Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62051
Automatic Translation
1, 1,2
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

Presentamos un protocolo para un ensayo de alimentación de dos opciones para moscas. Este ensayo de alimentación es rápido y fácil de ejecutar y es adecuado no sólo para la investigación de laboratorio a pequeña escala, sino también para pantallas de comportamiento de alto rendimiento en moscas.

Abstract

Para seleccionar alimentos con valor nutricional evitando al mismo tiempo el consumo de agentes dañinos, los animales necesitan un sistema de sabor sofisticado y robusto para evaluar su entorno alimentario. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo genéticamente tractable que se utiliza ampliamente para descifrar los fundamentos moleculares, celulares y neuronales de la preferencia alimentaria. Para analizar la preferencia de los alimentos con mosca, se necesita un método de alimentación robusto. Aquí se describe un ensayo de alimentación de dos opciones, que es riguroso, que ahorra costos y es rápido. El ensayo es a base de placa de Petri e implica la adición de dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. El examen del abdomen de cada mosca es seguido por el cálculo del índice de preferencias. A diferencia de las placas multiwell, cada placa Petri toma sólo ~ 20 s para llenar y ahorra tiempo y esfuerzo. Este ensayo de alimentación se puede emplear para determinar rápidamente si a las moscas les gusta o no un alimento en particular.

Introduction

A pesar de las diferencias dramáticas en la estructura anatómica de los órganos gustativos entre moscas y mamíferos, las respuestas conductuales de las moscas a muchas sustancias tástricas son sorprendentemente similares a las de los mamíferos. Por ejemplo, las moscas prefieren el azúcar1,2,3,4,5,6,7,8,aminoácidos9,10y baja sal11,que indican nutrientes, pero rechazan los alimentos amargos12,13,14,15 que son desagradables o tóxicos. En las últimas dos décadas, las moscas han demostrado ser un organismo modelo muy valioso para avanzar en la comprensión de muchas cuestiones fundamentales relacionadas con la sensación del gusto y el consumo de alimentos, incluyendo la detección de tastant, la transducción del sabor, la plasticidad del sabor y la regulación de alimentación16,17,18,19,20. Notablemente, una serie de estudios han demostrado que la transducción del sabor y los mecanismos de circuito neural subyacentes a la percepción del gusto son análogos entre las moscas de la fruta y los mamíferos. Por lo tanto, la mosca de la fruta sirve como un organismo experimental ideal, permitiendo a los investigadores descubrir conceptos y principios conservados evolutivamente que rigen la detección y el consumo de alimentos en el reino animal.

Para investigar la sensación de sabor en las moscas, es fundamental establecer un ensayo rápido y riguroso para medir objetivamente la preferencia alimentaria. A lo largo de los años, varios métodos de alimentación, tales como ensayos a base de tintes11,12,13,21,22,23, el ensayo de respuesta de extensión de proboscis mosca24, el alimentador capilar (CAFE) ensayo25,26, el ensayo Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)27y otros métodos combinatorios se han desarrollado para medir cuantitativamente la preferencia alimentaria y/o la ingesta de alimentos para moscas de la fruta28,29,30,31. Uno de los paradigmas de alimentación populares es el ensayo de alimentación a base de tinte de dos opciones utilizando una placa de microtitro multi-well12,21,32 o, como se describe aquí, una pequeña placa de Petri11,22 como cámara de alimentación. Este ensayo está diseñado sobre la base de la transparencia del abdomen de la mosca. Durante este ensayo, las moscas se colocan en la cámara de alimentación y se presentan con dos opciones de alimentos mezclados con tinte rojo o tinte azul. Una vez completado el ensayo, los abdomens de mosca aparecen rojos o azules dependiendo de los alimentos que hayan consumido.

