ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Vi tilbyr en trinnvis protokoll for fullmontert immunfluorescensfarging av sinoatrialknuten (SAN) og atrioventrikulær knute (AVN) i murine hjerter.
Abstract
Det elektriske signalet fysiologisk generert av pacemakerceller i sinoatrialknuten (SAN) utføres gjennom ledningssystemet, som inkluderer atrioventrikulær knutepunkt (AVN), for å tillate eksitasjon og sammentrekning av hele hjertet. Enhver dysfunksjon av enten SAN eller AVN resulterer i arytmier, noe som indikerer deres grunnleggende rolle i elektrofysiologi og arytmogenese. Musemodeller er mye brukt i arytmiforskning, men den spesifikke undersøkelsen av SAN og AVN er fortsatt utfordrende.
SAN ligger ved krysset mellom crista terminalis med den overlegne vena cava og AVN ligger ved toppen av trekanten Koch, dannet av åpningen av koronar sinus, tricuspid annulus og senen til Todaro. På grunn av den lille størrelsen er visualisering ved konvensjonell histologi imidlertid fortsatt utfordrende, og det tillater ikke studier av SAN og AVN i deres 3D-miljø.
Her beskriver vi en helmontert immunfluorescenstilnærming som tillater lokal visualisering av merket mus SAN og AVN. Helmontert immunfluorescensfarging er beregnet for mindre seksjoner av vev uten behov for manuell seksjonering. Til dette formål dissekeres musehjertet, med uønsket vev fjernet, etterfulgt av fiksering, permeabilisering og blokkering. Celler i ledningssystemet i SAN og AVN blir deretter farget med et anti-HCN4 antistoff. Konfokal laserskanningsmikroskopi og bildebehandling tillater differensiering mellom nodalceller og arbeidende kardiomyocytter, og å tydelig lokalisere SAN og AVN. Videre kan ytterligere antistoffer kombineres for å merke andre celletyper også, for eksempel nervefibre.
Sammenlignet med konvensjonell immunohistologi bevarer helmontert immunfluorescensfarging den anatomiske integriteten til hjerteledningssystemet, og tillater dermed undersøkelse av AVN; Spesielt så inn i deres anatomi og interaksjoner med det omkringliggende arbeidsmyokardiet og ikke-myocyttceller.
Introduction
Arytmier er vanlige sykdommer som rammer millioner av mennesker, og er årsaken til betydelig sykelighet og dødelighet over hele verden. Til tross for enorme fremskritt innen behandling og forebygging, som utvikling av hjertepacemakere, er behandling av arytmier fortsatt utfordrende, først og fremst på grunn av svært begrenset kunnskap om underliggende sykdomsmekanismer 1,2,3. En bedre forståelse av både normal elektrofysiologi og patofysiologi av arytmier kan bidra til å utvikle nye, innovative og kausale behandlingsstrategier i fremtiden. I tillegg, for å studere arytmogenese grundig, er det viktig å lokalisere og visualisere det spesifikke hjerteledningssystemet i dyremodeller som musen, da mus er mye brukt i elektrofysiologiforskning.
De viktigste delene av hjerteledningssystemet er sinoatrialknuten (SAN), hvor den elektriske impulsen genereres i spesialiserte pacemakerceller, og atrioventrikulær knute (AVN), som er den eneste elektriske forbindelsen mellom atriene og ventriklene4. Når de elektrofysiologiske egenskapene til SAN og AVN endres, kan arytmier som syk sinus syndrom eller atrioventrikulært blokk forekomme som kan føre til hemodynamisk forverring, synkope og til og med død, og dermed understreke den essensielle rollen til både SAN og AVN i elektrofysiologi og arytmogenese5.
Omfattende studier på SAN eller AVN krever en presis lokalisering og visualisering av begge strukturer, ideelt innenfor deres fysiologiske miljø. På grunn av deres lille størrelse og plassering i arbeidsmyokardiet, uten å etablere en klar makroskopisk synlig struktur, er det imidlertid utfordrende å studere anatomien og elektrofysiologien til SAN og AVN. Anatomiske landemerker kan brukes til å grovt identifisere regionen som inneholder SAN og AVN 6,7,8. Kort fortalt ligger SAN i interkavalområdet i høyre atrium ved siden av muskelcrista terminalis (CT), AVN ligger innenfor trekanten av Koch etablert av trikuspidalklaffen, ostium av koronar sinus og senen til Todaro. Så langt ble disse anatomiske landemerkene hovedsakelig brukt til å lokalisere, fjerne og deretter studere SAN og AVN som individuelle strukturer (f.eks. Ved konvensjonell histologi). For bedre å forstå den komplekse elektrofysiologien til SAN og AVN (f.eks. regulatoriske effekter av tilstøtende celler i arbeidsmyokardiet), er det imidlertid nødvendig å studere ledningssystemene i det fysiologiske 3D-miljøet.
Helmontert immunfluorescensfarging er en metode som brukes til å studere anatomiske strukturer in situ samtidig som integriteten til det omkringliggende vevet 9 opprettholdes. Ved å dra nytte av konfokalmikroskopi og bildeanalyseprogramvare, kan SAN og AVN visualiseres med fluorescerende merkede antistoffer rettet mot ionkanaler spesielt uttrykt i disse regionene.
Denne følgende protokollen forklarer de nødvendige trinnene for å utføre en veletablert helmontert fargemetode for lokalisering og visualisering av SAN- og AVN-mikroskop. Spesifikt beskriver denne protokollen hvordan (1) å lokalisere SAN og AVN ved anatomiske landemerker for å forberede disse prøvene for farging og mikroskopianalyse (2) for å utføre helmontert immunfluorescensfarging av referansemarkørene HCN4 og Cx43 (3) for å forberede SAN- og AVN-prøver for konfokalmikroskopi (4) for å utføre konfokal avbildning av SAN og AVN. Vi beskriver også hvordan denne protokollen kan modifiseres for å inkludere ytterligere farging av omkringliggende arbeidende myokardceller eller ikke-myocyttceller som autonome nervefibre som muliggjør en grundig undersøkelse av hjerteledningssystemet i hjertet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleie og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra dyrepleie- og etikkomiteen ved Universitetet i München, og alle prosedyrene som ble utført på mus ble godkjent av regjeringen i Bayern, München, Tyskland (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J-mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory.
MERK: Figur 1 viser instrumentene som trengs for eksperimentet. Figur 2 viser en illustrasjon av brutto hjerteanatomi. Figur 3 viser plasseringen av SAN og AVN i et voksent musehjerte. Figur 4 viser den preparerte prøven lastet på konfokalmikroskopien.
1. Forberedelser
- Lag en 4% formaldehydoppløsning (4% PFA) ved å fortynne 10 ml 16% formaldehydoppløsning i 30 ml PBS.
- Forbered en 15% sukroseoppløsning og 30% sukroseoppløsning ved å oppløse henholdsvis 15 g og 30 g sukrosepulver i henholdsvis 100 ml PBS. Etter at sukrosepulveret er fullstendig oppløst, filtreres oppløsningen med 0,2 μm sprøytefilter før oppbevaring ved 4 °C.
- Tilbered en 3% -4% agarosegel, tilsett 3 g eller 4 g agarosepulver og 100 ml 1x TAE (fortynnet fra 50x TAE-stamoppløsning) i et beger. Legg begeret på en magnetisk omrører og kok det til agarose er helt oppløst.
- Forbered disseksjonsfatet ved forsiktig å helle 30 ml agarosegel (3%-4%) i en petriskål med diameter på 100 mm. La petriskålen stå på benken i romtemperatur for å kjøle seg ned og herde.
- Forbered blokkeringsløsning og vaskeoppløsning i henhold til oppskriftene i tabell 1. Forbered alle løsningene som er utarbeidet på bruksdagen. Langtidslagring anbefales ikke.
- Forbered antistoffoppløsningene ved å fortynne dem i kald (4 °C) 1x PBS, beskytt fortynningen mot lys (f.eks. ved å pakke aluminiumsfolie rundt) og hold fortynninger på is til de brukes. Fortynn antistoffene kort før inkubasjon. Unngå å etterlate de fortynnede antistoffene ved romtemperatur.
MERK: Passende antistofffortynning bør testes med sammenlignbare vevsprøver ved å utføre en konvensjonell immunfluorescerende farging. Her testet vi antistoffene ved å farge frosne seksjoner kuttet i en tykkelse på 10 μm.
2. Organhøsting og vevsforberedelse
- Bedøv musen ved å plassere den i et inkubasjonskammer koblet til en isofluran fordamper. Still inn fordamperen til å levere 4-5% isofluran (henholdsvis 96-95% oksygen).
MERK: Full anestesi bekreftes av tap av postural reaksjon og rettende refleks ved forsiktig å rulle kammeret til musen er plassert på ryggen. - Sett musen i en liggende stilling på operasjonsbordet. Plasser musenesen i en anestesimaske koblet til en modifisert Bain-krets med det indre røret koblet til isofluran fordamper. For å opprettholde anestesi, bruk 1-2% isofluran i oksygen med en strømningshastighet på 1 l/min. Fjern overflødig bedøvelsesdamp fra musen via maskens ytre rør og trekk gjennom en beholder med aktivt kull, som absorberer overflødig bedøvelsesgass.
- Når full anestesi oppnås, injiser fentanyl for analgesi (0,1 μg / 25 g kroppsvekt i.p.).
- Når tåklemmerefleksen ikke kan oppdages, gjør du et klart kutt fra jugulum til symfysen ved hjelp av irissaks for å fjerne pels og hud. Lag et nytt kutt fra venstre til høyre under ribbeina ved hjelp av irissaks for å forsiktig åpne magen.
- Liv xiphoid litt ved hjelp av buede tang for å tillate å kutte membranen fra venstre til høyre uten å skade noen organer. Klipp ribbeholderen i en medial aksillær linje på begge sider ved hjelp av irissaks for å snu den kranialt og for å gi tilgang til hjertet.
- Klipp den dårligere vena cava og synkende thorax aorta på membrannivået ved hjelp av irissaks. Punkter hjertet med en 27 G nål i området av toppunktet og trykk deretter forsiktig nålen inn i venstre ventrikkel (LV). Injiser forsiktig 5-10 ml iskald PBS i LV for å perfusere hjertet.
MERK: Fargen på hjertet skal skifte fra rødt til grått, noe som indikerer vellykket perfusjon med PBS. - Løft forsiktig hjertets topp ved hjelp av en pinsett, slik at du kan kutte de store karene og fjerne hjertet.
- Excise hjertet ved å kutte de store arteriene og venene så langt unna hjertet som mulig for å unngå skade på den overlegne vena cava (SVC). Bevare SVC siden det vil tjene som viktig landemerke under senere behandling.
- Etter hjertefjerning, slå av isofluran fordamper.
- Sett hjertet i en disseksjonsfat fylt med iskald PBS under dissekeringsmikroskopet. Etter bestemmelse av venstre / høyre og foran / bak i hjertet, snu hjertet rundt med forsiden av hjertet i bunnen av fatet (for å avsløre de store karene som ligger bakre).
- Immobiliser hjertet ved å sette små knappenåler gjennom toppunktet og venstre atrievedheng (LAA) i agarose nederst i disseksjonsskålen (figur 2A). Bruk fin pinsett og saks, fjern forsiktig ikke-kardial vev rundt SVC og dårligere vena cava (IVC) (f.eks. lunger, fett, perikard) for å eksponere interkavalregionen (figur 3A).
- Fjern flertallet av ventriklene ved å kutte parallelt sporet mellom ventriklene og atriene med mikrosaksen. Bevar en liten del av ventrikkelvevet for senere belastning på pleksiglasringen.
- For fiksering og dehydrering, sett prøven (som inneholder atriene, SVC og IVC) i 4% PFA over natten ved 4 ° C.
- Neste dag, overfør hjertet til 15 % sukroseoppløsning i 24 timer ved 4 °C.
- Neste dag, overfør hjertet til 30% sukroseoppløsning i 24 timer ved 4 °C.
MERK: For fiksering og dehydrering i trinn 2.13, 2.14 og 2.15, blir prøvene igjen ved 4 ° C uten ytterligere omrøring eller gynging.
3. Helmontert immunfluorescensfarging
- Vask hjertet i 1 % Triton X-100 fortynnet i PBS og blokker og permeabiliser i blokkerende oppløsning (tabell 1) over natten ved 4 °C.
- Plasser hjertet i en 1,5 ml tube og inkuber med kanin anti-mus connexin-43 (fortynning av 1:200) og rotte anti-mus HCN4 (fortynning av 1:200) antistoffer fortynnet med blokkerende oppløsning i 7 dager ved 4 ° C.
MERK: Den optimale konsentrasjonen av primære antistoffer bør testes før databladene brukes som orientering. Andre antigener av interesse kan også farges i dette trinnet, så lenge vertsarten av det primære antigenet er forskjellig fra de andre. En høyere konsentrasjon av Triton X-100 kan bidra til å oppnå mer effektiv antistofffarging som demonstrert før10, men konsentrasjonen kan bestemmes individuelt. - Etter 7 dager, fjern oppløsningen som inneholder primære antistoffer ved hjelp av en pipetteog vask hjertet med 1% Triton X-100 oppløsning 3 ganger (hver gang i 1 time ved romtemperatur på orbital shaker).
- Etter vask, inkuber hjertet = med Alexa Fluor 488 geit anti-rotte IgG (fortynning av 1:200) og Alexa Fluor 647 geit anti-kanin IgG (fortynning av 1:200) i 7 dager ved 4 ° C.
- Etter 7 dager, fjern all oppløsningen som inneholder sekundære antistoffer ved hjelp av en pipette. Vask deretter hjertet med vaskeoppløsning (tabell 1) 3 ganger (hver gang i 1 time ved romtemperatur på orbital shaker).
- For å farge kjerner, inkuber hjertet i DAPI-oppløsning (10 μg/ml) over natten ved 4 °C.
- På neste dag, vask hjertet med vaskeoppløsning 3 ganger (hver gang i 1 time ved romtemperatur på orbital shaker).
MERK: For blokkering, permeabilisering, antistoffinkubasjon og DAPI-farging i trinn 3.1, 3.2, 3.4 og 3.6, la prøvene være ved steady state i 4 °C, ingen omrøring er nødvendig. Det fargede vevet kunne bevares helt dekket med vaskeoppløsning ved 4 °C og beskyttet mot lys i noen dager til avbildning i konfokalmikroskopet.
4. Konfokal mikroskopi
- Forbered pleksiglasringer og fyll med plasticine (figur 1). I midten av plasticine dannes et lite spor i midten for å laste hjertet. Lag et grunt spor, da dette ville være lettere å skaffe et flatt bildeplan, og å justere avstanden og unngå luftbobler mellom prøven og dekslene i trinn 4.4.
- Bruk den samme hjerteprøven for avbildning av både SAN og AVN sekvensielt. For SAN-avbildning, last hjertet direkte, mens for AVN-avbildning, utfør mikrodisseksjon før.
- SAN-avbildning
- Identifiser SAN ved hjelp av anatomiske landemerker: Den ligger på den dorsale siden av hjertet i interkavalområdet (regionen mellom den øvre og nedre vena cava). Crista terminalis (CT) er muskelstreken mellom SAN og RAA.
- Plasser hjertet i plasticine sporet med baksiden av hjertet vendt opp. Legg PBS på hjertet for å forskyve all luft i hulrommet til hjertet er helt dekket med PBS (vanligvis er noen få dråper PBS tilstrekkelig).
- Under disseksjonsmikroskopet, trykk forsiktig på RAA, LAA og gjenværende deler av venstre ventrikkel inn i plasticinen for å fikse hjertet. Forsikre deg om at hele interkavalregionen og crista-terminalisen kan ses tydelig (ikke dekket av plasticine). Området som skal avbildes er vist i figur 3A.
- AVN-avbildning
- Etter å ha fullført avbildningen av SAN, samle den samme prøven og deretter bruke til AVN-avbildningen. For AVN-mikrodisseksjon, plasser hjertet = på en disseksjonsfat under disseksjonsmikroskopet.
- Orienter hjertet med høyre side vendt opp (inkludert de resterende delene av høyre ventrikkel). Sett pinner gjennom den gjenværende delen av den LV-frie veggen (som nå er nederst) for å immobilisere vevet (figur 2B).
- Skjær den gjenværende bobilfrie veggen oppover gjennom trikuspidalklaffen og vena cava superior. Vend deretter RV og RA bort for å eksponere interventrikulær og interatriell septum. (Figur 3B)
MERK: Vær oppmerksom på ikke å skade koronar sinus (CS), da det er et viktig anatomisk landemerke for å finne trekanten til Koch som deretter gjør det mulig å lokalisere AVN. CS går på tvers i venstre atrioventrikulære spor på bakre side av hjertet, og CS-åpningen ligger mellom IVC og trikuspidalklaffen i nedre del av interatrialseptum (figur 3A og B). - Identifiser trekanten til Koch som finnes på den endokardiale overflaten av høyre atrium, avgrenset anteriort av hengsellinjen til septalbrosjyren til trikuspidalklaffen (TV), og bakre av Todaros sene. Basen dannes av åpningen til koronar sinus (figur 3B). Siden dette er målområdet for AVN-bildebehandling, må det være tydelig synlig.
- Overfør hjertet til plasticinesporet i pleksiglasringen med trekanten Koch tydelig eksponert (dvs. ikke dekket av plasticine). Trykk forsiktig vevet rundt Koch-trekanten inn i plasticinen for å fikse prøven. Legg PBS på hjertet for å forskyve all luft i hulrommet til hjertet er helt dekket med PBS (vanligvis er noen få dråper PBS tilstrekkelig).
- SAN-avbildning
- Påfør silikon på kantene på pleksiglasringene for å tillate å dekke hjertene som er lastet i de plastinfylte pleksiglasringene med dekselslipp.
- Trykk forsiktig på baksiden av plasticinen for å klemme ut deler av PBS og for å feste hjertet til dekselet mens du unngår luftbobler i bildeområdet.
NOTAT: Forsikre deg om at interesseområdene ikke er brettet og dekket når du trykker på baksiden av plasticinen. Et flatt avbildningsplan uten prøveoverkompresjon er nødvendig for å bevare anatomien og for riktig konfokal avbildning av prøvene. For SAN er det viktig å sørge for at interkavalregionen er tydelig eksponert. For AVN bør trekanten til Koch være fullt eksponert. - Sett de helmonterte fargeprøvene opp ned på plattformen til konfokalmikroskopet. Den eksponerte SAN/AVN festet til dekselet er nå på bunnen av mikroskopplattformen (figur 4).
MERK: For å ta bilder bruker vi Carl Zeiss LSM800 med Airyscan Unit og programvaren ZEN 2.3 SP1 black. - Velg plate "BP420-480 + LP605" for eksitering av Alexa Fluor 647 konjugert anti-HCN4. Varier mastergevinsten fra 650-750.
- Ta et oversiktsbilde av hele SAN- og AVN-området ved hjelp av Tile Scan-funksjonen . Velg deretter den HCN4-positive regionen ved å klikke og legge til en firkant på oversiktsbildet rundt interesseområdet som skal skannes.
- Kontroller parametrene, inkludert plater og masterforsterkning for de gjenværende kanalene (Alexa Fluor 488 og DAPI) i konfokalmikroskopet og sett som beskrevet i trinn 4.6.
- Juster sakte fokus fra topp til bunn i prøven for å forhåndsvise hele eksemplet og angi første og siste for Z-stakkområdet. Angi et optimalt intervall for Z-stakken basert på tykkelsen på den optiske prøven. Vi bruker et 20x mål, og 0,8-1 μm som intervall for Z-stack.
- Etter at alle parametrene er riktig innstilt, skann hele området av SAN og AVN.
- Utfør 3D-rekonstruksjon av bildene ved hjelp av programvare (f.eks. Imaris versjon 8.4.2).
- Velg Bildebehandling | Baseline Subtraction for å fjerne bakgrunnsfarging.
- Velg overflateoppretting på innstillingen for valgt kanal og område av interesse for behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke protokollen som er skissert ovenfor, kan konfokalmikroskopiavbildning av både SAN og AVN utføres pålitelig. Spesifikk farging av ledningssystemet ved bruk av fluorescerende antistoffer rettet mot HCN4 og farging av arbeidsmyokard ved bruk av fluorescerende antistoffer rettet mot Cx43 tillater klar identifisering av SAN (figur 5, video 1) og AVN (figur 6, video 2) innenfor intakt anatomi.
Figur 1: Instrumenter for disseksjon og ringholder av pleksiglass. A. Plexiglasring fylt med plasticine (rød pil viser sporet dannet i midten for å laste hjertet). B. Disseksjon petriskål med agarosegel. C. Vårsaks. D. Iris saks. E. Buet tang. F. Fine tang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Illustrasjon av brutto hjerteanatomi. A. Skjematisk illustrasjon av SAN-mikrodisseksjonen. Pinner påføres gjennom toppunktet og venstre atrievedheng (LAA). SAN er indikert med rød stiplet sirkel. B. Skjematisk illustrasjon av AVN-mikrodisseksjonen. Pinner settes gjennom den gjenværende delen av den LV-frie veggen (som nå er nederst). AVN er indikert med en rød stiplet sirkel. SVC, Superior vena cava; IVC, dårligere vena cava; CS, koronar sinus; LAA, venstre atrievedheng; RAA, høyre atrievedheng; PA, lungearterien; PV, lungevene; LV, venstre ventrikkel; IVS, interventrikulær septum; IAS, interatrial septum; OF, oval fossa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av SAN og AVN i et voksent musehjerte. A. Plassering av sinoatrialknuten (SAN) i et voksent musehjerte. Utsikt fra baksiden av hjertet. Plasseringen av SAN er indikert med rød stiplet linje innenfor interkavalområdet (svarte stiplede linjer). SVC, Superior vena cava; IVC, dårligere vena cava; CS, koronar sinus; LAA, venstre atrievedheng; RAA, høyre atrievedheng; PV, lungevene; CT, Crista terminalis; LV, venstre ventrikkel; RV, høyre ventrikkel. B. Plassering av atrioventrikulær knute (AVN) i et voksent musehjerte. Utsikt fra høyre. AVN (rødstiplet sirkel) ligger ved toppen av trekanten av Koch (hvit stiplet trekant) nær bunnen av membranøs septum. Kochs trekant er dannet av senen til Todaro (TT, grønn stiplet linje), trikuspidalventil (TV, blå stiplet linje) og åpningen av koronar sinus (CS, gul stiplet linje). SVC, overlegen vena cava; IVC, dårligere vena cava; IVS, interventrikulær septum; OF, oval fossa. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fremstilt prøve lastet på konfokalmikroskopien. A. Den forberedte prøven (rød pil) for konfokalmikroskopi montert i pleksiglasringen med plasticine (svart pil). Utsikt fra bunnen. B. Plexiglasring med montert prøve lastet opp ned på plattformen til konfokalmikroskopet (invers mikroskop). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Rekonstruksjon av konfokalmikroskopi av SAN i en C57BL6/J mus farget med anti-HCN4 (rød) og Cx43 (hvite) antistoffer. En. Det stiplede området avgrenser SAN, som er orientert langs interkavalområdet mellom den overlegne og underordnede vena cava. B. Forstørrelse av innlegget fra panel A. C. 3D-rekonstruksjon av panel B. RAA, høyre atrievedheng; RA, høyre atrium; SAN, sinoatrialknute. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Rekonstruksjon av konfokalmikroskopi av AVN i en C57BL6/J mus farget med anti-HCN4 (rød) og Cx43 (hvite) antistoffer. En. Stiplet område angir AVN. B. Forstørrelse av innlegget fra panel A. C. 3D-rekonstruksjon av panel B. IVS, interventrikulær septum; IAS, interatrial septum; AVN, atrioventrikulær knutepunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Negativt kontrollbilde. En. negativ kontroll helmonteringsfarging for SAN. Den stiplede sirkelen viste SAN-regionen bekreftet av anatomiens landemerker. B. negativ kontrollfarging for SAN bare med andre antistoffer. C. DAPI-farging for SAN. D . negativ kontroll helmontert farging for AVN. Den stiplede sirkelen viste AVN-regionen bekreftet av anatomilandemerkene. E . negativ kontrollfarging for AVN kun med andre antistoffer. F. DAPI-farging for AVN. RAA, høyre atrievedheng; RA, høyre atrium; SVC, overlegen vena cava; IVS, interventrikulær septum; IAS, interatrial septum; Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: 3D-rekonstruksjon av SAN Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: 3D-rekonstruksjon av AVN Klikk her for å laste ned denne videoen.
| Sammensatt | Endelig konsentrasjon | g eller ml/100 ml kreves | |
| Fiksering av løsning | |||
| Formaldehyd (16%) | 4% | 25 ml | |
| PBS (1x) | 75 ml | ||
| 1% Triton løsning | |||
| Triton X100 | 1% | 1 ml | |
| PBS | 99 ml | ||
| Blokkerende løsning | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Normalt geitserum | 20% | 20 ml | |
| PBS (1x) | 89 ml | ||
| Vaskeoppløsning | |||
| Mellom 20 | 0.10% | 0,1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| PBS (1x) | 99,9 ml | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g | |
| 100% eddiksyre | 5.71% | 5,71 ml | |
| 0,5 m EDTA | 0,05 m | 10 ml | |
| dH2O | Legg opp til 100 ml | ||
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerteanatomi har tradisjonelt vært studert ved hjelp av tynne histologiske snitt11. Disse metodene bevarer imidlertid ikke den tredimensjonale strukturen til ledningssystemet og gir dermed bare 2D-informasjon. Den helmonterte immunfluorescensfargeprotokollen beskrevet her gjør det mulig å overvinne disse begrensningene og kan rutinemessig brukes til SAN- og AVN-avbildning.
Sammenlignet med standardmetoder som konvensjonell immunhistokjemi som krever parafininnebygging, snitting og antigeninnhenting, er helmonteringsmetodikken fordelaktig for å adressere den nøyaktige 3D-lokaliseringen og morfologien til SAN og AVN, og for å undersøke forholdet til det omkringliggende vevet siden vevsmorfologien er betydelig bevart med bare minimal vevsdehydrering og fysisk ruptur. Også immunoreaktiviteten (dvs. bindingen av antistoffer mot vevsantigener) er også sterkt vedlikeholdt.
Vi etablerte en praktisk prøveprosesjonsmetode for konfokalmikroskopi ved å bruke en plastringmontert holder fylt med plasticine12,13. Plasticine er ideell siden den kan justeres individuelt til vevets størrelse, det er vanskelig nok til å holde vevet på en pålitelig måte uten for høyt trykk i vevet. Viktigst av alt, det er ikke fluorescerende, unngår autofluorescerende bakgrunn og forstyrrer derfor ikke det fluorescerende signalet til antistoffene som brukes.
Vi brukte konfokal laserskanningsmikroskop (LSM-Zeiss) med Airyscan-detektoren, som kan gi en klar fordel ved å skaffe bilder med høy kvalitet. Ved hjelp av et widefield imaging mikroskop kan bare tilby vev-nivå informasjon, men mangler cellulær oppløsning. I tillegg bærer bredfeltmikroskopet en risiko for høy bakgrunn14. Ved å bruke en Airyscan-detektor for konfokal LSM, kan man oppnå forbedret oppløsning og signal-støy-forhold (SNR), sammenlignet med det tradisjonelle pinhole-and-detector confocal imaging system15.
Formene og posisjonen til SAN og AVN presenteres som 3D-rekonstruksjon og ytterligere virtuelle seksjonsplan avledet fra 3D-rekonstruksjon kan forbedre tolkningen av histologiske seksjoner, mens konvensjonell histologi bare tillater en 2D-vurdering av anatomien med den iboende risikoen for ikke-deteksjon av små, men relevante strukturer. Videre gir 3D-rekonstruksjon muligheten til å undersøke anatomiske strukturer av interesse transmuralt og i det intakte mikromiljøet, for eksempel intrinsisk autonom nerveplex som innerverer hjertet16. Helmontering in situ-farging og 3D-rekonstruksjon gjør det mulig å undersøke det cellulære miljøet, samt de spesifikke celletypene og deres orientering. Videre kan regionalt og celletypespesifikt proteinuttrykk visualiseres og kan ytterligere støtte vestlige blot- og proteomikkanalyser17.
SAN og AVN er spesialiserte strukturer i hjertet med et annet uttrykksmønster av ionekanaler og connexins som kan brukes til pålitelig identifikasjon10,18. Hyperpolariseringsaktiverte sykliske nukleotid-gated kationkanaler (HCN) etablerer den diastoliske depolariseringen i pacemakerceller og uttrykkes derfor spesifikt i ledningssystemet med HCN4 som den dominerende isoformen i musen19. Studier har vist at HCN4 er en av de detekterbare og stabilt uttrykte HCN-isoformene gjennom SAN og AVN11,20. Connexins forbinder direkte naboceller og tillater passasje av ioner fra celle til celle; De er derfor avgjørende for ledningen av den elektriske impulsen gjennom hjertet21. Connexin uttrykksmønstre varierer mellom forskjellige regioner i hjertet med Cx43 som den mest tallrike isoform som har blitt funnet i nesten alle deler av hjertet bortsett fra SAN og AVN22. Kombinere mikrodisseksjon for å tillate eksponering av spesifikke regioner av interesse med anti-HCN4 og anti-CX43 antistoffer samt i silico tilnærminger for tredimensjonal rekonstruksjon av konfokale bilder tillater pålitelig identifisering av SAN og AVN og til omfattende undersøkelse av SAN / AVN morfologi samt deres interaksjon med det omkringliggende vevet.
SAN og AVN kan være enkle å skille etter farging med et spesifikt antistoff. For å lokalisere SAN og AVN ved deres anatomiske landemerker, er det imidlertid nødvendig med litt øvelse før riktig mikrodisseksjon kan utføres.
Ved hjelp av ovennevnte protokoll kan en rekke andre antigener også brukes. Protokollen fungerer også godt på både perfusjonsfiksert og nedsenkningsfast vev. Imidlertid kan inkubasjonstiden justeres for optimal fiksering siden visse antistoffer viser redusert immunoreaktivitet når antigenet er overfiksert. Siden helmonteringsfargemetoden trenger 7 dager for primær og sekundær antistoffinkubasjon, er det viktig å fullstendig nedsenke prøvene i tilstrekkelige mengder antistoffholdige løsninger. Fortynningsforholdet mellom hvert antistoff bør testes før forsøket. For optimal farging bør irrelevant vev fjernes. For protokollen bevarte vi bare små deler av ventriklene for bedre orientering og fjerner alt omkringliggende fettvev og lungeårer, da omkringliggende (irrelevant) vev også kan binde antistoffer, spesielt når målantigenene uttrykkes globalt.
Helmontering in situ-farging, konfokal avbildning og 3D-rekonstruksjon er en uvurderlig og kraftig teknikk for forskere fra ulike felt. Metoden har imidlertid også noen begrensninger. (i) Det krever spesialutstyr som et konfokalmikroskop som ikke er allment tilgjengelig ved alle institusjoner. (ii) Som nevnt ovenfor krever mikrodisseksjon av spesialiserte anatomiske strukturer som SAN eller AVN, men også konfokal avbildning og post-imaging prosessering intensivt praktiserende og erfarent personell. (iii) Metodens suksess avhenger sterkt av kvaliteten på antistoffene som brukes, og kan derfor være svært utfordrende i noen tilfeller. Også (iv) 3D-rekonstruksjon kan være vanskelig å oppnå og kan kreve intensiv feilsøking for å optimalisere prosedyren. For eksempel må optimale intervaller stilles inn under bildeopptak, siden seksjoner som er fordelt for langt fra hverandre, vil etterlate hull og kanskje ikke tillate en tilstrekkelig 3D-rekonstruksjon av anatomien. Seksjoner som er for nærme, kan forårsake oversampling og bleking på grunn av overdreven belysning, og det vil ta lang tid å fullføre ett bilde. Til slutt (v) den største begrensningen av konfokalmikroskopi er bildedybden, noe som betyr at hvis prøvetykkelsen er utenfor den maksimale operasjonsdybden til konfokalmikroskopet, kan den ytterligere fluoroforen ikke detekteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (prosjekt Z01 til H. Ishikawa-Ankerhold og S. Massberg og prosjekt A10 til C. Schulz), ERA-NET om kardiovaskulære sykdommer (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Finansiørene hadde ingen rolle i manuskriptutarbeidelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al.
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L.
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
- Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
Tags
Medisin utgave 166 Sinoatriell knute Atrioventrikulær knutepunkt Kardiologi elektrofysiologi Hjerteledningssystem Mikrodisseksjon Immunfluorescens Konfokal mikroskopiErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
