Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für einen Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten für Fliegen. Dieser Fütterungstest ist schnell und einfach zu betreiben und eignet sich nicht nur für kleine Laborforschung, sondern auch für Verhaltensbildschirme mit hohem Durchsatz bei Fliegen.
Abstract
Um Lebensmittel mit Nährwert auszuwählen und gleichzeitig den Verzehr schädlicher Stoffe zu vermeiden, benötigen Tiere ein ausgeklügeltes und robustes Geschmackssystem, um ihre Lebensmittelumgebung zu bewerten. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein genetisch traktierbarer Modellorganismus, der weit verbreitet ist, um die molekularen, zellulären und neuronalen Grundlagen der Lebensmittelpräferenz zu entschlüsseln. Um die Präferenz von Fliegenfutter zu analysieren, ist eine robuste Fütterungsmethode erforderlich. Hier wird ein Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten beschrieben, der streng, kostensparend und schnell ist. Der Assay ist Auf Petri-Schale-basist und beinhaltet die Zugabe von zwei verschiedenen Lebensmitteln mit blauem oder rotem Farbstoff zu den beiden Hälften der Schale ergänzt. Dann werden 70 vorverhungerte, 2-4 Tage alte Fliegen in das Gericht gelegt und dürfen für ca. 90 min zwischen blauen und roten Lebensmitteln im Dunkeln wählen. Auf die Untersuchung des Bauches jeder Fliege folgt die Berechnung des Präferenzindex. Im Gegensatz zu Multiwell-Platten benötigt jede Petrischale nur 20 s zum Füllen und spart Zeit und Mühe. Dieser Fütterungstest kann verwendet werden, um schnell festzustellen, ob Fliegen ein bestimmtes Futter mögen oder nicht mögen.
Introduction
Trotz dramatischer Unterschiede in der anatomischen Struktur von Geschmacksorganen zwischen Fliegen und Säugetieren sind die Verhaltensreaktionen der Fliegen auf viele Tastantsubstanzen auffallend ähnlich wie die von Säugetieren. Zum Beispiel bevorzugen Fliegen Zucker1,2,3,4,5,6,7,8, Aminosäuren9,10, und niedriges Salz11, die Nährstoffe anzeigen, aber ablehnen bittere Lebensmittel12,13,14,15, die ungenießbar oder giftig sind. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich Fliegen als ein sehr wertvoller Modellorganismus erwiesen, um das Verständnis vieler grundlegender Fragen im Zusammenhang mit Geschmacksempfinden und Lebensmittelkonsum zu fördern, einschließlich Tastanterkennung, Geschmacktransduktion, Geschmacksplastizität und Fütterungsverordnung16,17,18,19,20. Bemerkenswerterweise haben eine Reihe von Studien gezeigt, dass die Geschmacktransduktion und die neuronalen Schaltkreismechanismen, die der Geschmackswahrnehmung zugrunde liegen, analog zwischen Fruchtfliegen und Säugetieren sind. Daher dient die Fruchtfliege als idealer Versuchsorganismus, der es forschern ermöglicht, evolutionär konservierte Konzepte und Prinzipien aufzudecken, die die Erkennung und den Verzehr von Lebensmitteln im Tierreich regeln.
Um Geschmacksempfinden bei Fliegen zu untersuchen, ist es wichtig, einen schnellen und strengen Test zu etablieren, um die Lebensmittelpräferenz objektiv zu messen. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Fütterungsmethoden, wie färbebasierte Assays11,12,13,21,22,23, die Fly Proboscis Extension Response Assay24, die Capillary Feeder (CAFE) Assay25,26, Der Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC) Assay27und andere kombinatorische Methoden wurden entwickelt, um die Lebensmittelpräferenz und/oder die Nahrungsaufnahme für Fruchtfliegen28,29,30,31quantitativ zu messen. Eines der beliebten Fütterungsparadigmen ist der auf Farbstoffbasierende Zwei-Wahl-Fütterungstest mit entweder einer Multiwell-Mikrotiterplatte12,21,32 oder, wie hier beschrieben, einer kleinen Petrischale11,22 als Futterkammer. Dieser Test basiert auf der Transparenz des Abdomens der Fliege. Während dieses Testes werden fliegende in die Futterkammer gelegt und mit zwei Nahrungsoptionen gemischt mit rotem Farbstoff oder blauem Farbstoff präsentiert. Sobald der Test abgeschlossen ist, fliegen Abdomen erscheinen rot oder blau, je nachdem, welche Nahrung sie konsumiert haben.