Tanto la placa Petri como los ensayos de alimentación a base de tinte multiwell-plate son altamente robustos y producen aproximadamente los mismos resultados. Utilizando estos dos ensayos, numerosos descubrimientos importantes y avances se han hecho para descifrar los receptores y células altamente diversificados responsables de detectar los gustos de los alimentos y la textura de los alimentos11,12,21,22,32,33. En el ensayo a base de tinte, un paso experimental que requiere un tiempo y esfuerzo considerables es preparar y cargar alimentos en la cámara de alimentación. Para reducir el tiempo de preparación y carga de los alimentos, este ensayo se modificó reemplazando la placa de microtiter multiporípodo por una pequeña placa Petri, que se divide en dos compartimentos iguales. En el ensayo a base de placas de Petri, se añaden dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. A continuación, se examina el abdomen de cada mosca y se calcula el índice de preferencias (PI).

Este ensayo de alimentación de dos opciones basado en placas Petri es asequible, simple y rápido. Una placa multi-well requiere aproximadamente 110 s para llenar, mientras que cada placa Petri toma sólo ~ 20 s. Además, la placa multipobado requiere canalizar pequeños volúmenes de alimentos en un gran número de pequeños pozos (por ejemplo, 60 o más pozos por plato), lo que requiere una precisión y atención considerables. Por el contrario, el ensayo basado en placas De Petri requiere sólo dos acciones por plato. Como el ensayo de alimentación puede implicar un gran número de réplicas, el ensayo basado en placas De Petri ahorra una cantidad notrivial de tiempo y esfuerzo. Este ensayo da resultados equivalentes a los del ensayo a base de múltiples oleajes y ha demostrado tener éxito en abordar muchas preguntas fundamentales en la sensación de sabor, incluyendo la codificación del sabor de la sal11,la plasticidad del sabor modificado por la experiencia alimentaria22,y la base molecular de la sensación de textura de los alimentos33. En resumen, este ensayo de dos opciones basado en placas de Petri es una poderosa herramienta para investigar cómo las moscas perciben los ambientes de nutrientes externos e internos para provocar un comportamiento de alimentación adecuado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Montaje de las cámaras de ensayo

NOTA: Si bien este protocolo describe el uso de una placa Petri de 35 mm(Figura 1A),el efecto deseado se puede lograr utilizando cualquier recipiente estanco y de fondo liso que pueda ser bisectado y cubierto.

  1. En primer lugar, bisect una placa Petri tapada de 35 mm fijando una longitud de plástico (5 mm de ancho y 3 mm de altura) por la línea media con adhesivo impermeable, formando dos compartimentos estancos. Confirme que el sello está completo para evitar fugas que puedan llevar a la mezcla de los dos sustratos alimentarios que se están probando.
    NOTA: Después del montaje, reutilice este aparato siempre y cuando el sello se mantenga.

2. Preparación de viales de inanición

  1. Preparar un número suficiente de viales de plástico vacíos; luego, compactar libremente un pedazo de papel tisú en la parte inferior. Comprima el papel tisú lo suficiente como para llenar el espacio, pero no tanto que forme una masa densa.
    NOTA: Asegúrese de que no haya grietas profundas o pliegues en el tejido, ya que esto puede llevar a que las moscas queden atrapadas.
  2. Agregue ~3 ml de agua pura al vial para que el tejido esté completamente saturado, pero no hay agua estancada. Asegúrese de que no haya gotas grandes de exceso de agua en la pared del vial. Alternativamente, sustituir la agarose por el papel empapado mediante la preparación de una solución de agar 1% w/v (sin sacarosa) añadiendo 5 ml de 1% de agarose a cada vial vacío y permitiendo que la agarose se solidifique a temperatura ambiente.

3. Inanición húmeda de moscas antes del experimento

  1. Inicie la inanición 24 h antes del momento del experimento. Bajo anestesia de CO2, clasifica grupos de ~70, moscas de 2-4 días de edad en los viales de inanición preparados, etiquetando cada vial con el genotipo y el tiempo de inanición.

