Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تلطيخ التألق المناعي بالكامل ، والتصوير البؤري وإعادة البناء 3D للعقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في الماوس

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/62058
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

ERRATUM NOTICE

Summary

نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتلطيخ التألق المناعي الكامل للعقدة الجيبية الأذينية (SAN) والعقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلوب الفئران.

Abstract

يتم إجراء الإشارة الكهربائية التي تولدها خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من خلال نظام التوصيل ، والذي يتضمن العقدة الأذينية البطينية (AVN) ، للسماح بإثارة وتقلص القلب كله. أي خلل في SAN أو AVN يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب ، مما يشير إلى دورهم الأساسي في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب. تستخدم نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث عدم انتظام ضربات القلب ، لكن التحقيق المحدد في SAN و AVN لا يزال يمثل تحديا.

يقع SAN عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ويقع AVN في قمة مثلث كوخ ، الذي يتكون من فتحة الجيب التاجي ، والحلقة ثلاثية الشرف ، ووتر تودارو. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها ، لا يزال التصور بواسطة الأنسجة التقليدية يمثل تحديا ولا يسمح بدراسة SAN و AVN داخل بيئة 3D الخاصة بهم.

هنا نصف نهج التألق المناعي الكامل الذي يسمح بالتصور المحلي للماوس المسمى SAN و AVN. تم تصميم تلطيخ التألق المناعي بالكامل للأقسام الأصغر من الأنسجة دون الحاجة إلى التقسيم اليدوي. لهذا الغرض ، يتم تشريح قلب الفأر ، مع إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها ، تليها التثبيت والنفاذية والحجب. ثم يتم تلطيخ خلايا نظام التوصيل داخل SAN و AVN بجسم مضاد ل HCN4. يسمح الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ومعالجة الصور بالتمايز بين الخلايا العقدية وخلايا عضلة القلب العاملة ، وتحديد موقع SAN و AVN بوضوح. علاوة على ذلك ، يمكن دمج أجسام مضادة إضافية لتسمية أنواع الخلايا الأخرى أيضا ، مثل الألياف العصبية.

بالمقارنة مع الأنسجة المناعية التقليدية ، يحافظ تلطيخ التألق المناعي الكامل على السلامة التشريحية لنظام التوصيل القلبي ، مما يسمح بالتحقيق في التنخر اللاوعائي. خاصة في تشريحها وتفاعلاتها مع عضلة القلب العاملة المحيطة والخلايا غير العضلية.

Introduction

عدم انتظام ضربات القلب هي أمراض شائعة تؤثر على الملايين من الناس ، وهي سبب المراضة والوفيات الكبيرة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من التقدم الهائل في العلاج والوقاية ، مثل تطوير أجهزة تنظيم ضربات القلب ، لا يزال علاج عدم انتظام ضربات القلب يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى المعرفة المحدودة للغاية فيما يتعلق بآليات المرض الأساسية1،2،3. قد يساعد الفهم الأفضل لكل من الفيزيولوجيا الكهربية الطبيعية والفيزيولوجيا المرضية لعدم انتظام ضربات القلب في تطوير استراتيجيات علاج جديدة ومبتكرة وسببية في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، لدراسة عدم انتظام ضربات القلب بشكل شامل ، من المهم توطين وتصور نظام التوصيل القلبي المحدد في النماذج الحيوانية مثل الفأر ، حيث تستخدم الفئران على نطاق واسع في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية.

الأجزاء الرئيسية لنظام التوصيل القلبي هي العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ، حيث يتم توليد النبضة الكهربائية في خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب المتخصصة ، والعقدة الأذينية البطينية (AVN) ، وهي الوصلة الكهربائية الوحيدة بين الأذينين والبطينين4. عندما يتم تغيير الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ل SAN و AVN ، يمكن أن يحدث عدم انتظام ضربات القلب مثل متلازمة الجيوب الأنفية المريضة أو الكتلة الأذينية البطينية مما قد يؤدي إلى تدهور الدورة الدموية والإغماء وحتى الموت ، وبالتالي التأكيد على الدور الأساسي لكل من SAN و AVN في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب5.

تتطلب الدراسات الشاملة حول SAN أو AVN توطينا وتصورا دقيقا لكلا الهيكلين ، من الناحية المثالية داخل بيئتهما الفسيولوجية. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها وموقعها داخل عضلة القلب العاملة ، دون إنشاء بنية واضحة مرئية مجهريا ، فإن دراسة علم التشريح والفيزيولوجيا الكهربية ل SAN و AVN أمر صعب. يمكن استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة التي تحتوي على SAN و AVN6،7،8 تقريبا. باختصار ، يقع SAN في المنطقة بين الأجوف من الأذين الأيمن المجاور لمحطة crista العضلية (CT) ، ويقع AVN داخل مثلث كوخ الذي أنشأه الصمام ثلاثي الشرف ، وعظم الجيب التاجي ووتر تودارو. حتى الآن ، تم استخدام هذه المعالم التشريحية بشكل أساسي لتحديد وإزالة ثم دراسة SAN و AVN كهياكل فردية (على سبيل المثال ، بواسطة الأنسجة التقليدية). لفهم أفضل الفيزيولوجيا الكهربية المعقدة ل SAN و AVN (على سبيل المثال ، التأثيرات التنظيمية للخلايا المجاورة لعضلة القلب العاملة) ، ومع ذلك ، من الضروري دراسة أنظمة التوصيل داخل بيئة 3D الفسيولوجية.

تلطيخ التألق المناعي الكامل هو طريقة تستخدم لدراسة الهياكل التشريحية في الموقع مع الحفاظ على سلامة الأنسجة المحيطة9. من خلال الاستفادة من الفحص المجهري متحد البؤر وبرنامج تحليل الصور ، يمكن تصور SAN و AVN باستخدام أجسام مضادة موسومة بالفلورسنت تستهدف القنوات الأيونية المعبر عنها بشكل خاص في هذه المناطق.

يشرح هذا البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لتنفيذ طريقة تلطيخ مثبتة بالكامل راسخة لتوطين مجهر SAN و AVN وتصوره. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) توطين SAN و AVN بواسطة المعالم التشريحية لإعداد هذه العينات للتلوين والتحليل المجهري (2) لإجراء تلطيخ التألق المناعي بالكامل للعلامات المرجعية HCN4 و Cx43 (3) لإعداد عينات SAN و AVN للفحص المجهري متحد البؤر (4) لإجراء تصوير متحد البؤر ل SAN و AVN. كما نصف كيف يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل تلطيخا إضافيا لعضلة القلب العاملة المحيطة أو الخلايا غير العضلية مثل الألياف العصبية المستقلة التي تسمح بإجراء فحص شامل لنظام التوصيل القلبي داخل القلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة ميونيخ ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران من قبل حكومة بافاريا ، ميونيخ ، ألمانيا (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106 ، ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). تم شراء الفئران C57BL6 / J من مختبر جاكسون.

ملاحظة: يوضح الشكل 1 الأدوات اللازمة للتجربة. يوضح الشكل 2 توضيحا للتشريح القلبي الإجمالي. يوضح الشكل 3 موقع SAN و AVN في قلب فأر بالغ. يوضح الشكل 4 العينة المعدة المحملة على الفحص المجهري متحد البؤر.

1. الاستعدادات

  1. تحضير محلول فورمالديهايد 4٪ (4٪ PFA) عن طريق تخفيف 10 مل من محلول الفورمالديهايد 16٪ في 30 مل من PBS.
  2. تحضير محلول سكروز 15٪ ومحلول سكروز 30٪ عن طريق إذابة 15 جم و 30 جم من مسحوق السكروز في 100 مل PBS ، على التوالي. بعد إذابة مسحوق السكروز بالكامل ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر قبل التخزين عند 4 درجات مئوية.
  3. تحضير 3٪ -4٪ هلام الأغاروز ، إضافة 3 غرام أو 4 غرام مسحوق الأغاروز و 100 مل من 1x TAE (مخفف من محلول مخزون 50x TAE) في دورق. ضع الدورق على محرك مغناطيسي واغليه حتى يذوب الأغاروز تماما.
  4. تحضير طبق التشريح عن طريق صب بلطف 30 مل من هلام الأغاروز (3٪ -4٪) في طبق بتري قطره 100 مم. اترك طبق بتري على المقعد في درجة حرارة الغرفة ليبرد ويتصلب.
  5. تحضير محلول الحجب ومحلول الغسيل وفقا للوصفات الواردة في الجدول 1. قم بإعداد جميع الحلول المعدة في يوم الاستخدام. لا ينصح التخزين على المدى الطويل.
  6. قم بإعداد محاليل الأجسام المضادة عن طريق تخفيفها في 1x PBS بارد (4 °C) ، وحماية التخفيف من الضوء (على سبيل المثال ، عن طريق لف رقائق الألومنيوم حولها) والحفاظ على التخفيفات على الجليد حتى يتم استخدامها. تمييع الأجسام المضادة قبل فترة وجيزة من الحضانة. تجنب ترك الأجسام المضادة المخففة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب اختبار تخفيف الأجسام المضادة المناسب بعينات أنسجة قابلة للمقارنة عن طريق إجراء تلطيخ مناعي تقليدي. هنا ، اختبرنا الأجسام المضادة عن طريق تلطيخ المقاطع المجمدة المقطوعة بسمك 10 ميكرومتر.

2. حصاد الأعضاء وإعداد الأنسجة

  1. تخدير الفأر عن طريق وضعه في غرفة حضانة متصلة بمبخر إيزوفلوران. اضبط المرذاذ لتوصيل 4-5٪ إيزوفلوران (96-95٪ أكسجين ، على التوالي).
    ملاحظة: يتم تأكيد التخدير الكامل من خلال فقدان رد الفعل الوضعي وتصحيح المنعكس عن طريق لف الحجرة برفق حتى يتم وضع الماوس على ظهره.
  2. ضع الماوس في وضع ضعيف على طاولة الجراحة. ضع أنف الفأر في قناع تخدير متصل بدائرة Bain معدلة مع أنبوبها الداخلي المتصل بمبخر isoflurane. للحفاظ على التخدير ، استخدم 1-2٪ إيزوفلوران في الأكسجين بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة. تخلص من بخار التخدير الزائد من الماوس عبر الأنبوب الخارجي للقناع واسحبه من خلال علبة من الفحم المنشط ، الذي يمتص غاز التخدير الزائد.
  3. عند تحقيق التخدير الكامل ، حقن الفنتانيل للتسكين (0.1 μجم / 25 جم من وزن الجسم i.p.).
  4. عندما لا يمكن اكتشاف منعكس قرصة إصبع القدم ، قم بعمل قطع واضح من jugulum إلى الارتفاق باستخدام مقص القزحية لإزالة الفراء والجلد. قم بعمل قطع آخر من اليسار إلى اليمين تحت الضلوع باستخدام مقص القزحية لفتح البطن بعناية.
  5. حياة الخنجري قليلا باستخدام ملقط منحني للسماح بقطع الحجاب الحاجز من اليسار إلى اليمين دون إصابة أي أعضاء. قطع القفص الصدري في خط إبطي وسطي على كلا الجانبين باستخدام مقص القزحية لقلبه بشكل قحفي وللسماح بالوصول إلى القلب.
  6. قطع الوريد الأجوف السفلي ونزول الشريان الأورطي الصدري على مستوى الحجاب الحاجز باستخدام مقص القزحية. ثقب القلب بإبرة 27 G في منطقة القمة ثم دفع الإبرة بعناية في البطين الأيسر (LV). قم بحقن 5-10 مل من برنامج تلفزيوني مثلج برفق في LV لتخلل القلب.
    ملاحظة: يجب أن يتحول لون القلب من الأحمر إلى الرمادي مما يشير إلى نجاح التروية مع برنامج تلفزيوني.
  7. ارفع قمة القلب بعناية باستخدام ملقط يسمح بقطع الأوعية الكبيرة وإزالة القلب.
  8. استئصال القلب عن طريق قطع الشرايين والأوردة الكبيرة بعيدا عن القلب قدر الإمكان لتجنب أي ضرر للوريد الأجوف العلوي (SVC). حافظ على SVC لأنه سيكون بمثابة معلم مهم أثناء المعالجة اللاحقة.
  9. بعد إزالة القلب ، قم بإيقاف تشغيل مبخر إيزوفلوران.
  10. ضع القلب في طبق تشريح مملوء بالجليد البارد PBS تحت مجهر التشريح. بعد تحديد اليسار / اليمين والأمامي / الخلفي للقلب ، أدر القلب مع الجزء الأمامي من القلب في أسفل الطبق (لفضح الأوعية الكبيرة الموجودة في الخلف).
  11. شل حركة القلب عن طريق وضع دبابيس صغيرة من خلال القمة والزائدة الأذينية اليسرى (LAA) في الأغاروز في الجزء السفلي من طبق التشريح (الشكل 2 أ). باستخدام ملاقط ومقص دقيق ، قم بإزالة الأنسجة غير القلبية بعناية حول SVC والوريد الأجوف السفلي (IVC) (على سبيل المثال ، الرئتين والدهون والتأمور) لكشف المنطقة بين الأجوف (الشكل 3 أ).
  12. قم بإزالة غالبية البطينين عن طريق قطع الأخدود بين البطينين والأذينين بالتوازي مع المقص الدقيق. الحفاظ على جزء صغير من أنسجة البطين للتحميل في وقت لاحق على حلقة زجاج شبكي.
  13. للتثبيت والجفاف ، ضع العينة (التي تحتوي على الأذينين و SVC و IVC) في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  14. في اليوم التالي ، انقل القلب إلى محلول سكروز 15٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  15. في اليوم التالي ، انقل القلب إلى محلول سكروز 30٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة للتثبيت والجفاف في الخطوة 2.13 و 2.14 و 2.15 ، تترك العينات عند 4 درجات مئوية دون مزيد من التحريك أو التأرجح.

3. تلطيخ المناعي الكامل

  1. اغسل القلب في 1٪ Triton X-100 المخفف في PBS وكتل ونفاذه في محلول مانع (الجدول 1) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. ضع القلب في أنبوب سعة 1.5 مل واحتضنه بأرنب مضاد للفأر connexin-43 (تخفيف 1: 200) وأجسام مضادة للفأر HCN4 (تخفيف 1: 200) مخففة بمحلول مانع لمدة 7 أيام عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب اختبار التركيز الأمثل للأجسام المضادة الأولية قبل استخدام أوراق البيانات كاتجاه. يمكن أيضا تلطيخ مولدات الضد الأخرى المثيرة للاهتمام في هذه الخطوة ، طالما أن الأنواع المضيفة لمولد الضد الأولي تختلف عن الأنواع الأخرى. قد يساعد التركيز العالي ل Triton X-100 في الحصول على تلطيخ أكثر كفاءة بالأجسام المضادة كما هو موضح قبل10 ، ولكن قد يتم تحديد التركيز بشكل فردي.
  3. بعد 7 أيام ، قم بإزالة المحلول الذي يحتوي على أجسام مضادة أولية باستخدام ماصةوغسل القلب بمحلول Triton X-100 1٪ 3 مرات (في كل مرة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري).
  4. بعد الغسيل ، احتضان القلب = مع Alexa Fluor 488 الماعز المضادة للفئران IgG (تخفيف 1: 200) و Alexa Fluor 647 الماعز المضادة للأرانب IgG (تخفيف 1: 200) لمدة 7 أيام عند 4 درجات مئوية.
  5. بعد 7 أيام ، قم بإزالة كل المحلول الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية باستخدام ماصة. ثم اغسل القلب باستخدام محلول الغسيل (الجدول 1) 3 مرات (في كل مرة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري).
  6. لتلطيخ النواة ، احتضان القلب في محلول DAPI (10 ميكروغرام / مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  7. في اليوم التالي ، اغسل القلب بمحلول الغسيل 3 مرات (في كل مرة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري).
    ملاحظة: بالنسبة للحجب والنفاذية وحضانة الأجسام المضادة وتلطيخ DAPI في الخطوة 3.1 و 3.2 و 3.4 و 3.6 ، اترك العينات في حالة مستقرة في 4 درجات مئوية ، دون الحاجة إلى التحريك. يمكن الحفاظ على الأنسجة الملطخة مغطاة بالكامل بمحلول الغسيل عند 4 درجات مئوية وحمايتها من الضوء لبضعة أيام حتى التصوير في المجهر متحد البؤر.

4. المجهر متحد البؤر

  1. تحضير حلقات زجاج شبكي وملء مع البلاستيسين (الشكل 1). في وسط البلاستيسين يتم تشكيل أخدود صغير في الوسط لتحميل القلب. اصنع أخدودا ضحلا ، حيث سيكون من الأسهل الحصول على مستوى تصوير مسطح ، وضبط المساحة وتجنب فقاعات الهواء بين العينة وأغطية الغطاء في الخطوة 4.4.
  2. استخدم نفس عينة القلب لتصوير كل من SAN و AVN بالتتابع. بالنسبة لتصوير SAN ، قم بتحميل القلب مباشرة بينما بالنسبة للتصوير اللاوعائي ، قم بإجراء تشريح مجهري من قبل.
    1. تصوير SAN
      1. تحديد SAN من خلال المعالم التشريحية: يقع على الجانب الظهري من القلب داخل المنطقة بين الأجوف (المنطقة الواقعة بين الوريد الأجوف العلوي والسفلي). الكريستا الطرفية (CT) هي خط العضلات بين SAN و RAA.
      2. ضع القلب في أخدود البلاستيسين بحيث يكون الجزء الخلفي من القلب متجها لأعلى. أضف PBS إلى القلب لإزاحة كل الهواء داخل التجويف حتى يتم تغطية القلب بالكامل ب PBS (عادة ما تكون بضع قطرات من PBS كافية).
      3. تحت مجهر التشريح ، اضغط برفق على RAA و LAA والأجزاء المتبقية من البطين الأيسر في البلاستيسين لإصلاح القلب. تأكد من أن المنطقة الكاملة بين الأجوف ومحطة crista يمكن رؤيتها بوضوح (لا تغطيها البلاستيسين). تظهر المنطقة التي سيتم تصويرها في الشكل 3 أ.
    2. التصوير اللاوعائي
      1. بعد الانتهاء من تصوير SAN ، تذكر نفس العينة واستخدامها لاحقا للتصوير AVN. للتشريح المجهري اللاوعائي ، ضع القلب = على طبق تشريح تحت مجهر التشريح.
      2. قم بتوجيه القلب بحيث يكون الجانب الأيمن متجها لأعلى (بما في ذلك الأجزاء المتبقية من البطين الأيمن). ضع دبابيس من خلال الجزء المتبقي من الجدار الخالي من الجهد المنخفض (الموجود الآن في الأسفل) لشل حركة الأنسجة (الشكل 2 ب).
      3. اقطع الجدار المتبقي الخالي من المركبات الترفيهية لأعلى من خلال الصمام ثلاثي الشرف والوريد الأجوف العلوي. ثم اقلب RV و RA بعيدا لفضح الحاجز بين البطينين وبين الأذينين. (الشكل 3 ب)
        ملاحظة: انتبه إلى عدم إتلاف الجيب التاجي (CS) ، لأنه معلم تشريحي مهم للعثور على مثلث كوخ الذي يسمح بعد ذلك بتحديد موقع التنخر اللاوعائي. يمتد CS بشكل مستعرض في الأخدود الأذيني البطيني الأيسر على الجانب الخلفي من القلب ، وتقع فتحة CS بين IVC والصمام ثلاثي الشرف في الجزء السفلي من الحاجز بين الأذينين (الشكل 3A و B).
      4. حدد مثلث كوخ الذي يمكن العثور عليه على سطح الشغاف للأذين الأيمن ، ويحده من الأمام الخط المفصلي لنشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف (TV) ، وخلفيا وتر تودارو. تتكون القاعدة من فتحة الجيب التاجي (الشكل 3 ب). نظرا لأن هذه هي المنطقة المستهدفة لتصوير AVN ، فيجب أن تكون مرئية بوضوح.
      5. انقل القلب إلى أخدود البلاستيسين داخل حلقة زجاج شبكي مع تعرض مثلث كوخ بوضوح (أي غير مغطى بالبلاستيسين). اضغط برفق على الأنسجة حول مثلث كوخ في البلاستيسين لإصلاح العينة. أضف PBS إلى القلب لإزاحة كل الهواء داخل التجويف حتى يتم تغطية القلب بالكامل ب PBS (عادة ما تكون بضع قطرات من PBS كافية).
  3. ضع السيليكون على حواف حلقات زجاج شبكي للسماح بتغطية القلوب المحملة داخل حلقات زجاج شبكي مملوءة بالبلاستيك مع زلات غطاء.
  4. اضغط برفق على الجانب الخلفي من البلاستيسين للضغط على أجزاء من PBS وربط القلب بغطاء الغطاء مع تجنب أي فقاعات هواء داخل منطقة التصوير.
    ملاحظة: تأكد من عدم طي المناطق ذات الأهمية وتغطيتها أثناء الضغط على الجانب الخلفي من البلاستيسين. يعد مستوى التصوير المسطح بدون الضغط الزائد للعينة ضروريا للحفاظ على التشريح وللتصوير البؤري المناسب للعينات. بالنسبة ل SAN ، من المهم التأكد من أن المنطقة بين الفجوات مكشوفة بوضوح. بالنسبة ل AVN ، يجب أن يكون مثلث كوخ مكشوفا بالكامل.
  5. ضع عينات تلطيخ التثبيت بالكامل رأسا على عقب على منصة المجهر متحد البؤر. يوجد SAN / AVN المكشوف المتصل بزلة الغطاء الآن في الجزء السفلي من منصة المجهر (الشكل 4).
    ملاحظة: لالتقاط الصور ، نستخدم Carl Zeiss LSM800 مع وحدة Airyscan وبرنامج ZEN 2.3 SP1 الأسود.
  6. اختر لوحة "BP420-480 + LP605" لإثارة Alexa Fluor 647 المترافق المضاد ل HCN4. تختلف كسب سيد من 650-750.
  7. التقط صورة عامة لمنطقة SAN وAVN بالكامل باستخدام وظيفة Tile Scan . ثم حدد المنطقة الإيجابية HCN4 بالنقر فوق وإضافة مربع على صورة النظرة العامة حول منطقة الاهتمام التي سيتم مسحها ضوئيا.
  8. تحقق من المعلمات ، بما في ذلك الألواح والكسب الرئيسي للقنوات المتبقية (Alexa Fluor 488 و DAPI) للمجهر متحد البؤر واضبطها كما هو موضح في الخطوة 4.6.
  9. اضبط التركيز ببطء من أعلى إلى أسفل العينة لمعاينة العينة بأكملها ولتعيين الأول والأخير لنطاق Z-stack. اضبط الفاصل الزمني الأمثل ل Z-stack بناء على سمك العينة البصرية. نستخدم هدفا 20x ، و 0.8-1 ميكرومتر كفاصل زمني ل Z-stack.
  10. بعد تعيين جميع المعلمات بشكل صحيح ، قم بمسح المنطقة بأكملها من SAN و AVN.
  11. إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للصور باستخدام البرنامج (على سبيل المثال ، الإصدار 8.4.2 من Imaris).
    1. حدد معالجة الصور | الطرح الأساسي لإزالة تلطيخ الخلفية.
    2. حدد إنشاء السطح على الإعداد للقناة المحددة والمنطقة محل الاهتمام للمعالجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، يمكن إجراء التصوير المجهري متحد البؤر لكل من SAN و AVN بشكل موثوق. يسمح التلوين المحدد لنظام التوصيل باستخدام الأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف HCN4 وتلطيخ عضلة القلب العاملة باستخدام الأجسام المضادة الفلورية التي تستهدف Cx43 بتحديد واضح ل SAN (الشكل 5 ، الفيديو 1) و AVN (الشكل 6 ، الفيديو 2) داخل التشريح السليم.

Figure 1
الشكل 1: أدوات للتشريح وحامل حلقة زجاج شبكي. A. حلقة زجاجية مملوءة بالبلاستيسين (يظهر السهم الأحمر الأخدود المتشكل في المركز لتحميل القلب). ب. تشريح طبق بتري مع هلام الأغاروز. C. مقص الربيع. مقص القزحية. E. ملقط منحني. F. ملقط غرامة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: رسم توضيحي لتشريح القلب الإجمالي. أ. رسم تخطيطي للتشريح المجهري SAN. يتم تطبيق الدبابيس من خلال القمة والزائدة الأذينية اليسرى (LAA). يشار إلى SAN بدائرة حمراء متقطعة. ب. رسم تخطيطي للتشريح المجهري ل AVN. يتم وضع المسامير من خلال الجزء المتبقي من الجدار الخالي من الجهد المنخفض (الموجود الآن في الأسفل). يشار إلى AVN بدائرة حمراء متقطعة. SVC ، الوريد الأجوف العلوي ؛ IVC ، الوريد الأجوف السفلي. CS ، الجيوب التاجية. LAA ، الزائدة الأذينية اليسرى ؛ RAA ، الزائدة الأذينية اليمنى ؛ السلطة الفلسطينية ، الشريان الرئوي. PV ، الوريد الرئوي. LV ، البطين الأيسر. IVS ، الحاجز بين البطينين. IAS ، الحاجز بين الأذينين. OF ، الحفرة البيضاوية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: موقع SAN و AVN في قلب فأر بالغ. أ. موقع العقدة الجيبية الأذينية (SAN) في قلب فأر بالغ. عرض من الجزء الخلفي من القلب. يشار إلى موقع SAN بخط أحمر متقطع داخل المنطقة بين الفجوات (خطوط متقطعة سوداء). SVC ، الوريد الأجوف العلوي ؛ IVC ، الوريد الأجوف السفلي. CS ، الجيوب التاجية. LAA ، الزائدة الأذينية اليسرى ؛ RAA ، الزائدة الأذينية اليمنى ؛ PV ، الوريد الرئوي. CT ، كريستا الطرفية. LV ، البطين الأيسر. RV ، البطين الأيمن. ب. موقع العقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلب فأر بالغ. عرض من اليمين. يقع AVN (الدائرة الحمراء المتقطعة) في قمة مثلث كوخ (مثلث أبيض متقطع) بالقرب من قاع الحاجز الغشائي. يتكون مثلث كوخ من وتر تودارو (TT ، خط متقطع أخضر) ، صمام ثلاثي الشرف (تلفزيون ، خط متقطع أزرق) وفتحة الجيب التاجي (CS ، خط أصفر متقطع). SVC ، الوريد الأجوف العلوي ؛ IVC ، الوريد الأجوف السفلي. IVS ، الحاجز بين البطينين. OF ، الحفرة البيضاوية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: عينة محضرة محملة على الفحص المجهري متحد البؤر . أ. العينة المعدة (السهم الأحمر) للفحص المجهري متحد البؤر المثبتة في حلقة زجاج شبكي مع البلاستيسين (السهم الأسود). عرض من الأسفل. ب. حلقة زجاجية مع عينة مثبتة محملة رأسا على عقب على منصة المجهر متحد البؤر (المجهر العكسي). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5. إعادة بناء التصوير المجهري متحد البؤر ل SAN في ماوس C57BL6 / J ملطخ بأجسام مضادة ل HCN4 (أحمر) و Cx43 (أبيض). أ. تحدد المنطقة المتقطعة SAN ، والتي يتم توجيهها على طول المنطقة بين الأجوف بين الوريد الأجوف العلوي والسفلي. ب. تكبير البطانة من لوحة A. C. إعادة بناء 3D للوحة B. RAA ، الزائدة الأذينية اليمنى ؛ RA ، الأذين الأيمن. SAN ، العقدة الجيبية الأذينية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6. إعادة بناء التصوير المجهري متحد البؤر ل AVN في ماوس C57BL6 / J ملطخ بأجسام مضادة ل HCN4 (أحمر) و Cx43 (أبيض). أ. تشير المنطقة المتقطعة إلى AVN. ب. تكبير البطانة من اللوحة A. C. إعادة بناء 3D من لوحة B. IVS ، الحاجز بين البطينين ؛ IAS ، الحاجز بين الأذينين. AVN ، العقدة الأذينية البطينية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7. صورة التحكم السلبي. أ. التحكم السلبي تلطيخ جبل كامل ل SAN. أظهرت الدائرة المتقطعة منطقة SAN التي أكدتها معالم التشريح. ب. تلطيخ السيطرة السلبية ل SAN فقط مع الأجسام المضادة الثانية. ج. تلطيخ DAPI ل SAN. D . السيطرة السلبية تلطيخ جبل كامل ل AVN. أظهرت الدائرة المتقطعة منطقة AVN التي أكدتها معالم التشريح. E . تلطيخ السيطرة السلبية ل AVN فقط مع الأجسام المضادة الثانية. ف. تلطيخ DAPI ل AVN. RAA ، الزائدة الأذينية اليمنى ؛ RA ، الأذين الأيمن. SVC ، الوريد الأجوف العلوي ؛ IVS ، الحاجز بين البطينين. IAS ، الحاجز بين الأذينين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فيديو 1: إعادة بناء 3D لشبكة SAN الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2: إعادة بناء 3D من AVN الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

مركب التركيز النهائي مطلوب جم أو مل / 100 مل
حل التثبيت
الفورمالديهايد (16٪) 4% 25 مل
برنامج تلفزيوني (1x) 75 مل
1٪ حل تريتون
تريتون X100 1% 1 مل
برنامج تلفزيوني 99 مل
حل الحظر
تريتون X-100 1% 1 مل
جيش صرب البوسنه 0.50% 0.5 غ
مصل الماعز العادي 20% 20 مل
برنامج تلفزيوني (1x) 89 مل
حل الغسيل
توين 20 0.10% 0.1 مل
جيش صرب البوسنه 0.50% 0.5 غ
برنامج تلفزيوني (1x) 99.9 مل
تاي (50x)
قاعدة تريس 24.20% 24.2 غ
100٪ حمض الخليك 5.71% 5.71 مل
0.5 م EDTA 0.05 م 10 مل
dH2O أضف ما يصل إلى 100 مل

الجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمت دراسة تشريح القلب تقليديا باستخدام أقسام نسيجية رقيقة11. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد لنظام التوصيل ، وبالتالي ، توفر فقط معلومات 2D. يسمح بروتوكول تلطيخ التألق المناعي الكامل الموصوف هنا بالتغلب على هذه القيود ويمكن استخدامه بشكل روتيني لتصوير SAN و AVN.

بالمقارنة مع الطرق القياسية مثل الكيمياء المناعية التقليدية التي تتطلب تضمين البارافين والتقسيم واسترجاع المستضد ، فإن منهجية التثبيت الكامل مفيدة لمعالجة توطين 3D الدقيق ومورفولوجيا SAN و AVN ، وفحص العلاقة مع الأنسجة المحيطة حيث يتم الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة إلى حد كبير مع الحد الأدنى فقط من جفاف الأنسجة والتمزق الجسدي. أيضا ، يتم الحفاظ على النشاط المناعي (أي ربط الأجسام المضادة لمستضدات الأنسجة) بشكل كبير.

أنشأنا طريقة عملية لموكب العينات للفحص المجهري متحد البؤر باستخدام حامل بلاستيكي مثبت على حلقة مملوءة بالبلاستيسين12،13. يعتبر البلاستيسين مثاليا لأنه يمكن تعديله بشكل فردي وفقا لحجم الأنسجة ، فمن الصعب بما يكفي لحمل الأنسجة بشكل موثوق دون ضغط مفرط على الأنسجة. الأهم من ذلك ، أنها ليست فلورية ، وتجنب الخلفية الفلورية التلقائية وبالتالي لا تتداخل مع إشارة الفلورسنت للأجسام المضادة المستخدمة.

استخدمنا مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (LSM-Zeiss) مع كاشف Airyscan ، والذي يمكن أن يوفر ميزة واضحة في الحصول على صور بجودة عالية. يمكن أن يوفر استخدام مجهر التصوير واسع المجال معلومات على مستوى الأنسجة فقط ولكنه يفتقر إلى الدقة الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، يحمل المجهر واسع المجال خطر الخلفية العالية14. باستخدام كاشف Airyscan ل LSM متحد البؤر ، يمكن الحصول على دقة محسنة ونسبة إشارة إلى ضوضاء (SNR) ، مقارنة بنظام التصوير البؤري التقليدي ذو الثقب والكاشف15.

يتم تقديم أشكال وموضع SAN و AVN على أنها إعادة بناء ثلاثية الأبعاد ويمكن لطائرات القسم الافتراضي الإضافية المشتقة من إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد أن تعزز تفسير الأقسام النسيجية ، في حين أن الأنسجة التقليدية تسمح فقط بتقييم 2D للتشريح مع الخطر المتأصل لعدم اكتشاف الهياكل الصغيرة ولكن ذات الصلة. علاوة على ذلك ، توفر إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد الفرصة لفحص الهياكل التشريحية ذات الأهمية عبر الحدود وداخل البيئة المكروية السليمة ، على سبيل المثال الارتخاء العصبي اللاإرادي الجوهري الذي يعصب القلب16. جبل كامل في الموقع تلطيخ وإعادة بناء 3D يسمح التحقيق في البيئة الخلوية وكذلك أنواع الخلايا المحددة واتجاهها. علاوة على ذلك ، يمكن تصور تعبير البروتين الإقليمي ونوع الخلية المحدد وقد يدعم تحليلات اللطخة الغربية والبروتينات17.

SAN و AVN هي هياكل متخصصة داخل القلب مع نمط تعبير مختلف من القنوات الأيونية و connexins التي يمكن استخدامها لتحديد موثوق10,18. تعمل قنوات الكاتيون الحلقية ذات بوابات النوكليوتيدات المنشطة بفرط الاستقطاب (HCN) على إنشاء إزالة الاستقطاب الانبساطي في خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب ، وبالتالي يتم التعبير عنها على وجه التحديد داخل نظام التوصيل مع كون HCN4 هو الشكل المتساوي السائد في الماوس19. أظهرت الدراسات أن HCN4 هو أحد أشكال HCN التي يمكن اكتشافها والتعبير عنها بثبات في جميع أنحاء SAN و AVN11,20. Connexins مباشرة ربط الخلايا المجاورة والسماح بمرور الأيونات من خلية إلى أخرى. لذلك فهي ضرورية لتوصيل النبضة الكهربائية عبر القلب21. تختلف أنماط تعبير Connexin بين المناطق المختلفة في القلب مع كون Cx43 هو الشكل المتساوي الأكثر وفرة الذي تم العثور عليه في جميع أجزاء القلب تقريبا باستثناء SAN و AVN22. إن الجمع بين التشريح المجهري للسماح بالتعرض لمناطق محددة ذات أهمية مع الأجسام المضادة المضادة ل HCN4 و CX43 وكذلك في مناهج السيليكو لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد للصور متحدة البؤر تسمح بتحديد موثوق ل SAN و AVN والتحقيق الشامل في مورفولوجيا SAN / AVN بالإضافة إلى تفاعلها مع الأنسجة المحيطة.

قد يكون من السهل التمييز بين SAN و AVN بعد تلطيخهما بجسم مضاد معين. لتوطين SAN و AVN من خلال معالمهم التشريحية ، ومع ذلك ، هناك حاجة إلى بعض الممارسة قبل إجراء التشريح المجهري الصحيح.