Sowohl die Petri-Schale als auch die Futtertests auf Multiwell-Platte-Farbe sind sehr robust und liefern ungefähr die gleichen Ergebnisse. Mit diesen beiden Assays wurden zahlreiche wichtige Entdeckungen und Durchbrüche gemacht, um die sehr diversifizierten Rezeptoren und Zellen zu entschlüsseln, die für die Erfassung von Nahrungsgeschmack und Lebensmitteltextur11,12,21,22,32,33verantwortlich sind. Im färbenbasierten Assay erfordert ein Versuchsschritt, der viel Zeit und Mühe erfordert, die Zubereitung und Verladung von Lebensmitteln in die Futterkammer. Um die Zubereitungs- und Ladezeit der Nahrung zu reduzieren, wurde dieser Test durch den Austausch der Multiwell-Mikrotiterplatte durch eine kleine Petrischale modifiziert, die in zwei gleiche Fächer unterteilt ist. In der Petri-Schale-basierte Assay, zwei verschiedene Lebensmittel mit blauen oder roten Farbstoff ergänzt werden, um die beiden Hälften der Schale hinzugefügt. Dann werden 70 vorverhungerte, 2-4 Tage alte Fliegen in das Gericht gelegt und dürfen für ca. 90 min zwischen blauen und roten Lebensmitteln im Dunkeln wählen. Anschließend wird der Bauch jeder Fliege untersucht und der Präferenzindex (PI) berechnet.
Dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Futter-Assay ist erschwinglich, einfach und schnell. Eine Multiwell-Platte benötigt ca. 110 s zu füllen, während jede Petrischale nur 20 s benötigt. Darüber hinaus erfordert die Multiwell-Platte das Pipettieren kleiner Mengen von Lebensmitteln in eine große Anzahl kleiner Brunnen (z. B. 60 oder mehr Brunnen pro Platte), was erhebliche Präzision und Aufmerksamkeit erfordert. Umgekehrt erfordert der Petri-Dish-basierte Assay nur zwei Aktionen pro Platte. Da der Fütterungstest eine große Anzahl von Replikationen umfassen kann, spart der Petri-Dish-basierte Assay eine nicht triviale Menge an Zeit und Mühe. Dieser Assay liefert Ergebnisse, die denen aus dem multiwell-basierten Assay entsprechen und hat sich als erfolgreich bei der Behandlung vieler grundlegender Fragen in der Geschmackswahrnehmung erwiesen, einschließlich Salzgeschmackcodierung11, Geschmackplastizität modifiziert durch Lebensmittelerfahrung22, und die molekulare Basis der Lebensmitteltextur Sensation33. Zusammenfassend ist dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Assay ein leistungsfähiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Fliegen externe und innere Nährstoffmilieus wahrnehmen, um ein angemessenes Fütterungsverhalten zu entlocken.
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Protocol
1. Montage der Assaykammern
HINWEIS: Während dieses Protokoll die Verwendung einer 35 mm Petrischale beschreibt(Abbildung 1A), kann der gewünschte Effekt mit jedem wasserdichten, glatten Gefäß erzielt werden, das zerkäut und abgedeckt werden kann.
- Zuerst eine 35 mm Petrischale mit Deckelfolie, indem Sie eine Länge aus Kunststoff (5 mm in der Breite und 3 mm Höhe) auf der Mittellinie mit wasserdichtem Klebstoff fixieren und zwei wasserdichte Fächer bilden. Bestätigen Sie, dass die Dichtung vollständig ist, um Leckagen zu vermeiden, die dazu führen können, dass die beiden Lebensmittelsubstrate gemischt werden.
HINWEIS: Verwenden Sie dieses Gerät nach der Montage wieder, solange die Dichtung hält.
2. Zubereitung von Hungerfläschchen
- Bereiten Sie eine ausreichende Anzahl von leeren Kunststoff-Fliegenfläschchen; dann, lose verdichten ein Stück Tissuepapier an der Unterseite. Komprimieren Sie das Tissuepapier so stark, dass es den Raum füllt, aber nicht so sehr, dass es eine dichte Masse bildet.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es keine tiefen Spalten oder Falten im Gewebe gibt, da dies dazu führen kann, dass Fliegen gefangen werden. - Fügen Sie der Durchstechflasche 3 ml reines Wasser hinzu, so dass das Gewebe vollständig gesättigt ist, aber es gibt kein stehendes Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich an der Wand der Durchstechflasche keine großen Tröpfchen überschüssigen Wassers befinden. Alternativ kann das getränkte Papier durch Die Herstellung einer 1% w/v Agar-Lösung (ohne Saccharose) ersetzt werden, indem 5 ml 1% Agarose zu jeder leeren Durchstechflasche hinzugefügt werden und die Agarose bei Raumtemperatur erstarren kann.
3. Nasser Hunger von Fliegen vor dem Experiment
- Initiieren Sie den Hunger 24 h vor dem Zeitpunkt des Experiments. Unter CO 2-Anästhesie fliegen Gruppen von 70, 2-4 Tage alten Fliegen in die vorbereiteten Hungerfläschchen und beschriften jede Durchstechflasche mit dem Genotyp und der Zeit des Hungers.
4. Reagenzien-Setup
- Zubereitung von Farbstoffen
HINWEIS: Vor der Durchführung von Experimenten ist es wichtig, einen vorläufigen Kontrolltest durchzuführen, um die richtigen Konzentrationen von roten und blauen Farbstoffen zu bestimmen.- Für den Kontrolltest, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen für jeden Farbstoff, und führen Sie die Fütterung Assay mit der gleichen Nahrung mit einer anderen Farbe. Verwenden Sie die Ergebnisse, um Zwei-Färbe-Konzentrationen (eine rote, eine blaue) zu identifizieren, die einen PI von 0 ergibt, wenn keine experimentelle Verbindung hinzugefügt wird (siehe Abschnitt 7).
HINWEIS: Zum Beispiel wurde die endgültige blaue Farbstoffkonzentration auf 50 m festgelegt und gegen eine Reihe von roten Farbstoffkonzentrationen getestet. Basierend auf der Roten Farbstoff-Dosierungskurve lag die optimale rote Farbstoffkonzentration bei 210 M, was eine minimale Farbverzerrung ergab (Abbildung 1B). Eine höhere rote Farbstoffkonzentration treibt Fliegen dazu, rote Nahrung zu bevorzugen, während eine niedrigere Konzentration Fliegen dazu treibt, blaue Nahrung zu bevorzugen. Verfeinern Sie sorgfältig die blauen oder roten Farbstoffkonzentrationen in Schritten von 1 m, da Unterschiede dieser Größenordnung und größer die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können.
- Für den Kontrolltest, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen für jeden Farbstoff, und führen Sie die Fütterung Assay mit der gleichen Nahrung mit einer anderen Farbe. Verwenden Sie die Ergebnisse, um Zwei-Färbe-Konzentrationen (eine rote, eine blaue) zu identifizieren, die einen PI von 0 ergibt, wenn keine experimentelle Verbindung hinzugefügt wird (siehe Abschnitt 7).
- Zubereitung von 1% Agarose
- Kombinieren Sie 0,5 g Agarose und 50 ml reines Wasser (oder einige davon) in einem Mikrowellen-sicheren Gefäß. Mikrowelle die Agarose-Lösung, bis sie gelöst, rühren Sie es nach Bedarf.
- Zubereitung anderer Lebensmittelbestandteile
- Lösen Sie jede Lebensmittelkomponente, einschließlich Saccharose und alle experimentellen Verbindungen, in Wasser mit einer 100-fachen oder höheren Konzentration der endgeprüften Konzentration auf.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen jeder Lebensmittelzutat, die 1% Agar zugesetzt wird, sollte 1 ml pro 10 ml geschmolzenem Agar nicht überschreiten. Andernfalls kann die Agarose zu verdünnt sein und nicht entsprechend verfestigen.
- Lösen Sie jede Lebensmittelkomponente, einschließlich Saccharose und alle experimentellen Verbindungen, in Wasser mit einer 100-fachen oder höheren Konzentration der endgeprüften Konzentration auf.
- Zubereitung von Lebensmittelmedien
- Agar, Farbstoff und die gewünschte Versuchsmasse in konischen Polypropylenzentrifugenröhren (15 oder 50 ml) mischen; verwenden Sie Wasser anstelle des experimentellen Tastants in der Kontrollnahrung. Tun Sie dies, während der Agar noch vollständig flüssig ist und gründlich mit einem Wirbelmischer mischen. Bewahren Sie die Schläuche in einem 60 °C-Wasserbad auf, während Sie nicht verwendet werden, um zu verhindern, dass die Agarose aushärtet, bevor sie in Geschirr verteilt wird.
- Zubereitung von Gerichten für das Experiment
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Gerichte vollständig trocken sind, bevor Sie beginnen.- Pipette 1 ml rotes experimentelles Nahrungsmedium in eine Seite der Assayschale(Abbildung 1A); für die gewünschte Anzahl von Gerichten wiederholen. Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis fest (3-5 min), und dann Pipette 1 ml blaue Kontrollfutter in die andere Seite des Geschirrs(Abbildung 1A). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Rot/experimentellen blauen Paar.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Gerichte vollständig eingestellt sind, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Verwenden Sie das Geschirr innerhalb von 30 min.
- Pipette 1 ml rotes experimentelles Nahrungsmedium in eine Seite der Assayschale(Abbildung 1A); für die gewünschte Anzahl von Gerichten wiederholen. Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis fest (3-5 min), und dann Pipette 1 ml blaue Kontrollfutter in die andere Seite des Geschirrs(Abbildung 1A). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Rot/experimentellen blauen Paar.
5. Initiierung des Zwei-Wege-Fütterungs-Assays
- Vorübergehende Lähmung experimentelle fliegenlinien auf Eis, bis keine offensichtlichen motorischen Aktivitäten wie Fliegen und Klettern beobachtet werden. Sobald die Fliegen immobilisiert sind, umkehren Sie vorsichtig die Durchstechflasche und tippen Sie, um alle Fliegen in die Kontrollkammer zu übertragen.
HINWEIS: Kälteschock dauert 3-5 min. Eine längere Exposition gegenüber Kälte kann die Physiologie und Gesundheit der Fliege beeinträchtigen und sollte daher vermieden werden. - Legen Sie die Abdeckung schnell auf die Kammer und legen Sie sie beiseite. Sobald alle Fliegen übertragen sind, bewegen Sie alle Kammern in einen dunklen, geschlossenen Raum. Lassen Sie den Test 90 min laufen.
HINWEIS: Eine dunkle Umgebung minimiert den Einfluss des Sichtweges der Fliege auf das Fütterungsverhalten und entfernt alle Umwelthinweise von außerhalb der Schale.
6. Beenden des Zwei-Wege-Fütterungs-Assays
- Nach 90 min sind die Kammern in einen -20 °C Gefrierschrank überführen, um die Fliegen zu opfern. Zählen Sie nach 1 h die Fliegen.
HINWEIS: Umkehren Sie jede Petrischale, bevor Sie die Schale in den Gefrierschrank legen, um sicherzustellen, dass keine Fliegen auf das Essen eingefroren werden.
7. Zuweisen eines Präferenzindex (PI) zur Bestimmung der Lebensmittelpräferenz
- Untersuchen Sie unter einem Standard-Seziermikroskop die Bauchfarbe der Fliegen in jeder einzelnen Schale. Zählen Sie die Fliegen entweder rot, blau oder lila nach der Farbe ihres Bauches (Abbildung 2A). Zählen Sie die Fliege, wenn ihr Bauch mehr als 50% gefärbt ist, was auf eine robuste Fütterung hinweist (Abbildung 2B). Schließen Sie die Fliege aus, wenn ihr Bauch nur einen winzigen Nahrungsfleck enthält, was auf schlechtes Essen hinweist (Abbildung 2C).
- Nachdem die Anzahl der Fliegen, die blaue, rote oder sowohl blaue als auch rote Lebensmittel essen, gezählt wurde, verwenden Sie die folgende Gleichung, um jeder Petrischale einen Präferenzindex (PI) zuzuweisen:
PI = (Anzahl der Fliegen, die experimentelle Nahrung essen) - (Anzahl der Fliegen, die Kontrollnahrung essen) / (Anzahl der Fliegen, die experimentelle Nahrung essen) + (Anzahl der Fliegen, die Kontrollnahrung essen) + (Anzahl der Fliegen, die beide essen)
PI > 0 gibt eine Präferenz für die experimentelle Verbindung an, PI < 0 zeigt eine Abneigung gegen die versuchsweise Verbindung an, und PI = 0 zeigt keine Auswirkung der Verbindung auf das Fütterungsverhalten an.
8. Reinigung der Assaykammern
- Reinigen Sie die Petrischalen umgehend, indem Sie das Nahrungssubstrat herauskratzen und mit duftender Seife und Wasser ausspülen. Die Petrischalen über Nacht in destilliertem Wasser einweichen. Prüfen Sie, ob die Trenndichtung in jeder Schale noch wasserdicht ist, dann lassen Sie die Tellerluft trocknen.
HINWEIS: Nachdem sichergestellt ist, dass es keine Rest-Agarose- oder Farbstofffärbung gibt, sind die Petri-Gerichte wieder einsatzbereit.
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Representative Results
In diesem Test wurde eine 35-mm-Schale in zwei gleiche Futterfächer unterteilt, wobei jede Hälfte der Schale Agarose-Lebensmittel enthält, die entweder mit blauem oder rotem Farbstoff gekoppelt sind (Abbildung 1A). Um die Farbverzerrung auszuschließen, wurden die blauen und roten Farbstoffkonzentrationen sorgfältig verfeinert, um eine ungefähre "0" PI zu ergeben, wenn nur diese beiden Farbstoffe hinzugefügt wurden (Abbildung 1B). Sobald die Petrischale mit getestetem Essen beladen war, wurden 70 nasshungrige, 2-4 Tage alte erwachsene Fliegen auf das Gericht übertragen, so dass sie zwischen den beiden Speiseoptionen im Dunkeln wählen konnten. Nach 90 min wurde die Bauchfarbe der Fliegen mit einem Seziermikroskop untersucht. Typischerweise erscheint der Fliegenbauch blau oder rot, wenn das Tier überwiegend blaue oder rote Nahrung konsumiert(Abbildung 2A). Wenn die Fliege sowohl blau als auch rot verbraucht, wird ihr Bauch violett (Abbildung 2A).
Die Fliegen, die beträchtliche Mengen an Nahrung aufnehmen, wurden bewertet (Abbildung 2B), während die Fliegen mit unzureichender Nahrungsaufnahme übersprungen wurden (Abbildung 2C). Dieser Aufstinden auf Petri-Schale-Basis wurde mit dem Multiwell-Platten-basierten Assay verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese beiden Fütterungsmethoden im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse bei der Prüfung der Fütterungsreaktionen auf süße, bittere oder salzige Nahrung bei Wildfliegen liefern (Abbildung 3A-C). Bemerkenswert ist, dass es viel schneller ist, Lebensmittel in der Petrischale zuzubereiten und zu verteilen als in der Multiwell-Platte mit 60 Brunnen(Abbildung 3D). Insgesamt ist der Petri-Dish-basierte Assay eine robuste und schnelle Fütterungsmethode, die verwendet werden kann, um schnell die Lebensmittelpräferenz für Fliegen zu bestimmen.
Abbildung 1: Zwei-Wahl-Assay-Gerät und Farbstoff Dosierung Kurve. (A) Zwei Hälften einer Petrischale werden verwendet, um zwei verschiedene Lebensmitteloptionen zu präsentieren. Die eine Hälfte des Tellers enthält blau gefärbte Lebensmittel, die andere Hälfte rot gefärbte Lebensmittel. Vorverhungerte Fliegen werden in das Gericht gelegt, damit sie das Essen konsumieren können, das sie bevorzugen. (B) Lebensmittelpräferenz für Wildfliegen, die zwischen 1% Agarose plus 2 mM Saccharose wählen, die entweder 50 m blauer Farbstoff oder unterschiedliche Konzentrationen von rotem Farbstoff enthält. Die optimale Rote-Farbstoff-Konzentration liegt bei 210 m. Daten stehen für mittelmäßig± Standardfehler des Mittelwerts. Für jeden Datenpunkt n = 6 Versuche. In jeder Studie wurden etwa 70 Fliegen getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fliegen Sie die Bauchfarbe nach dem Essen blauer, roter oder blauer und roter Lebensmittel. (A) Repräsentative Bilder von Fliegen nach der Verzehrung von blauem Essen (oben rechts), rote Nahrung (oben links), oder beides, so dass der Bauch lila erscheinen (unten). (B) Eine Fliege, die einen ausreichenden Verzehr von blauen Lebensmitteln zeigt. (C) Eine Fliege nach der Einnahme einer kleinen Menge blauer Nahrung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fütterungsreaktionen auf verschiedene Tastanten in Wildfliegen und die Verladezeit für die 60-Well-Platte vs Petri-Dish-basierte Fütterungsvorrichtung. (A) Nahrungspräferenz für Wildfliegen, die zwischen 2 mM Saccharose und 10 mM Saccharose wählen. n = 12 Versuche, ungepaarte Schüler-t-Tests. (B) Lebensmittelpräferenz bei Wildfliegen für Lebensmittel, die 2 mM Saccharose mit oder ohne 10 mM Koffein enthalten. n = 10 Versuche, ungepaarte Schüler-t-Tests. (C) Lebensmittelpräferenz bei Wildfliegen für Lebensmittel mit 2 mM Saccharose mit oder ohne 20 mM NaCl. n = 10 Versuche, ungepaarte Schüler-t-Tests. (D) Zeit verbrachte Füllung Lebensmittel in eine 60-Well-Platte und eine Petrischale. n = 12 Teller oder Teller, *p < 0,0001, ungepaarte Schüler-t-Tests. Daten stehen für mittelwert ± SEM. Abkürzungen: n.s. = nicht statistisch signifikant; SEM = Standardfehler des Mittelwerts; NaCl = Natriumchlorid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Methode umfasst mehrere entscheidende Schritte, bei denen Probleme auftreten können. Stellen Sie zunächst sicher, dass Fliegen eine ausreichende Menge an Nahrung aufnehmen, um stabile Daten bereitzustellen. Wenn Fliegen schlecht essen, stellen Sie sicher, dass die Fliegen mindestens 24 h nass verhungert sind und dass die experimentellen Medien mindestens eine minimale Saccharosekonzentration (2 mM) enthalten. Um den Verzehr von Lebensmitteln weiter anzukurbeln, verlängern Sie die Nasshungerzeit über 24 h, abhängig vom physiologischen Zustand der Fliegen. Wenn zu viele Fliegen den längeren Hunger nicht überleben, stellen Sie sicher, dass dem Gewebepapier beim Nasshunger in Fläschchen genügend Wasser zugesetzt wird. Vermeiden Sie übermäßiges Wasser, das die Fliegen ertränken kann. Zweitens neigen Fliegen dazu, eine Fütterungsneigung zu blauem oder rotem Farbstoff zu zeigen, wenn ihre Konzentrationen nicht sorgfältig ausbalanciert sind. Kleine Variationen der Farbstoffkonzentration können tiefgreifende Fütterungseffekte haben (Abbildung 1B). Um farbliche Verzerrungen zu verhindern, sollte die Farbstoffkonzentration präzise sein. Wenn Fliegen durch den Farbstoff beeinflusst werden, verfeinern Sie die Farbstoffkonzentration vorsichtig in einem Inkrement von 1 m, und testen Sie dann verschiedene Farbstoffkombinationen, um das rot-blaue Farbstoffkonzentrationspaar zu identifizieren, das ein PI = 0 ergibt, wenn keine experimentelle Verbindung außer einer geringen Konhierrosekonzentration (z. B. 2 mM) zugegeben wird. Die optimale Rote oder Blaue Farbstoffabstimmung sollte beim Testen neuer Fliegenlinien oder nach der Herstellung neuer Farbstoffbestände nachjustiert werden. Drittens, stellen Sie sicher, dass der Test auf 90 min beschränkt ist. Nach einer früheren Studie22kann eine längere Fütterung zu Geschmacksanpassung oder Desensibilisierung führen.
Im Vergleich zu anderen Fütterungstechniken, wie FLIC27 oder CAFE25 Assays, hat dieser Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Assay die folgenden Eigenschaften und Vorteile: (1) Einfachheit: Dieses Gerät besteht nur aus einer kleinen Petrischale, die mit einem Kunststoffteiler zerkleinert ist. Da die Teller und Kunststoffteiler kostengünstig und einfach zu montieren sind, erfordert ein ganzes Experiment nur minimale Investitionen. (2) Expedienz: Das auf Petri-Dish basierende Gerät beschleunigt den Fütterungstest erheblich (Abbildung 3D). Der Farb-Scoring-Prozess ist auch schnell und unkompliziert mit einem regelmäßigen Seziermikroskop. Mit dieser Methode kann die Geschmackspräferenz der Fliegen gegenüber einer bestimmten Lebensmittelzutat schnell getestet werden. Somit eignet es sich sowohl für kleine Forschung als auch für groß angelegte genetische Bildschirme. (3) Stabilität: Im Gegensatz zu anderen Fütterungsmethoden, die nur wenige Fliegen in jedem Gerät analysieren, ermöglicht diese Methode die Quantifizierung der Fütterungsreaktionen für eine große Anzahl von erwachsenen Fliegen gleichzeitig, was die Auswirkungen von Fütterungsschwankungen zwischen einzelnen Fliegen erheblich minimiert. Dieser auf Farbstoffen basierende Fütterungstest mit zwei Wahlmöglichkeiten hat sich als streng und reproduzierbar erwiesen und wurde verwendet, um wichtige Fliegenmutanten mit Defekten bei der Wahrnehmen von Lebensmittelgeschmack und -texturen zu isolieren11,22,33.
Wie diese Ergebnisse zeigen, liefert der Aufdernässer auf Petri-Schale-Basis im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie der multiwellbasierte Fütterungstest für süße, bittere und salzige Geschmacksreaktionen, obwohl der Aufschäumer auf Petrischale basierende Assay tendenziell kleinere Variationen aufweist (Abbildung 3A-C). Ein zeitaufwändiger Schritt des färbenbasierten Fütterungstestes ist die Einleitung von Lebensmitteln in die Futterkammer. Die Multiwell-Platte, die 60 oder mehr Brunnen enthält, kann mühsam aufgebaut werden, da geschmolzene Agarose-Lebensmittel präzise in 60 oder mehr Brunnen pro Platte geladen werden müssen. Es ist viel schneller, Lebensmittel in der Petrischale zuzubereiten und zu laden als in der Multiwell-Platte, da die Petrischale nur zwei separate Fächer enthält(Abbildung 3D). Somit hält diese Petri-Dish-basierte Methode nicht nur die Robustheit des färbenbasierten Assays aufrecht, sondern reduziert auch den Zeit- und Aufwand für die Assayzubereitung erheblich, wodurch die Kapazität und Geschwindigkeit des Fütterungstests deutlich erhöht wird. Folglich kann es leicht verwendet werden, um eine große Anzahl von Fluglinien zu analysieren, z. B. in einem genetischen Bildschirmprojekt.
Während farbbasierte Assays aufgrund ihrer Einfachheit und Geschwindigkeit einen hohen Durchsatz bieten, können sie keine Informationen über detailliertere quantitative Aspekte der Fütterung wie Dauer oder Volumen erfassen. Um dieses Problem zu lösen, kann eine Hochgeschwindigkeitskamera über der Schale installiert werden, die detailliertere Informationen über den Fütterungsprozess anzeigt, wie z. B. die Fütterungsdauer und -häufigkeit in jeder Kammer. Darüber hinaus können mehrere andere Fütterungsparadigmen verwendet werden, um die aus den färbebasierten Experimenten gesammelten Daten zu ergänzen. Automatische Zuführvorrichtungen wie der FLIC27 und der Fliegenproboscis und aktivitätsdetektor (FlyPAD)34können die zeitliche Dynamik der Fütterung aufzeichnen. Der CAFE Assay25 oder manuelle Fütterungstests35 können die Menge der verbrauchten Lebensmittel messen. Dennoch haben diese Ansätze ihre eigenen Vorbehalte. Im Vergleich zur Petrischale oder der Multiwell-Platte sind automatische Zuführgeräte beispielsweise sehr teuer, um sie im Labor einzurichten. Darüber hinaus zeigt jedes Gerät nur wenige Fliegen gleichzeitig, wodurch es anfälliger für Variabilität bei einzelnen Tieren wird. Da der CAFE-Assay auf die Fähigkeit der Fliegen beruht, ihren Körper bis zum Ende des kapillaren Rohres zu manövrieren, das in der Futterkammer hängt, können die Ergebnisse durch motorische Beeinträchtigungen verwirrt werden, die nichts mit geschmacklichem Empfinden zu tun haben.
Obwohl andere Ansätze an sich mächtig sind, können farbbasierte Assays ein effizienteres Werkzeug sein, um Lebensmittelpräferenzen bei Fliegen schnell zu entdecken und zu analysieren. Darüber hinaus kann das Zwei-Wahl-Setup mit modernsten Techniken wie der Optogenetik36 integriert werden, um das Fütterungsverhalten der Fliege selektiv und akut zu manipulieren. Dies kann mit der einen Hälfte der Schale für die Lichtaktivierung und der anderen Hälfte als lichtinaktive Steuerung erfolgen. Die direkte Aktivierung oder Inaktivierung bestimmter Neuronen hilft zu bestimmen, ob sie eine Rolle bei der Regulierung des Fütterungsverhaltens spielen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass der Petri-Dish-basierte Zwei-Wahl-Fütterungstest eine schnelle und robuste Fütterungsmethode ist, die Forschern helfen kann, das Fütterungsverhalten unter verschiedenen physiologischen und metabolischen Zuständen zu analysieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte oder konkurrierende finanzielle Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Tingwei Mi für die Unterstützung bei der Optimierung des Fütterungsassays mit zwei Wahlmöglichkeiten. Sie möchten auch Samuel Chan und Wyatt Koolmees für ihre Kommentare zum Manuskript danken. Dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health Grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) und R01 DC018592 (Y.V.Z.) und der Ambrose Monell Foundation finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
References
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