4. Configuración de reactivos

  1. Preparación de tintes
    NOTA: Antes de realizar cualquier experimento, es importante realizar un ensayo de control preliminar para determinar las concentraciones correctas de tintes rojos y azules a utilizar.
    1. Para el ensayo de control, prepare una gama de diluciones para cada tinte y realice el ensayo de alimentación con el mismo alimento con un color de tinte diferente. Utilice los resultados para identificar concentraciones de dos tintes (un rojo, otro azul) que producen un PI de ~0 cuando no se agrega ningún compuesto experimental (ver sección 7).
      NOTA: Por ejemplo, la concentración final de tinte azul se fijó en 50 μM y se probó contra una serie de concentraciones de tinte rojo. Basado en la curva de dosificación de tinte rojo, la concentración óptima de tinte rojo fue de 210 μM, lo que dio un sesgo mínimo de tinte (Figura 1B). Una mayor concentración de tinte rojo impulsa a las moscas a preferir los alimentos rojos, mientras que una menor concentración impulsa a las moscas a preferir la comida azul. Refinar cuidadosamente las concentraciones de colorante azul o rojo en incrementos de 1 μM, ya que las diferencias de esta magnitud y mayores pueden afectar a los resultados experimentales.
  2. Preparación del 1% de agarose
    1. Combine 0,5 g de agarose y 50 ml de agua pura (o algunos de ellos múltiples) en un recipiente apto para microondas. Microondas la solución de agarose hasta que se disuelva, revolviendo según sea necesario.
  3. Preparación de otros componentes alimentarios
    1. Disolver cada componente alimentario, incluyendo sacarosa y cualquier compuesto experimental, en agua a una concentración 100 veces o mayor de la concentración final probada.
      NOTA: El volumen total de cada ingrediente alimenticio añadido al 1% de agar no debe exceder de 1 ml por agar fundido de 10 ml. De lo contrario, la agarose puede diluirse demasiado y no se solidificará adecuadamente.
  4. Preparación de medios alimentarios
    1. Mezcle el agar, el tinte y el compuesto experimental deseado en tubos centrífugas de polipropileno cónico (15 o 50 ml); utilizar agua en lugar del tacstant experimental en el alimento de control. Haga esto mientras el agar todavía es completamente líquido y mezcle bien usando un mezclador de vórtice. Mantenga los tubos en un baño de agua de 60 °C mientras no esté en uso para evitar que la agarose se endurezca antes de ser distribuida en platos.
  5. Preparación de platos para el experimento
    NOTA: Asegúrese de que todos los platos estén completamente secos antes de comenzar.
    1. Pipeta 1 mL de medio de alimentos experimentales rojos en un lado del plato de ensayo (Figura 1A); repetir para el número deseado de platos. Deje que la agarose se enfríe hasta que se firme (3-5 min), y luego pipetear 1 mL de comida de control azul en el otro lado de los platos(Figura 1A). Repita este proceso con el par azul rojo/experimental de control.
      NOTA: Asegúrese de que todos los platos estén completamente configurados antes de comenzar el experimento. Utilice los platos en un plazo de 30 minutos.

5. Iniciar el ensayo de alimentación bidireccional

  1. Paralizar temporalmente las líneas de vuelo experimentales sobre hielo hasta que no se observen actividades motoras obvias como volar y escalar. Una vez inmovilizadas las moscas, invierta suavemente el vial y toque para transferir todas las moscas a la cámara de ensayo.
    NOTA: Choque frío toma ~ 3-5 min. La exposición prolongada al frío puede afectar la fisiología y la salud de la mosca y, por lo tanto, debe evitarse.
  2. Coloque rápidamente la cubierta en la cámara y reservela. Una vez que todas las moscas hayan sido transferidas, mueva todas las cámaras a un espacio oscuro y cerrado. Permita que el ensayo funcione durante 90 minutos.
    NOTA: Un entorno oscuro minimiza la influencia de la vía visual de la mosca en el comportamiento de alimentación y elimina cualquier señal ambiental del exterior del plato.

6. Terminación del ensayo de alimentación bidireccional

  1. Después de que hayan transcurrido 90 minutos, transfiera las cámaras a un congelador de -20 °C para sacrificar las moscas. Después de ~1 h, cuente las moscas.
    NOTA: Invertir cada placa de Petri antes de colocar el plato en el congelador para asegurarse de que no se congelarán moscas en el alimento.

7. Asignar un índice de preferencias (PI) para determinar la preferencia alimentaria

  1. Bajo un microscopio de disección estándar, examine el color abdominal de las moscas en cada plato individual. Cuente las moscas como rojas, azules o púrpuras según el color de su abdomen(Figura 2A). Cuente la mosca si su abdomen está más del 50% coloreado, lo que indica una alimentación robusta(Figura 2B). Excluya la mosca si su abdomen contiene sólo un pequeño punto de comida, lo que indica una mala alimentación(Figura 2C).
  2. Después de contar el número de moscas que comen alimentos azules, rojos o azules y rojos, utilice la siguiente ecuación para asignar a cada placa de Petri un índice de preferencias (PI):

PI = (Número de moscas comiendo alimentos experimentales) - (Número de moscas comiendo alimentos de control) / (Número de moscas comiendo alimentos experimentales) + (Número de moscas comiendo alimentos de control) + (Número de moscas comiendo ambas)

PI > 0 indica una preferencia por el compuesto experimental, PI < 0 indica una aversión al compuesto experimental, y PI = 0 indica ningún efecto del compuesto en el comportamiento de alimentación.

8. Limpieza de las cámaras de ensayo

  1. Limpie rápidamente los platos de Petri raspando el sustrato de alimentos y enjuagando con agua y jabón sin aroma. Remoje los platos de Petri durante la noche en agua destilada. Compruebe que el sello divisorio en cada plato todavía está estanco, luego deje que el plato se seque al aire.
    NOTA: Después de asegurarse de que no haya agarose residual o tinción de tinte, las placas Petri están listas para usarse de nuevo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En este ensayo, un plato de 35 mm se dividió en dos compartimentos de alimentación iguales, con cada mitad del plato que contenía alimentos agarose junto con tinte azul o rojo(Figura 1A). Para excluir el sesgo de tinte, las concentraciones de tinte azul y rojo se refinaron cuidadosamente para producir un PI aproximado "0" cuando sólo se añadieron estos dos tintes (Figura 1B). Una vez que la placa de Petri fue cargada con alimentos probados, ~ 70 moscas adultas de 2-4 días de edad de hambre húmeda fueron transferidas al plato, lo que les permite elegir entre las dos opciones de comida en la oscuridad. Después de 90 min, el color abdominal de las moscas fue examinado con un microscopio de disección. Por lo general, el abdomen de la mosca aparece azul o rojo si el animal consume predominantemente alimentos azules o rojos(Figura 2A),respectivamente. Si la mosca consume azul y rojo, su abdomen se vuelve púrpura(Figura 2A).

Las moscas que ingieren cantidades considerables de alimentos fueron puntuadas(Figura 2B),mientras se saltaban las moscas con una ingesta insuficiente de alimentos(Figura 2C). Este ensayo a base de placas de Petri fue comparado con el ensayo a base de placas múltiples. Los resultados muestran que estos dos métodos de alimentación dan esencialmente los mismos resultados en el ensayo de respuestas de alimentación a alimentos dulces, amargos o salados en moscas de tipo salvaje (Figura 3A-C). En particular, es mucho más rápido preparar y distribuir alimentos en la placa De Petri que en el plato multiwell que contiene 60 pozos(Figura 3D). En conjunto, el ensayo basado en placas De Petri es un método de alimentación robusta y rápida que se puede utilizar para determinar rápidamente la preferencia alimentaria por las moscas.

Figure 1
Figura 1: Dispositivo de ensayo de dos opciones y curva de dosificación de tinte. (A) Dos mitades de una placa Petri se utilizan para presentar dos opciones de alimentos diferentes. La mitad del plato contiene comida teñida de azul, y la otra mitad contiene alimentos teñidos de rojo. Las moscas prestadas se colocan en el plato para permitirles consumir cualquier alimento que prefieran. B) Preferencia alimentaria por moscas de tipo salvaje eligiendo entre 1% de agarose más 2 mM de sacarosa que contenga 50 μM de tinte azul o concentraciones variables de tinte rojo. La concentración óptima de colorante rojo es de 210 μM. Los datos representan la media ± error estándar de la media. Para cada punto de datos, n = 6 ensayos. Aproximadamente 70 moscas fueron probadas en cada ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Volar el color abdominal después de comer alimentos azules, rojos o azules y rojos. (A) Imágenes representativas de moscas después de haber ingerido comida azul (arriba a la derecha), comida roja (arriba a la izquierda), o ambos, haciendo que el abdomen parezca púrpura (abajo). (B) Una mosca que muestra suficiente consumo de alimentos azules. (C) Una mosca después de ingerir una pequeña cantidad de comida azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Alimentar las respuestas a diferentes tastants en moscas de tipo salvaje, y el tiempo de carga de alimentos para el dispositivo de alimentación a base de placa de Petri de 60 platos vs Petri. (A) Preferencia alimentaria por moscas de tipo salvaje eligiendo entre 2 mM de sacarosa y sacarosa de 10 mM. n = 12 pruebas, pruebas t delestudiante no aparadas. B) Preferencia alimentaria en moscas de tipo salvaje para alimentos que contengan 2 mM de sacarosa con o sin cafeína de 10 mM. n = 10 pruebas, pruebas tdel estudiante no aparadas. (C) Preferencia alimentaria en moscas de tipo salvaje para alimentos que contengan sacarosa de 2 mM con o sin NaCl de 20 mM. n = 10 pruebas, pruebas tdel estudiante no aparadas. (D) Tiempo dedicado a llenar la comida en un plato de 60 pozos y un plato de Petri. n = 12 platos o platos, *p < 0.0001, sin apaired Student's t-tests. Los datos representan ± abreviaturas sem: n.s. = no estadísticamente significativas; SEM = error estándar de la media; NaCl = cloruro de sodio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este método implica varios pasos cruciales donde pueden producirse problemas. En primer lugar, asegúrese de que las moscas ingieren una cantidad suficiente de alimentos para proporcionar datos estables. Si las moscas comen mal, asegúrese de que las moscas hayan estado hambrientas durante al menos 24 h, y que el medio experimental contenga al menos una concentración mínima de sacarosa (2 mM). Para estimular aún más el consumo de alimentos, prolongue el período de inanición húmeda más allá de las 24 h, dependiendo de la condición fisiológica de las moscas. Si demasiadas moscas no sobreviven a la hambruna prolongada, asegúrese de que se agregue suficiente agua al papel tisú al realizar la inanición húmeda en viales. Evite el agua excesiva que pueda ahogar las moscas. En segundo lugar, las moscas tienden a mostrar sesgo de alimentación hacia el tinte azul o rojo si sus concentraciones no están cuidadosamente equilibradas. Las pequeñas variaciones en la concentración de colorantes pueden tener efectos profundos en la alimentación (Figura 1B). Por lo tanto, para evitar el sesgo de tinte, la concentración de tinte debe ser precisa. Si las moscas están influenciadas por el tinte, refinar cuidadosamente la concentración de tinte a un incremento de 1 μM, y luego probar diferentes combinaciones de tintes para identificar el par de concentración de tinte rojo/azul que produce un PI = 0 cuando no se agrega ningún compuesto experimental excepto una baja concentración de sacarosa (por ejemplo, 2 mM). La concertación óptima de tinte rojo o azul debe reajustarse al probar nuevas líneas de vuelo o después de hacer nuevas existencias de tinte. En tercer lugar, asegúrese de que el ensayo se limite a 90 min. Según un estudio anterior22,la alimentación prolongada puede conducir a la adaptación o desensibilización del gusto.

En comparación con otras técnicas de alimentación, como los ensayos FLIC27 o CAFE25, este ensayo a dos opciones basado en placas Petri tiene las siguientes características y ventajas: (1) Simplicidad: este dispositivo comprende sólo una pequeña placa Petri bisectada con un divisor de plástico. Debido a que los platos y divisores de plástico son baratos y fáciles de montar, todo un experimento requiere sólo una inversión mínima. (2) Conveniencia: el dispositivo basado en placas Petri acelera considerablemente el ensayo de alimentación (Figura 3D). El proceso de puntuación de color también es rápido y sencillo utilizando un microscopio de disección regular. Con este método, la preferencia de sabor de las moscas hacia un ingrediente alimentario en particular se puede probar rápidamente. Por lo tanto, es adecuado tanto para la investigación a pequeña escala como para pantallas genéticas a gran escala. (3) Estabilidad: a diferencia de otros métodos de alimentación que analizan sólo unas pocas moscas en cada dispositivo, este método permite cuantificar las respuestas de alimentación de un gran número de moscas adultas a la vez, lo que minimiza significativamente los efectos de las variaciones de alimentación entre las moscas individuales. Este ensayo de alimentación de dos opciones a base de tintes ha demostrado ser riguroso y reproducible y se ha utilizado para aislar a importantes mutantes de moscas con defectos en la percepción de los gustos y texturas de los alimentos11,22,33.

Como lo demuestran estos resultados, el ensayo basado en placas de Petri produce esencialmente los mismos resultados que el ensayo de alimentación a base de múltiples olas para respuestas de sabor dulces, amargos y salados, aunque el ensayo basado en placas De Petri tiende a tener variaciones más pequeñas(Figura 3A-C). Un paso que consume mucho tiempo del ensayo de alimentación a base de tinte es la descarga de alimentos en la cámara de alimentación. La placa multipocillo, que contiene 60 o más pozos, puede ser laboriosa de instalar debido a la necesidad de cargar con precisión alimentos de agarose derretidos en 60 o más pozos por plato. Es mucho más rápido preparar y cargar alimentos en la placa Petri que en el plato multiwell, ya que la placa Petri contiene sólo dos compartimentos separados(Figura 3D). Por lo tanto, este método basado en placas Petri no sólo mantiene la robustez del ensayo a base de tinte, sino que también reduce significativamente el tiempo y el esfuerzo dedicados en la preparación del ensayo, aumentando significativamente la capacidad y la velocidad del ensayo de alimentación. En consecuencia, se puede emplear fácilmente para analizar un gran número de líneas de vuelo, como en un proyecto de pantalla genética.

Si bien los ensayos basados en tintes proporcionan una vía de estudio de alto rendimiento debido a su simplicidad y velocidad, no pueden capturar información sobre aspectos cuantitativos más detallados de la alimentación, como la duración o el volumen. Para superar este problema, se puede instalar una cámara de alta velocidad por encima del plato, lo que revela información más detallada del proceso de alimentación, como la duración y frecuencia de alimentación en cada cámara. Además, varios otros paradigmas de alimentación se pueden utilizar para complementar los datos recogidos de los experimentos basados en tintes. Los dispositivos de alimentación automática, como el FLIC27 y el detector de actividad y proboscis de mosca (FlyPAD)34,pueden registrar la dinámica temporal de la alimentación. El ensayo CAFE25 o los ensayos de alimentación manual35 pueden medir el volumen de alimentos consumidos. Sin embargo, estos enfoques tienen sus propias advertencias. Por ejemplo, en comparación con la placa Petri o la placa multiwell, los dispositivos de alimentación automática son muy caros de configurar en el laboratorio. Además, cada dispositivo ensayo sólo unas pocas moscas a la vez, por lo que es más vulnerable a la variabilidad en animales individuales. Como el ensayo CAFE se basa en la capacidad de las moscas para maniobrar sus cuerpos hasta el final del tubo capilar que cuelga dentro de la cámara de alimentación, los resultados pueden confundirse con deficiencias motoras no relacionadas con la sensación de sabor.

Aunque otros enfoques son poderosos por derecho propio, los ensayos basados en tintes pueden ser una herramienta más eficiente para descubrir y analizar rápidamente la preferencia alimentaria en las moscas. Además, la configuración de dos opciones se puede integrar con técnicas de vanguardia como optogenética36 para manipular selectiva y agudamente el comportamiento de alimentación de la mosca. Esto se puede hacer usando la mitad del plato para la activación de la luz y la otra mitad como un control inactivo de la luz. La activación directa o la inactivación de neuronas específicas ayuda a determinar si tienen un papel en la regulación de los comportamientos de alimentación. En resumen, estos resultados muestran que el ensayo de alimentación de dos opciones basado en placas de Petri es un método de alimentación rápido y robusto que puede ayudar a los investigadores a analizar el comportamiento de alimentación bajo diferentes estados fisiológicos y metabólicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no declaran conflictos de intereses ni intereses financieros competidores.

Acknowledgments

Los autores quisieran agradecer al Dr. Tingwei Mi por ayudarles a optimizar el ensayo de alimentación de dos opciones. También les gustaría agradecer a Samuel Chan y Wyatt Koolmees por sus comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R03 DC014787 (Y.V.Z.) y R01 DC018592 (Y.V.Z.) y por la Fundación Ambrose Monell.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dish Fisher Scientific 08-772E
Agarose Thomas Scientific C756P56
Clear adhesive Fisher Scientific NC9884114
Conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
Dissection microscope Amscope SM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant Blue Wako Chemical 3844-45-9
Fly CO2 anesthesia setup Genesee Scientfic 59-114/54-104M
Fly incubator with programmable day/night cycle Powers Scientific Inc. IS33SD
Fly lines
Glass dish (microwave-safe)
Kimwipes Fisher Scientific 06-666A
Media storage bottle Fisher Scientific 50-192-9998
Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm
Plastic fly vials Genesee Scientific 32-116
Sucrose Millipore Sigma S9378
Sulforhodamine B Millipore Sigma S9012
Tastant compound of interest
Vortex mixer Benchmark Scientific BV1000
Water bath Fisher Scientific FSGPD05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  2. Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila. Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).
  3. Ueno, K., et al. Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a. Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).
  4. Fujii, S., et al. Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing. Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).
  5. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
  6. Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. Taste perception and coding in Drosophila. Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).
  7. Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. Sugar receptors in Drosophila. Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).
  8. Dus, M., et al. Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila. Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).
  9. Toshima, N., Tanimura, T. Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).
  10. Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man. Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).
  11. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).
  15. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  16. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).
  17. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  18. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  19. Scott, K. Gustatory processing in Drosophila melanogaster. Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).
  20. Freeman, E. G., Dahanukar, A. Molecular neurobiology of Drosophila taste. Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).
  21. Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
  22. Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).
  23. Bantel, A. P., Tessier, C. R. Taste preference assay for adult Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403 (2016).
  24. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
  25. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  26. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024 (2017).
  27. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  28. Yoshihara, M. Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625 (2012).
  29. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  30. Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
  31. Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900 (2018).
  32. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).
  33. Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. The basis of food texture sensation in Drosophila. Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).
  34. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
  35. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8, 87 (2015).
  36. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Tags

Neurociencia Número 168
Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en <em>Drosophila</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid… More

Mack, J. O., Zhang, Y. V. A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila. J. Vis. Exp. (168), e62051, doi:10.3791/62051 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter