelsesforskel mellem de bobler, der undersøges her, og biologiske celler (typisk radius ~ 10μm) direkte brug af denne eksperimentelle opsætning umulig til biologiske undersøgelser. Vi forventer dog, at vores eksperimentelle resultater i kombination med den seneste teoretiske udvikling inden for bobleinduceret mikrostreaming vil hjælpe med at forbedre en sådan modellering samt give tillid til den teoretiske forudsigelse af bobleinduceret forskydningsstress eller forskydningsspændingsgradienter i nærheden af en cellemembran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af LabEx CeLyA ved universitetet i Lyon (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspherical lens Thorlabs AL4050 Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source CNI MLL6FN DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LJ1277L1-A lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LK1900L1 lens of focus 250 mm
Fluorescent particles Duke Scientific R700 Red polymer fluorescent microspheres
Function generator Agilent HP33120 Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera Vision Research Phantom v12.0 High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium Carlo Erba Water for analysis Demineralized, undegassed water
Multiphysics software Comsol None Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser New Wave Research Solo III-15 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens Thorlabs N-BK7 lens of focus 125 mm
Spherical concave lens Thorlabs N-SF11 Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer SinapTec Custom-made Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software NIH ImageJ Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage Newport M-406 Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage Edmund Optics 62-299 Vertical displacement stage with micrometric screw

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roovers, S., et al. The role of ultrasound-driven microbubble dynamics in drug delivery: from microbubble fundamentals to clinical translation. Langmuir. 35 (31), 10173-10191 (2019).
  2. Liu, H. L., Fan, C. H., Ting, C. Y., Yeh, C. K. Combining microbubbles and ultrasound for drug delivery to brain tumors: current progress and overview. Theranostics. 4 (4), 432-444 (2014).
  3. Lammertink, B. H. A., et al. Sonochemotherapy: from bench to bedside. Frontiers in Pharmacology. 6, 138 (2015).
  4. Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10, 011501 (2016).
  5. Van Wamel, A., Bouakaz, A., Versluis, M., de Jong, N. Micromanipulation of endothelial cells: ultrasound-microbubble-cell interaction. Ultrasound in Medicine and Biology. 30, 1255-1258 (2004).
  6. Tran, T. A., Roger, S., Le Guennec, J. Y., Tranquart, F., Bouakaz, A. Effect of ultrasound-activated microbubbles on the cell electrophysiological properties. Ultrasound in Medicine and Biology. 33, 158-163 (2007).
  7. Marmottant, P., Hilgenfeldt, S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature. 423 (6936), 153-156 (2003).
  8. Prentice, P. A., Cuschieri, K., Dholakia, K., Prausnitz, M., Campbell, P. Membrane disruption by optically controlled microbubble cavitation. Nature Physics. 1, 107-110 (2005).
  9. Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophysical Journal. 96, 4866-4876 (2009).
  10. Novell, A., et al. A new safety index based on intrapulse monitoring of ultra-harmonic cavitation during ultrasound-induced blood-brain barrier opening procedures. Scientific Reports. 10, 10088 (2020).
  11. Cornu, C., et al. Ultrafast monitoring and control of subharmonic emissions of an unseeded bubble cloud during pulsed sonication. Ultrasonics Sonochemistry. 42, 697-703 (2018).
  12. Reslan, L., Mestas, J. L., Herveau, S., Béra, J. C., Dumontet, C. Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation. Journal of Controlled Release. 142 (2), 251-258 (2010).
  13. Reuter, F., Gonzalez-Avila, S. R., Mettin, R., Ohl, C. D. Flow fields and vortex dynamics of bubbles collapsing near a solid boundary. Physical Review Fluids. 2, 064202 (2017).
  14. Chew, L. W., Klaseboer, E., Ohl, S. W., Khoo, B. C. Interaction of two differently sized oscillating bubbles in a free field. Physical Review E. 84, 066307 (2011).
  15. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  16. Tho, P., Manasseh, R., Ooi, A. Cavitation microstreaming patterns in single and multiple bubble systems. Journal of Fluid Mechanics. 576, 191-233 (2007).
  17. Van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. Journal of Controlled Release. 112, 149-155 (2006).
  18. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. PNAS. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  19. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterization of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12, 034109 (2018).
  20. Shklyaev, S., Straube, A. V. Linear oscillations of a compressible hemispherical bubble on a solid substrate. Physics of Fluids. 20, 052102 (2008).
  21. Fauconnier, M., Bera, J. C., Inserra, C. Nonspherical modes non-degeneracy of a tethered bubble. Physical Review E. 102, 033108 (2020).
  22. Xi, X., Cegla, F., Mettin, R., Holsteyns, F., Lippert, A. Study of non-spherical bubble oscillations near a surface in a weak acoustic standing wave field. The Journal of the Acoustical Society of America. 135, 1731 (2014).
  23. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Effect of a distant rigid wall on microstreaming generated by an acoustically driven gas bubble. Journal of Fluid Mechanics. 742, 425-445 (2014).
  24. Cleve, S., Guédra, M., Inserra, C., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Surface modes with controlled axisymmetry triggered by bubble coalescence in a high-amplitude acoustic field. Physical Review E. 98, 033115 (2018).
  25. Lamb, H. Hydrodynamics. 6th ed. , University Press. Cambridge. (1932).
  26. Liu, Y., Wang, Q. Stability and natural frequency of nonspherical mode of an encapsulated microbubble in a viscous liquid. Physics of Fluids. 28, 062102 (2016).
  27. Dollet, B., et al. Nonspherical oscillations of ultrasound contrast agent microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (9), 1465-1473 (2008).
  28. Versluis, M., et al. Microbubble shape oscillations excited through ultrasonic parametric driving. Physical Review E. 82, 026321 (2010).
  29. Guédra, M., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Dynamics of nonspherical microbubble oscillations above instability threshold. Physical Review E. 96, 063104 (2017).
  30. Cleve, S., Guédra, M., Mauger, C., Inserra, C., Blanc-Benon, P. Microstreaming induced by acoustically trapped, non-spherically oscillating microbubbles. Journal of Fluid Mechanics. 875, 597-621 (2019).
  31. Doinikov, A. A., Cleve, S., Regnault, G., Mauger, C., Inserra, C. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. I. Case of modes 0 and m. Physical Review E. 100, 033104 (2019).
  32. Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Doinikov, A. A. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. III. Case of self-interacting modes n-n. Physical Review E. 101, 013111 (2020).
  33. Prabowo, F., Ohl, C. D. Surface oscillations and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrasonics Sonochemistry. 18 (1), 431-435 (2011).
  34. Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined; optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90, 114103 (2007).
  35. Collis, J., et al. Cavitation microstreaming and stress fields created by microbubbles. Ultrasonics. 50, 273-279 (2010).
  36. Loughran, J., Eckersley, R. J., Tang, M. X. Modeling non-spherical oscillations and stability of acoustically driven shelled microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4349-4357 (2012).
  37. Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall - a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
  38. Regnault, G., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Secondary radiation force between two closely spaced acoustic bubbles. Physical Review E. 102, 031101 (2020).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 171 kavitation mikroboble formsvingninger mikrostreaming højhastighedsbilleddannelse boblesammensmeltning
Induktion af mikrostreaming ved ikke-sfæriske bobleoscillationer i et akustisk levitationssystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Inserra, C., Regnault, G., Cleve,… More

Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Induction of Microstreaming by Nonspherical Bubble Oscillations in an Acoustic Levitation System. J. Vis. Exp. (171), e62044, doi:10.3791/62044 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter