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Summary
Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.
Abstract
Le signal électrique physiologiquement généré par les cellules du stimulateur cardiaque dans le nœud sino-auriculaire (SAN) est conduit à travers le système de conduction, qui comprend le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), pour permettre l’excitation et la contraction de tout le cœur. Tout dysfonctionnement du SAN ou de l’AVN entraîne des arythmies, indiquant leur rôle fondamental dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse. Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l’arythmie, mais l’étude spécifique du SAN et de l’AVN reste difficile.
Le SAN est situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure et AVN est situé au sommet du triangle de Koch, formé par l’orifice du sinus coronaire, l’anneau tricuspide et le tendon de Todaro. Cependant, en raison de la petite taille, la visualisation par histologie conventionnelle reste difficile et ne permet pas l’étude du SAN et de l’AVN dans leur environnement 3D.
Nous décrivons ici une approche d’immunofluorescence à montage entier qui permet la visualisation locale du SAN et de l’AVN marqués chez la souris. La coloration par immunofluorescence à montage entier est destinée à de plus petites sections de tissu sans nécessiter de section manuelle. À cette fin, le cœur de souris est disséqué, avec le tissu indésirable enlevé, suivi de la fixation, de la perméabilisation et du blocage. Les cellules du système de conduction dans le SAN et l’AVN sont ensuite colorées avec un anticorps anti-HCN4. La microscopie confocale à balayage laser et le traitement d’image permettent de différencier les cellules nodales et les cardiomyocytes fonctionnels, et de localiser clairement le SAN et l’AVN. En outre, des anticorps supplémentaires peuvent également être combinés pour marquer d’autres types de cellules, telles que les fibres nerveuses.
Par rapport à l’immunohistologie conventionnelle, la coloration par immunofluorescence à montage entier préserve l’intégrité anatomique du système de conduction cardiaque, permettant ainsi l’investigation de l’AVN; en particulier dans leur anatomie et leurs interactions avec le myocarde de travail environnant et les cellules non myocytaires.
Introduction
Les arythmies sont des maladies courantes qui touchent des millions de personnes et sont la cause d’une morbidité et d’une mortalité importantes dans le monde entier. Malgré d’énormes progrès dans le traitement et la prévention, tels que le développement de stimulateurs cardiaques, le traitement des arythmies reste difficile, principalement en raison des connaissances très limitées sur les mécanismes sous-jacents de la maladie 1,2,3. Une meilleure compréhension de l’électrophysiologie normale et de la physiopathologie des arythmies peut aider à développer des stratégies de traitement nouvelles, innovantes et causales à l’avenir. De plus, pour étudier de manière exhaustive l’arythmagénèse, il est important de localiser et de visualiser le système de conduction cardiaque spécifique dans des modèles animaux tels que la souris, car les souris sont largement utilisées dans la recherche en électrophysiologie.
Les principales parties du système de conduction cardiaque sont le nœud sino-auriculaire (SAN), où l’impulsion électrique est générée dans des cellules de stimulateur cardiaque spécialisées, et le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), qui est la seule connexion électrique entre les oreillettes et les ventricules4. Chaque fois que les propriétés électrophysiologiques du SAN et de l’AVN sont altérées, des arythmies telles que le syndrome du sinus malade ou le bloc auriculo-ventriculaire peuvent survenir, ce qui peut entraîner une détérioration hémodynamique, une syncope et même la mort, soulignant ainsi le rôle essentiel du SAN et de l’AVN dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse5.
Des études approfondies sur SAN ou AVN nécessitent une localisation et une visualisation précises des deux structures, idéalement dans leur environnement physiologique. Cependant, en raison de leur petite taille et de leur emplacement dans le myocarde de travail, sans établir une structure macroscopiquement visible clairement, l’étude de l’anatomie et de l’électrophysiologie du SAN et de l’AVN est difficile. Les repères anatomiques peuvent être utilisés pour identifier approximativement la région qui contient SAN et AVN 6,7,8. En bref, SAN est situé dans la région inter-cavale de l’oreillette droite adjacente à la crista terminalis musculaire (CT), AVN est situé dans le triangle de Koch établi par la valve tricuspide, l’ostium du sinus coronaire et le tendon de Todaro. Jusqu’à présent, ces repères anatomiques ont été principalement utilisés pour localiser, supprimer puis étudier SAN et AVN en tant que structures individuelles (par exemple, par histologie conventionnelle). Pour mieux comprendre l’électrophysiologie complexe du SAN et de l’AVN (par exemple, les effets régulateurs des cellules adjacentes du myocarde de travail), il est toutefois nécessaire d’étudier les systèmes de conduction dans l’environnement physiologique 3D.
La coloration par immunofluorescence à montage entier est une méthode utilisée pour étudier les structures anatomiques in situ tout en préservant l’intégrité des tissus environnants9. Tirant parti des logiciels de microscopie confocale et d’analyse d’images, SAN et AVN peuvent être visualisés avec des anticorps marqués par fluorescence ciblant les canaux ioniques spécifiquement exprimés dans ces régions.
Le protocole suivant explique les étapes nécessaires pour effectuer une méthode de coloration à monture entière bien établie pour la localisation et la visualisation des microscopes SAN et AVN. Plus précisément, ce protocole décrit comment (1) localiser le SAN et l’AVN par repères anatomiques pour préparer ces échantillons pour la coloration et l’analyse microscopique (2) effectuer une coloration par immunofluorescence à montage entier des marqueurs de référence HCN4 et Cx43 (3) préparer les échantillons SAN et AVN pour la microscopie confocale (4) effectuer l’imagerie confocale du SAN et de l’AVN. Nous décrivons également comment ce protocole peut être modifié pour inclure une coloration supplémentaire du myocarde de travail environnant ou des cellules non myocytaires telles que les fibres nerveuses autonomes, ce qui permet une étude approfondie du système de conduction cardiaque dans le cœur.
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Protocol
Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich, et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Les souris C57BL6/J ont été achetées au Jackson Laboratory.
NOTE: La figure 1 montre les instruments nécessaires à l’expérience. La figure 2 montre une illustration de l’anatomie cardiaque globale. La figure 3 montre l’emplacement du SAN et de l’AVN dans le cœur d’une souris adulte. La figure 4 montre l’échantillon préparé chargé sur la microscopie confocale.
1. Préparatifs
- Préparer une solution de formaldéhyde à 4 % (PFA à 4 %) en diluant 10 mL de solution de formaldéhyde à 16 % dans 30 mL de PBS.
- Préparer une solution de saccharose à 15 % et une solution de saccharose à 30 % en dissolvant 15 g et 30 g de poudre de saccharose dans 100 ml de PBS, respectivement. Une fois la poudre de saccharose complètement dissoute, filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm avant de la conserver à 4 °C.
- Préparez un gel d’agarose à 3%-4%, ajoutez 3 g ou 4 g de poudre d’agarose et 100 ml de 1x TAE (dilué dans 50x la solution mère TAE) dans un bécher. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et faites-le bouillir jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
- Préparer la boîte de dissection en versant doucement 30 ml de gel d’agarose (3 % à 4 %) dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre. Laissez la boîte de Petri sur le banc à température ambiante pour refroidir et durcir.
- Préparer la solution de blocage et la solution de lavage selon les recettes fournies dans le tableau 1. Préparez toutes les solutions préparées le jour de l’utilisation. Le stockage à long terme n’est pas recommandé.
- Préparer les solutions d’anticorps en les diluant dans du froid (4 °C) 1x PBS, protéger la dilution de la lumière (p. ex., en enroulant du papier d’aluminium) et conserver les dilutions sur la glace jusqu’à utilisation. Diluer les anticorps peu de temps avant l’incubation. Évitez de laisser les anticorps dilués à température ambiante.
REMARQUE : La dilution appropriée des anticorps doit être testée avec des échantillons de tissus comparables en effectuant une coloration immunofluorescente conventionnelle. Ici, nous avons testé les anticorps en colorant des sections congelées coupées sur une épaisseur de 10 μm.
2. Prélèvement d’organes et préparation de tissus
- Anesthésiez la souris en la plaçant dans une chambre d’incubation reliée à un vaporisateur d’isoflurane. Réglez le vaporisateur pour qu’il fournisse 4 à 5 % d’isoflurane (96 à 95 % d’oxygène, respectivement).
REMARQUE: L’anesthésie complète est confirmée par la perte de la réaction posturale et du réflexe de redressement en roulant doucement la chambre jusqu’à ce que la souris soit placée sur le dos. - Placez la souris en décubitus dorsal sur la table chirurgicale. Placez le nez de la souris dans un masque d’anesthésie relié à un circuit Bain modifié avec son tube intérieur connecté au vaporisateur d’isoflurane. Pour maintenir l’anesthésie, utilisez 1-2% d’isoflurane dans l’oxygène à un débit de 1 L / min. Récupérez l’excès de vapeur anesthésique de la souris via le tube extérieur du masque et aspirez à travers une cartouche de charbon actif, qui absorbe l’excès de gaz anesthésique.
- Lorsque l’anesthésie complète est obtenue, injecter du fentanyl pour l’analgésie (0,1 μg/25 g de poids corporel i.p.).
- Lorsque le réflexe de pincement des orteils est indétectable, faites une coupe claire du jugulaire à la symphyse en utilisant des ciseaux d’iris pour enlever la fourrure et la peau. Faites une autre coupe de gauche à droite sous les côtes en utilisant des ciseaux d’iris pour ouvrir soigneusement l’abdomen.
- Vivez un peu le xiphoïde en utilisant des pinces incurvées pour permettre de couper le diaphragme de gauche à droite sans blesser aucun organe. Coupez la cage thoracique en une ligne axillaire médiale des deux côtés à l’aide de ciseaux à iris pour la retourner crânienne et permettre l’accès au cœur.
- Couper la veine cave inférieure et l’aorte thoracique descendante au niveau du diaphragme à l’aide de ciseaux d’iris. Percez le cœur avec une aiguille de 27 G dans la région de l’apex, puis poussez soigneusement l’aiguille dans le ventricule gauche (LV). Injectez doucement 5 à 10 ml de PBS glacé dans le VG pour perfuser le cœur.
REMARQUE: La couleur du cœur doit passer du rouge au gris indiquant une perfusion réussie avec PBS. - Soulevez délicatement l’apex du cœur à l’aide d’une pince à épiler permettant de couper les gros vaisseaux et d’enlever le cœur.
- Extrayez le cœur en coupant les grosses artères et les veines aussi loin que possible du cœur pour éviter tout dommage à la veine cave supérieure (SVC). Conservez le SVC car il servira de point de repère important lors du traitement ultérieur.
- Après le retrait du cœur, éteignez le vaporisateur d’isoflurane.
- Mettez le cœur dans une boîte de dissection remplie de PBS glacé sous le microscope à dissection. Après détermination de la gauche / droite et de l’avant / arrière du cœur, tournez le cœur avec l’avant du cœur au fond du plat (pour exposer les gros vaisseaux situés à l’arrière).
- Immobiliser le cœur en plaçant de petites épingles à travers l’apex et l’appendice auriculaire gauche (AAL) dans l’agarose au fond de la boîte de dissection (Figure 2A). À l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux, retirez délicatement le tissu non cardiaque autour du CVS et de la veine cave inférieure (IVC) (p. ex. poumons, graisse, péricarde) pour exposer la région intercavale (figure 3A).
- Retirez la majorité des ventricules en coupant parallèlement la rainure entre les ventricules et les oreillettes avec le micro ciseau. Conservez une petite partie du tissu ventriculaire pour la charge ultérieure sur l’anneau en plexiglas.
- Pour la fixation et la déshydratation, mettre l’échantillon (contenant les oreillettes, le SVC et l’IVC) dans 4% PFA pendant une nuit à 4 °C.
- Le lendemain, transférer le cœur dans une solution de saccharose à 15% pendant 24 heures à 4 °C.
- Le lendemain, transférer le cœur dans une solution de saccharose à 30% pendant 24 heures à 4 °C.
NOTE: Pour la fixation et la déshydratation aux étapes 2.13, 2.14 et 2.15, les échantillons sont laissés à 4 °C sans autre agitation ni balancement.
3. Coloration par immunofluorescence à montage entier
- Laver le cœur dans du Triton X-100 à 1 % dilué dans du PBS et bloquer et perméabiliser dans une solution de blocage (tableau 1) pendant une nuit à 4 °C.
- Placer le cœur dans un tube de 1,5 mL et incuber avec des anticorps anti-souris de lapin connexin-43 (dilution de 1:200) et de rats anti-souris HCN4 (dilution de 1:200) dilués avec une solution bloquante pendant 7 jours à 4 °C.
REMARQUE : La concentration optimale d’anticorps primaires doit être testée avant d’utiliser les fiches techniques comme orientation. D’autres antigènes d’intérêt pourraient également être colorés à cette étape, à condition que l’espèce hôte de l’antigène primaire soit différente des autres. Une concentration plus élevée de Triton X-100 peut aider à obtenir une coloration plus efficace des anticorps, comme démontré avant10, mais la concentration peut être déterminée individuellement. - Après 7 jours, retirer la solution contenant les anticorps primaires à l’aide d’une pipette et laver le cœur avec la solution 1% Triton X-100 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le vibreur orbital).
- Après lavage, incuber le cœur = avec Alexa Fluor 488 chèvre anti-rat IgG (dilution de 1:200) et Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (dilution de 1:200) pendant 7 jours à 4 °C.
- Après 7 jours, retirer toute la solution contenant les anticorps secondaires à l’aide d’une pipette. Ensuite, laver le cœur avec une solution de lavage (tableau 1) 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le shaker orbital).
- Pour colorer les noyaux, incuber le cœur dans une solution DAPI (10 μg/mL) pendant une nuit à 4 °C.
- Le lendemain, laver le cœur avec une solution de lavage 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le shaker orbital).
NOTE: Pour le blocage, la perméabilisation, l’incubation d’anticorps et la coloration DAPI aux étapes 3.1, 3.2, 3.4 et 3.6, laisser les échantillons à l’état d’équilibre à 4 °C, aucune agitation n’est nécessaire. Le tissu coloré a pu être conservé entièrement recouvert d’une solution de lavage à 4 °C et protégé de la lumière pendant quelques jours jusqu’à l’imagerie au microscope confocal.
4. Microscopie confocale
- Préparez des bagues en plexiglas et remplissez-les de pâte à modeler (Figure 1). Au centre de la pâte à modeler, une petite rainure se forme au centre pour charger le cœur. Faire une rainure peu profonde, car il serait plus facile d’acquérir un plan d’imagerie plat, et d’ajuster l’espace et d’éviter les bulles d’air entre l’échantillon et les lamelles de couverture à l’étape 4.4.
- Utilisez le même échantillon cardiaque pour l’imagerie séquentielle du SAN et de l’AVN. Pour l’imagerie SAN, chargez directement le cœur tandis que pour l’imagerie AVN, effectuez la microdissection avant.
- Imagerie SAN
- Identifier le SAN par des repères anatomiques : il est situé sur la face dorsale du cœur dans la région inter-cavale (la région entre la veine cave supérieure et inférieure). La crista terminalis (CT) est la strie musculaire entre le SAN et le RAA.
- Placez le cœur dans la rainure de pâte à modeler avec l’arrière du cœur tourné vers le haut. Ajoutez du PBS sur le cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit complètement recouvert de PBS (généralement quelques gouttes de PBS suffisent).
- Sous le microscope à dissection, presser doucement le RAA, le LAA et les parties restantes du ventricule gauche dans la pâte à modeler pour fixer le cœur. Assurez-vous que toute la région inter-cavale et la crista terminalis sont clairement visibles (non recouvertes de pâte à modeler). La zone qui sera imagée est illustrée à la figure 3A.
- Imagerie AVN
- Une fois l’imagerie du SAN terminée, prélevez le même échantillon et utilisez-le ensuite pour l’imagerie AVN. Pour la microdissection AVN, placer le cœur = sur une boîte de dissection au microscope à dissection.
- Orientez le cœur avec le côté droit tourné vers le haut (y compris les parties restantes du ventricule droit). Placez des broches à travers la partie restante de la paroi libre BT (qui se trouve maintenant en bas) pour immobiliser le tissu (Figure 2B).
- Coupez le mur libre de VR restant vers le haut à travers la valve tricuspide et la veine cave supérieure. Ensuite, retournez le VR et la PR pour exposer le septum interventriculaire et interauriculaire. (Figure 3B)
REMARQUE: Faites attention à ne pas endommager le sinus coronaire (CS), car c’est un repère anatomique important pour trouver le triangle de Koch qui permet ensuite de localiser l’AVN. Le CS passe transversalement dans la rainure auriculo-ventriculaire gauche du côté postérieur du cœur, et l’ouverture de l’orifice CS est située entre IVC et la valve tricuspide à la partie inférieure du septum interauriculaire (Figure 3A et B). - Identifier le triangle de Koch qui se trouve sur la surface endocardique de l’oreillette droite, bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide (TV) et postérieurement par le tendon de Todaro. La base est formée par l’orifice du sinus coronaire (Figure 3B). Comme il s’agit de la région cible pour l’imagerie AVN, elle doit être clairement visible.
- Transférez le cœur dans la rainure de pâte à modeler à l’intérieur de l’anneau en plexiglas avec le triangle de Koch clairement exposé (c’est-à-dire non recouvert de pâte à modeler). Pressez doucement le tissu autour du triangle de Koch dans la pâte à modeler pour fixer l’échantillon. Ajoutez du PBS sur le cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit complètement recouvert de PBS (généralement quelques gouttes de PBS suffisent).
- Imagerie SAN
- Appliquez du silicone sur les bords des anneaux en plexiglas pour permettre de couvrir les cœurs chargés dans les anneaux en plexiglas remplis de pâte à modeler avec des lamelles de couverture.
- Appuyez doucement sur la face arrière de la pâte à modeler pour extraire des parties du PBS et attacher le cœur à la lamelle de couverture tout en évitant toute bulle d’air dans la zone d’imagerie.
REMARQUE: Assurez-vous que les régions d’intérêt ne sont pas pliées et couvertes lors de la pression sur la face arrière de la pâte à modeler. Un plan d’imagerie plat sans surcompression de l’échantillon est nécessaire pour conserver l’anatomie et pour une imagerie confocale correcte des échantillons. Pour le SAN, il est important de s’assurer que la région inter-cavale est clairement exposée. Pour AVN, le triangle de Koch doit être entièrement exposé. - Placez les échantillons de coloration à montage entier à l’envers sur la plate-forme du microscope confocal. Le SAN/AVN exposé fixé à la glissière de couvercle se trouve maintenant au bas de la plate-forme du microscope (Figure 4).
REMARQUE: Pour prendre des images, nous utilisons le Carl Zeiss LSM800 avec l’unité Airyscan et le logiciel ZEN 2.3 SP1 noir. - Choisissez la plaque « BP420-480 + LP605 » pour l’excitation de l’anti-HCN4 conjugué Alexa Fluor 647. Variez le gain principal de 650-750.
- Prenez une image globale de l’ensemble de la région SAN et AVN à l’aide de la fonction Tile Scan . Sélectionnez ensuite la région HCN4 positive en cliquant et en ajoutant un carré sur l’image de vue d’ensemble autour de la zone d’intérêt qui sera analysée.
- Vérifiez les paramètres, y compris les plaques et le gain principal pour les canaux restants (Alexa Fluor 488 et DAPI) du microscope confocal et réglez-les comme décrit à l’étape 4.6.
- Ajustez lentement la mise au point de haut en bas de l’échantillon pour prévisualiser l’échantillon entier et définir le premier et le dernier pour la plage Z-stack. Définissez un intervalle optimal pour la pile Z en fonction de l’épaisseur de l’échantillon optique. Nous utilisons un objectif 20x, et 0,8-1 μm comme intervalle pour Z-stack.
- Une fois tous les paramètres correctement définis, analysez toute la zone du SAN et de l’AVN.
- Effectuer une reconstruction 3D des images à l’aide d’un logiciel (par exemple, Imaris version 8.4.2).
- Sélectionner le traitement des images | Soustraction de base pour éliminer les taches de fond.
- Sélectionnez la création de surface sur le paramètre du canal et de la région d’intérêt sélectionnés pour le traitement.
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Representative Results
En utilisant le protocole décrit ci-dessus, l’imagerie par microscopie confocale du SAN et de l’AVN peut être réalisée de manière fiable. La coloration spécifique du système de conduction à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant HCN4 et la coloration du myocarde de travail à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant Cx43 permettent l’identification claire du SAN (Figure 5, Vidéo 1) et de l’AVN (Figure 6, Vidéo 2) dans l’anatomie intacte.
Figure 1 : Instruments pour dissection et support d’anneau en plexiglas. A. Anneau en plexiglas rempli de pâte à modeler (la flèche rouge montre la rainure formée au centre pour charger le cœur). B. Dissection de la boîte de Petri avec du gel d’agarose. C. Ciseaux de printemps. D. Ciseaux iris. E. Pinces incurvées. F. Pinces fines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustration de l’anatomie cardiaque globale. A. Illustration schématique de la microdissection SAN. Les broches sont appliquées à travers l’apex et l’appendice auriculaire gauche (AAL). SAN est indiqué par un cercle pointillé rouge. B. Illustration schématique de la microdissection AVN. Les broches sont placées à travers la partie restante du mur libre BT (qui est maintenant en bas). AVN est indiqué par un cercle pointillé rouge. SVC, veine cave supérieure; IVC, veine cave inférieure; CS, sinus coronaire; AAL, appendice auriculaire gauche; RAA, appendice auriculaire droit; PA, artère pulmonaire; PV, veine pulmonaire; LV, ventricule gauche; IVS, septum interventriculaire; IAS, septum interauriculaire; OF, fosse ovale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Emplacement du SAN et de l’AVN dans un cœur de souris adulte. A. Emplacement du nœud sino-auriculaire (SAN) dans un cœur de souris adulte. Vue du fond du cœur. L’emplacement du SAN est indiqué par une ligne pointillée rouge dans la région inter-cavale (lignes pointillées noires). SVC, veine cave supérieure; IVC, veine cave inférieure; CS, sinus coronaire; AAL, appendice auriculaire gauche; RAA, appendice auriculaire droit; PV, veine pulmonaire; CT, Crista terminalis; LV, ventricule gauche; RV, ventricule droit. B. Localisation du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans un cœur de souris adulte. Vue de droite. L’AVN (cercle pointillé rouge) est situé au sommet du triangle de Koch (triangle pointillé blanc) près du bas du septum membraneux. Le triangle de Koch est formé par le tendon de Todaro (TT, ligne pointillée verte), la valve tricuspide (TV, ligne pointillée bleue) et l’orifice du sinus coronaire (CS, ligne pointillée jaune). SVC, veine cave supérieure; IVC, veine cave inférieure; IVS, septum interventriculaire; OF, fosse ovale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Echantillon préparé chargé sur la microscopie confocale. L’échantillon préparé (flèche rouge) pour la microscopie confocale monté dans la bague en plexiglas avec de la pâte à modeler (flèche noire). Vue d’en bas. B. Anneau en plexiglas avec échantillon monté chargé à l’envers sur la plate-forme du microscope confocal (microscope inverse). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Reconstruction de l’imagerie par microscopie confocale du SAN chez une souris C57BL6/J colorée avec des anticorps anti-HCN4 (rouge) et Cx43 (blanc). Un. La zone pointillée délimite le SAN, qui est orienté le long de la région inter-cavale entre la veine cave supérieure et inférieure. B. Agrandissement de l’incrustation à partir du panneau A. C. Reconstruction 3D du panneau B. RAA, appendice auriculaire droit; RA, oreillette droite; SAN, nœud sino-auriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 6. Reconstruction de l’imagerie par microscopie confocale de l’AVN chez une souris C57BL6/J colorée avec des anticorps anti-HCN4 (rouge) et Cx43 (blanc). Un. La zone pointillée indique l’AVN. B. Agrandissement de l’incrustation à partir du panneau A. C. Reconstruction 3D du panneau B. IVS, septum interventriculaire; IAS, septum interauriculaire; AVN, nœud auriculo-ventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 7. Image de contrôle négatif. Un. coloration de montage entier de contrôle négatif pour SAN. Le cercle pointillé montrait la région SAN confirmée par les repères anatomiques. B. coloration de contrôle négatif pour le SAN uniquement avec des anticorps secondaires. C. Coloration DAPI pour SAN. D . coloration témoin négatif pour AVN. Le cercle pointillé montrait la région AVN confirmée par les repères anatomiques. E . coloration de contrôle négatif pour AVN uniquement avec les seconds anticorps. F. coloration DAPI pour AVN. RAA, appendice auriculaire droit; RA, oreillette droite; SVC, veine cave supérieure; IVS, septum interventriculaire; IAS, septum interauriculaire; Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Reconstruction 3D du SAN Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Reconstruction 3D de l’AVN Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
| Composé | Concentration finale | g ou mL/100 mL requis | |
| Solution de fixation | |||
| Formaldéhyde (16 %) | 4% | 25 mL | |
| PBS (1x) | 75 mL | ||
| Solution de Triton à 1 % | |||
| Triton X100 | 1% | 1 mL | |
| PBS | 99 mL | ||
| Solution bloquante | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| Sérum de chèvre normal | 20% | 20 mL | |
| PBS (1x) | 89 mL | ||
| Solution de lavage | |||
| Préadolescent 20 | 0.10% | 0,1 mL | |
| BSA | 0.50% | 0,5 g | |
| PBS (1x) | 99,9 mL | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g | |
| 100% acide acétique | 5.71% | 5,71 mL | |
| 0,5 M d’EDTA | 0,05 M | 10 mL | |
| dH2O | Ajouter jusqu’à 100 mL | ||
Tableau 1.
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Discussion
L’anatomie cardiaque a traditionnellement été étudiée à l’aide de coupes histologiques minces11. Cependant, ces méthodes ne préservent pas la structure tridimensionnelle du système de conduction et ne fournissent donc que des informations 2D. Le protocole de coloration par immunofluorescence à montage complet décrit ici permet de surmonter ces limitations et peut être utilisé en routine pour l’imagerie SAN et AVN.
Par rapport aux méthodes standard telles que l’immunohistochimie conventionnelle qui nécessitent l’incorporation de paraffine, la section et le prélèvement d’antigènes, la méthodologie de montage entier est avantageuse pour traiter la localisation et la morphologie 3D exactes du SAN et de l’AVN, et pour examiner la relation avec le tissu environnant puisque la morphologie tissulaire est considérablement préservée avec seulement une déshydratation tissulaire minimale et une rupture physique. En outre, l’immunoréactivité (c’est-à-dire la liaison des anticorps aux antigènes tissulaires) est également fortement maintenue.
Nous avons établi une méthode pratique de procession d’échantillons pour la microscopie confocale en utilisant un support monté sur anneau en plastique rempli de pâte à modeler12,13. La pâte à modeler est idéale car elle peut être ajustée individuellement à la taille du tissu, elle est assez dure pour maintenir le tissu de manière fiable sans pression excessive du tissu. Plus important encore, il n’est pas fluorescent, évitant le fond auto-fluorescent et n’interférant donc pas avec le signal fluorescent des anticorps utilisés.
Nous avons utilisé le microscope confocal à balayage laser (LSM-Zeiss) avec le détecteur Airyscan, qui peut offrir un avantage distinct pour obtenir des images de haute qualité. L’utilisation d’un microscope imageur à grand champ ne peut offrir que des informations au niveau tissulaire, mais manque de résolution cellulaire. De plus, le microscope grand champ comporte un risque de fond élevé14. En utilisant un détecteur Airyscan pour LSM confocale, il est possible d’obtenir une résolution et un rapport signal sur bruit (SNR) améliorés, par rapport au système d’imagerie confocale traditionnel à un sténopé et détecteur15.
Les formes et la position du SAN et de l’AVN sont présentées comme une reconstruction 3D et des plans de section virtuels supplémentaires dérivés de la reconstruction 3D peuvent améliorer l’interprétation des sections histologiques, alors que l’histologie conventionnelle ne permet qu’une évaluation 2D de l’anatomie avec le risque inhérent de non-détection de structures petites mais pertinentes. De plus, la reconstruction 3D offre la possibilité d’examiner les structures anatomiques d’intérêt transmural et au sein du microenvironnement intact, par exemple le plex nerveux autonome intrinsèque innervant le cœur16. La coloration in situ à montage complet et la reconstruction 3D permettent d’étudier l’environnement cellulaire ainsi que les types de cellules spécifiques et leur orientation. De plus, l’expression protéique régionale et spécifique au type cellulaire peut être visualisée et peut soutenir davantage les analyses Western blot et protéomiques17.
SAN et AVN sont des structures spécialisées dans le cœur avec un modèle d’expression différent des canaux ioniques et des connexines qui peuvent être utilisés pour une identification fiable10,18. Les canaux cationiques nucléotidiques cycliques activés par hyperpolarisation (HCN) établissent la dépolarisation diastolique dans les cellules du stimulateur cardiaque et sont donc spécifiquement exprimés dans le système de conduction, HCN4 étant l’isoforme prédominante chez la souris19. Des études ont montré que HCN4 est l’une des isoformes de HCN détectables et exprimées de manière stable dans l’ensemble du SAN et de l’AVN11,20. Les connexines relient directement les cellules voisines et permettent le passage des ions d’une cellule à l’autre; Ils sont donc essentiels pour la conduction de l’impulsion électrique à travers le cœur21. Les profils d’expression de la connexine varient entre les différentes régions du cœur, Cx43 étant l’isoforme la plus abondante qui a été trouvée dans presque toutes les parties du cœur, à l’exception du SAN et de l’AVN22. La combinaison de la microdissection pour permettre l’exposition de régions d’intérêt spécifiques avec des anticorps anti-HCN4 et anti-CX43 ainsi que des approches in silico pour la reconstruction tridimensionnelle d’images confocales permettent une identification fiable du SAN et de l’AVN et une étude complète de la morphologie SAN/AVN ainsi que de leur interaction avec les tissus environnants.
Le SAN et l’AVN peuvent être faciles à distinguer après coloration avec un anticorps spécifique. Cependant, pour localiser le SAN et l’AVN par leurs repères anatomiques, une certaine pratique est nécessaire avant que la microdissection correcte puisse être effectuée.
En utilisant le protocole ci-dessus, un certain nombre d’autres antigènes peuvent également être appliqués. Le protocole fonctionne également bien sur les tissus fixés à la perfusion et à immersion. Cependant, le temps d’incubation peut être ajusté pour une fixation optimale puisque certains anticorps présentent une immunoréactivité réduite lorsque l’antigène est surfixé. Comme l’approche de coloration à montage entier nécessite 7 jours pour l’incubation d’anticorps primaires et secondaires, il est important de submerger complètement les échantillons dans des volumes adéquats de solutions contenant des anticorps. Le taux de dilution de chaque anticorps doit être testé avant l’expérience. Pour une coloration optimale, tout tissu non pertinent doit être enlevé. Pour le protocole, nous n’avons conservé que de petites parties des ventricules pour une meilleure orientation et enlever tout le tissu adipeux environnant et les veines pulmonaires, car le tissu environnant (non pertinent) pourrait également se lier aux anticorps, en particulier lorsque les antigènes cibles sont exprimés globalement.
La coloration in situ à montage entier, l’imagerie confocale et la reconstruction 3D sont des techniques inestimables et puissantes pour les chercheurs de divers domaines. Cependant, la méthode a également certaines limites. i) Il nécessite du matériel spécialisé tel qu’un microscope confocal qui n’est pas couramment disponible dans tous les établissements. (ii) Comme mentionné ci-dessus, la microdissection de structures anatomiques spécialisées telles que le SAN ou l’AVN, mais aussi l’imagerie confocale et le traitement post-imagerie, nécessitent un personnel intensif et expérimenté. (iii) Le succès de la méthode dépend fortement de la qualité des anticorps utilisés et peut donc être très difficile dans certains cas. De plus, (iv) la reconstruction 3D peut être difficile à réaliser et peut nécessiter un dépannage intensif pour optimiser la procédure. Par exemple, des intervalles optimaux doivent être définis lors de l’acquisition de l’image, car des sections trop espacées laisseront des espaces et pourraient ne pas permettre une reconstruction 3D adéquate de l’anatomie. Les sections trop proches peuvent provoquer un suréchantillonnage et un blanchiment en raison de l’éclairage excessif et prendront beaucoup de temps pour compléter une image. Enfin (v) la principale limitation de la microscopie confocale est la profondeur d’imagerie, ce qui signifie que si l’épaisseur de l’échantillon est supérieure à la profondeur de fonctionnement maximale du microscope confocale, le fluorophore supplémentaire ne peut pas être détecté.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à H. Ishikawa-Ankerhold et S. Massberg et projet A10 à C. Schulz), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
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Médecine numéro 166 ganglion sino-auriculaire ganglion auriculo-ventriculaire cardiologie électrophysiologie système de conduction cardiaque microdissection immunofluorescence microscopie confocaleErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