باستخدام البروتوكول أعلاه ، يمكن أيضا تطبيق عدد من المستضدات الأخرى. يعمل البروتوكول أيضا بشكل جيد على كل من الأنسجة الثابتة للتروية والأنسجة الثابتة بالغمور. ومع ذلك ، يمكن تعديل وقت الحضانة للتثبيت الأمثل لأن بعض الأجسام المضادة تظهر انخفاضا في النشاط المناعي عندما يكون المستضد ثابتا بشكل مفرط. نظرا لأن نهج التلوين الكامل يحتاج إلى 7 أيام لحضانة الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، فمن المهم غمر العينات بالكامل بكميات كافية من المحاليل المحتوية على الأجسام المضادة. يجب اختبار نسبة التخفيف لكل جسم مضاد قبل التجربة. لتلطيخ الأمثل ، يجب إزالة أي نسيج غير ذي صلة. بالنسبة للبروتوكول ، احتفظنا فقط بأجزاء صغيرة من البطينين لتحسين التوجيه وإزالة جميع الأنسجة الدهنية المحيطة والأوردة الرئوية ، لأن الأنسجة المحيطة (غير ذات الصلة) قد تربط الأجسام المضادة أيضا ، خاصة عندما يتم التعبير عن المستضدات المستهدفة عالميا.

يعد تلطيخ الموقع بالكامل والتصوير البؤري وإعادة الإعمار 3D تقنية لا تقدر بثمن وقوية للباحثين من مختلف المجالات. ومع ذلك ، فإن الطريقة لديها أيضا بعض القيود. (ط) يتطلب معدات متخصصة مثل مجهر متحد البؤر غير متوفر عادة في كل مؤسسة. (ii) كما ذكر أعلاه ، يتطلب التشريح المجهري للهياكل التشريحية المتخصصة مثل SAN أو AVN ولكن أيضا التصوير متحد البؤر ومعالجة ما بعد التصوير ممارسة مكثفة وموظفين ذوي خبرة. يعتمد نجاح الطريقة بشكل كبير على جودة الأجسام المضادة المستخدمة وبالتالي قد يكون صعبا للغاية في بعض الحالات. أيضا (iv) قد يكون من الصعب تحقيق إعادة بناء 3D وقد يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل مكثف لتحسين الإجراء. على سبيل المثال ، يجب تعيين الفواصل الزمنية المثلى أثناء الحصول على الصور نظرا لأن الأقسام المتباعدة جدا ستترك فجوات وقد لا تسمح بإعادة بناء 3D كافية للتشريح. قد تتسبب الأقسام القريبة جدا في الإفراط في أخذ العينات والتبييض بسبب الإضاءة المفرطة وستستغرق وقتا طويلا لإكمال صورة واحدة. أخيرا (v) القيد الرئيسي للفحص المجهري متحد البؤر هو عمق التصوير مما يعني أنه إذا كان سمك العينة يتجاوز الحد الأقصى لعمق التشغيل للمجهر متحد البؤر ، فلا يمكن اكتشاف الفلوروفور الإضافي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، 81Z0600206 إلى S. Kääb) ، مؤسسة كورونا (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، SFB 914 (مشروع Z01 إلى H. Ishikawa-Ankerhold و S. Massberg والمشروع A10 إلى C. Schulz) ، ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system  Hugo Sachs Elektronik 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit Hugo Sachs Elektronik 73-4860 Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform Kent Scientific SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps Fine Science Tools 11295-51
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Tissue forceps Fine Science Tools 11051-10
Tissue pins Fine Science Tools 26007-01 Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker Sunlab D-8040
Magnetic stirrer IKA  RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL Eppendorf Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope  VWR 10836-004
Laser Scanning Confocal microscope Zeiss LSM 800
Software
Imaris 8.4.2 Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter Sartorius 17597
100 mm petri dish Falcon 351029
27G needle BD Microlance 3 300635
50 ml Polypropylene conical Tube Falcon 352070
5ml Syringe Braun 4606108V
Cover slips Thermo Scientific 7632160
Eppendorf Tubes Eppendorf 30121872
Chemicals
0.5 M EDTA Sigma 20-158 Components of TEA
16% Formaldehyde Solution Thermo Scientific  28908 use as a 4% solution 
Acetic acid Merck 100063 Components of TEA
Agarose Biozym 850070
Bovine Serum Albumin Sigma A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-094
Normal goat serum Sigma NS02L
Sucrose Sigma S1888-1kg
Tris-base Roche TRIS-RO Components of TEA
Triton X-100 Sigma T8787-250ml Diluted to 1% in PBS
Tween 20 Sigma P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL Cp-pharma 31303
Oxygen 5 L Linde 2020175 Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling Technology #4412 diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen #A-21247 diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) Invitrogen H3570 diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43 Sigma C6219 diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) Invitrogen MA3-903 diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring Self-designed and 3D printed
Plasticine Cernit 49655005
Silikonpasten, Baysilone VWR 291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6 The Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

Tags

الطب ، العدد 166 ، العقدة الجيبية الأذينية ، العقدة الأذينية البطينية ، أمراض القلب ، الفيزيولوجيا الكهربية ، نظام التوصيل القلبي ، التشريح الدقيق ، التألق المناعي ، الفحص المجهري متحد البؤر

Erratum

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

تلطيخ التألق المناعي بالكامل ، والتصوير البؤري وإعادة البناء 3D للعقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J.,… More

Xia, R., Vlcek, J., Bauer, J., Kääb, S., Ishikawa-Ankerhold, H., van den Heuvel, D. A., Schulz, C., Massberg, S., Clauss, S. Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. J. Vis. Exp. (166), e62058, doi:10.3791/62058 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter