ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Vi tillhandahåller ett steg-för-steg-protokoll för helmonterad immunofluorescensfärgning av sinoatriell nod (SAN) och atrioventrikulär nod (AVN) i murina hjärtan.
Abstract
Den elektriska signalen som fysiologiskt genereras av pacemakerceller i den sinoatriella noden (SAN) leds genom ledningssystemet, vilket inkluderar den atrioventrikulära noden (AVN), för att möjliggöra excitation och sammandragning av hela hjärtat. Eventuell dysfunktion av antingen SAN eller AVN resulterar i arytmier, vilket indikerar deras grundläggande roll i elektrofysiologi och arytmogenes. Musmodeller används ofta inom arytmiforskning, men den specifika undersökningen av SAN och AVN är fortfarande utmanande.
SAN ligger vid korsningen av crista terminalis med överlägsen vena cava och AVN ligger vid toppen av triangeln Koch, bildad av öppningen av koronar sinus, tricuspid annulus och senan i Todaro. På grund av den lilla storleken är visualisering med konventionell histologi fortfarande utmanande och det tillåter inte studier av SAN och AVN inom deras 3D-miljö.
Här beskriver vi en helmonterad immunofluorescensmetod som möjliggör lokal visualisering av märkt mus SAN och AVN. Helmonterad immunofluorescensfärgning är avsedd för mindre delar av vävnad utan behov av manuell sektionering. För detta ändamål dissekeras mushjärtat, med oönskad vävnad borttagen, följt av fixering, permeabilisering och blockering. Celler i ledningssystemet inom SAN och AVN färgas sedan med en anti-HCN4-antikropp. Konfokal laserskanningsmikroskopi och bildbehandling möjliggör differentiering mellan nodala celler och fungerande kardiomyocyter och att tydligt lokalisera SAN och AVN. Dessutom kan ytterligare antikroppar kombineras för att märka andra celltyper, såsom nervfibrer.
Jämfört med konventionell immunohistologi bevarar helmonterad immunofluorescensfärgning den anatomiska integriteten hos hjärtledningssystemet, vilket möjliggör undersökning av AVN; speciellt så i deras anatomi och interaktioner med de omgivande arbetande myokardium- och icke-myocytcellerna.
Introduction
Arytmier är vanliga sjukdomar som drabbar miljontals människor och orsakar betydande sjuklighet och dödlighet över hela världen. Trots enorma framsteg inom behandling och prevention, såsom utveckling av pacemakers, är behandling av arytmier fortfarande utmanande, främst på grund av den mycket begränsade kunskapen om underliggande sjukdomsmekanismer 1,2,3. En bättre förståelse för både normal elektrofysiologi och patofysiologi av arytmier kan bidra till att utveckla nya, innovativa och kausala behandlingsstrategier i framtiden. För att omfattande studera arytmogenes är det dessutom viktigt att lokalisera och visualisera det specifika hjärtledningssystemet i djurmodeller som musen, eftersom möss används ofta inom elektrofysiologisk forskning.
De viktigaste delarna av hjärtledningssystemet är den sinoatriella noden (SAN), där den elektriska impulsen genereras i specialiserade pacemakerceller, och den atrioventrikulära noden (AVN), som är den enda elektriska förbindelsen mellan förmaken och ventriklerna4. När de elektrofysiologiska egenskaperna hos SAN och AVN förändras kan arytmier såsom sick sinus syndrom eller atrioventrikulärt block uppstå, vilket kan leda till hemodynamisk försämring, synkope och till och med död, och därmed understryka den väsentliga rollen för både SAN och AVN i elektrofysiologi och arytmogenes5.
Omfattande studier av SAN eller AVN kräver en exakt lokalisering och visualisering av båda strukturerna, helst inom deras fysiologiska miljö. Men på grund av deras lilla storlek och placering inom arbetsmyokardiet, utan att skapa en tydlig makroskopiskt synlig struktur, är det utmanande att studera anatomi och elektrofysiologi hos SAN och AVN. Anatomiska landmärken kan användas för att grovt identifiera regionen som innehåller SAN och AVN 6,7,8. I korthet ligger SAN i mellankavalregionen i det högra atriumet intill den muskulära crista terminalis (CT), AVN ligger inom triangeln Koch etablerad av tricuspidventilen, ostium i koronar sinus och senan i Todaro. Hittills har dessa anatomiska landmärken huvudsakligen använts för att lokalisera, ta bort och sedan studera SAN och AVN som enskilda strukturer (t.ex. genom konventionell histologi). För att bättre förstå den komplexa elektrofysiologin hos SAN och AVN (t.ex. reglerande effekter av intilliggande celler i arbetsmyokardiet) är det dock nödvändigt att studera ledningssystemen inom den fysiologiska 3D-miljön.
Helmonterad immunofluorescensfärgning är en metod som används för att studera anatomiska strukturer in situ samtidigt som integriteten hos den omgivande vävnaden bevaras9. Med hjälp av programvara för konfokalmikroskopi och bildanalys kan SAN och AVN visualiseras med fluorescerande märkta antikroppar riktade mot jonkanaler specifikt uttryckta i dessa regioner.
Följande protokoll förklarar de nödvändiga stegen för att utföra en väletablerad helmonterad färgningsmetod för lokalisering och visualisering av SAN- och AVN-mikroskop. Specifikt beskriver detta protokoll hur (1) att lokalisera SAN och AVN genom anatomiska landmärken för att förbereda dessa prover för färgning och mikroskopianalys (2) att utföra helmonterad immunofluorescensfärgning av referensmarkörerna HCN4 och Cx43 (3) för att förbereda SAN- och AVN-prover för konfokalmikroskopi (4) för att utföra konfokal avbildning av SAN och AVN. Vi beskriver också hur detta protokoll kan modifieras för att inkludera ytterligare färgning av omgivande fungerande myokardium- eller icke-myocytceller, såsom autonoma nervfibrer, vilket möjliggör en grundlig undersökning av hjärtledningssystemet i hjärtat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård och alla experimentella förfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna från djurvårds- och etikkommittén vid universitetet i München, och alla förfaranden som genomfördes på möss godkändes av regeringen i Bayern, München, Tyskland (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J-möss köptes från Jackson Laboratory.
OBS: Figur 1 visar de instrument som behövs för experimentet. Figur 2 visar en illustration av den grova hjärtanatomin. Figur 3 visar platsen för SAN och AVN i ett vuxet mushjärta. Figur 4 visar det förberedda provet laddat på konfokalmikroskopin.
1. Förberedelser
- Förbered en 4% formaldehydlösning (4% PFA) genom att späda 10 ml 16% formaldehydlösning i 30 ml PBS.
- Bered en 15% sackaroslösning och 30% sackaroslösning genom att lösa 15 g respektive 30 g sackarospulver i 100 ml PBS. När sackarospulvret är helt upplöst, filtrera lösningen med 0,2 μm sprutfilter före förvaring vid 4 °C.
- Bered en agarosgel på 3–4 %, tillsätt 3 g eller 4 g agarospulver och 100 ml 1x TAE (utspädd från 50x TAE-lösning) i en bägare. Placera bägaren på en magnetomrörare och koka den tills agarosen är helt upplöst.
- Förbered dissektionsskålen genom att försiktigt hälla 30 ml agarosgel (3% -4%) i en petriskål med en diameter på 100 mm. Låt petriskålen stå på bänken vid rumstemperatur för att svalna och stelna.
- Förbered blockeringslösning och tvättlösning enligt recepten i tabell 1. Förbered alla lösningar som är beredda på användningsdagen. Långtidsförvaring rekommenderas inte.
- Bered antikroppslösningarna genom att späda dem i kallt (4 °C) 1x PBS, skydda spädningen från ljus (t.ex. genom att linda aluminiumfolie runt) och förvara spädningarna på is tills de används. Späd antikropparna strax före inkubation. Undvik att lämna de utspädda antikropparna vid rumstemperatur.
OBS: Lämplig antikroppsutspädning bör testas med jämförbara vävnadsprover genom att utföra en konventionell immunofluorescerande färgning. Här testade vi antikropparna genom att färga frysta sektioner skurna med en tjocklek av 10 μm.
2. Organskörd och vävnadsberedning
- Bedöva musen genom att placera den i en inkubationskammare ansluten till en isofluranförångare. Ställ in förångaren på att leverera 4-5% isofluran (96-95% syre, respektive).
OBS: Full anestesi bekräftas av förlusten av den posturala reaktionen och rätningsreflexen genom att försiktigt rulla kammaren tills musen placeras på ryggen. - Sätt musen i ryggläge på operationsbordet. Placera musnosen i en anestesimask ansluten till en modifierad Bain-krets med dess innerrör ansluten till isofluranförångaren. För att upprätthålla anestesi, använd 1-2% isofluran i syre vid en flödeshastighet av 1 l/min. Rensa bort överflödig bedövningsånga från musen via maskens yttre rör och dra genom en behållare med aktivt kol, som absorberar överskottet av bedövningsgas.
- När full anestesi uppnås, injicera fentanyl för analgesi (0,1 μg / 25 g kroppsvikt i.p.).
- När tå-nypreflexen är omöjlig att upptäcka, gör ett tydligt snitt från jugulum till symfysen med irissax för att ta bort päls och hud. Gör ett annat snitt från vänster till höger under revbenen med irissax för att försiktigt öppna buken.
- Liv xiphoid lite med hjälp av böjda pincett för att möjliggöra skärning av membranet från vänster till höger utan att skada några organ. Skär bröstkorgen i en medial axillär linje på båda sidor med irissax för att vända den kraniellt och för att ge åtkomst till hjärtat.
- Skär den sämre vena cava och nedåtgående bröstaorta vid membranets nivå med irissax. Punktera hjärtat med en 27 G nål i spetsområdet och tryck sedan försiktigt in nålen i vänster kammare (LV). Injicera försiktigt 5-10 ml iskall PBS i LV för att perfusera hjärtat.
OBS: Hjärtans färg ska vända från rött till grått vilket indikerar framgångsrik perfusion med PBS. - Lyft försiktigt toppen av hjärtat med en pincett som gör det möjligt att skära de stora kärlen och ta bort hjärtat.
- Punktskatta hjärtat genom att skära de stora artärerna och venerna så långt bort från hjärtat som möjligt för att undvika skador på överlägsen vena cava (SVC). Bevara SVC eftersom det kommer att fungera som ett viktigt landmärke under senare bearbetning.
- Efter hjärtborttagning, stäng av isofluranförångaren.
- Lägg hjärtat i en dissektionsskål fylld med iskall PBS under dissekeringsmikroskopet. Efter bestämning av vänster / höger och främre / bakre delen av hjärtat, vänd hjärtat med framsidan av hjärtat längst ner på skålen (för att exponera de stora kärlen som ligger bakom).
- Immobilisera hjärtat genom att sätta små stift genom toppen och vänster förmaksbihang (LAA) i agarosen längst ner på dissektionsskålen (figur 2A). Använd fin pincett och sax, ta försiktigt bort icke-kardiell vävnad runt SVC och sämre vena cava (IVC) (t.ex. lungor, fett, hjärtsäck) för att exponera interkavalregionen (figur 3A).
- Ta bort majoriteten av ventriklerna genom att skära parallellt spåret mellan ventriklerna och förmaken med mikrosaxen. Bevara en liten del av den ventrikulära vävnaden för senare belastning på plexiglasringen.
- För fixering och dehydrering, lägg provet (innehållande förmak, SVC och IVC) i 4 % PFA över natten vid 4 °C.
- Nästa dag, överför hjärtat till 15% sackaroslösning i 24 timmar vid 4 °C.
- Nästa dag, överför hjärtat till 30% sackaroslösning i 24 timmar vid 4 °C.
Anmärkning: För fixering och dehydratisering i steg 2.13, 2.14 och 2.15 lämnas proverna vid 4 °C utan ytterligare omrörning eller gungning.
3. Helmonterad immunofluorescensfärgning
- Tvätta hjärtat i 1 % Triton X-100 utspätt i PBS och blockera och permeabilisera i blockerande lösning (tabell 1) över natten vid 4 °C.
- Placera hjärtat i ett 1,5 ml rör och inkubera med kaninantimuskonnexin-43 (spädning 1:200) och råttantimus HCN4 (spädning 1:200) antikroppar utspädda med blockerande lösning i 7 dagar vid 4 °C.
OBS: Den optimala koncentrationen av primära antikroppar bör testas innan databladen används som orientering. Andra antigener av intresse kan också färgas i detta steg, så länge värdarterna för det primära antigenet skiljer sig från de andra. En högre koncentration av Triton X-100 kan bidra till att få effektivare antikroppsfärgning som visats före10, men koncentrationen kan bestämmas individuellt. - Efter 7 dagar, ta bort lösningen innehållande primära antikroppar med pipettoch tvätta hjärtat med 1% Triton X-100-lösning 3 gånger (varje gång i 1 h vid rumstemperatur på orbitalskakaren).
- Efter tvättning, inkubera hjärtat = med Alexa Fluor 488 get anti-rat IgG (spädning av 1:200) och Alexa Fluor 647 get anti-rabbit IgG (spädning av 1:200) i 7 dagar vid 4 °C.
- Efter 7 dagar, ta bort all lösning som innehåller sekundära antikroppar med en pipett. Tvätta sedan hjärtat med tvättlösning (tabell 1) 3 gånger (varje gång i 1 h vid rumstemperatur på orbitalskakaren).
- För att färga kärnor, inkubera hjärtat i DAPI-lösning (10 μg/ml) över natten vid 4 °C.
- Nästa dag, tvätta hjärtat med tvättlösning 3 gånger (varje gång i 1 h vid rumstemperatur på orbitalskakaren).
OBS: För blockering, permeabilisering, antikroppsinkubation och DAPI-färgning i steg 3.1, 3.2, 3.4 och 3.6, lämna proverna vid stabilt tillstånd i 4 °C, ingen omrörning krävs. Den färgade vävnaden kunde bevaras helt täckt med tvättlösning vid 4 °C och skyddas från ljus i några dagar fram till avbildning vid konfokalmikroskopet.
4. Konfokalmikroskopi
- Förbered plexiglasringar och fyll med plasticine (figur 1). I mitten av plasticinen bildas ett litet spår i mitten för att ladda hjärtat. Gör ett grunt spår, eftersom det skulle vara lättare att få ett plant bildplan och att justera utrymmet och undvika luftbubblor mellan provet och täckglasen i steg 4.4.
- Använd samma hjärtprov för avbildning av både SAN och AVN sekventiellt. För SAN-avbildning, ladda hjärtat direkt medan för AVN-avbildning, utför mikrodissektion innan.
- SAN-avbildning
- Identifiera SAN med anatomiska landmärken: den ligger på den dorsala sidan av hjärtat inom interkavalregionen (regionen mellan överlägsen och underlägsen vena cava). crista terminalis (CT) är muskelsträckan mellan SAN och RAA.
- Placera hjärtat i plasticinspåret med baksidan av hjärtat uppåt. Lägg PBS på hjärtat för att förskjuta all luft i håligheten tills hjärtat är helt täckt med PBS (vanligtvis är några droppar PBS tillräckliga).
- Under dissektionsmikroskopet, tryck försiktigt RAA, LAA och återstående delar av vänster kammare in i plasticinen för att fixera hjärtat. Se till att hela interkavalregionen och crista terminalis kunde ses tydligt (inte täckt av plasticine). Området som ska avbildas visas i figur 3A.
- AVN-avbildning
- Efter avslutad avbildning av SAN, samla in samma prov och använd därefter för AVN-avbildning. För AVN-mikrodissektion, placera hjärtat = på en dissektionsskål under dissektionsmikroskopet.
- Orientera hjärtat med höger sida uppåt (inklusive de återstående delarna av höger kammare). Sätt stiften genom den återstående delen av LV-fri vägg (som nu är längst ner) för att immobilisera vävnaden (figur 2B).
- Skär den återstående RV-fria väggen uppåt genom tricuspidventilen och överlägsen vena cava. Vänd sedan RV och RA bort för att exponera interventrikulär och interatriell septum. (Figur 3B)
OBS: Var uppmärksam på att inte skada koronar sinus (CS), eftersom det är ett viktigt anatomiskt landmärke för att hitta triangeln Koch som sedan gör det möjligt att lokalisera AVN. CS löper tvärs i det vänstra atrioventrikulära spåret på hjärtans bakre sida, och CS-öppningens öppning är belägen mellan IVC och tricuspidventilen vid den nedre delen av interatriell septum (figur 3A och B). - Identifiera triangeln av Koch som finns på endokardiell yta av det högra atriumet, gränsat framåt av gångjärnslinjen i septalbroschyren i tricuspidventilen (TV) och bakre av Todaros sena. Basen bildas av öppningen av koronar sinus (figur 3B). Eftersom detta är målregionen för AVN-avbildning måste den vara tydligt synlig.
- Överför hjärtat till plasticinspåret i plexiglasringen med Kochs triangel tydligt exponerad (dvs. inte täckt av plasticin). Tryck försiktigt vävnaden runt Koch-triangeln in i plasticinen för att fixera provet. Lägg PBS på hjärtat för att förskjuta all luft i håligheten tills hjärtat är helt täckt med PBS (vanligtvis är några droppar PBS tillräckliga).
- SAN-avbildning
- Applicera silikon på kanterna på plexiglasringarna så att hjärtan som laddas i de plasticinfyllda plexiglasringarna kan täckas med täckglas.
- Tryck försiktigt på baksidan av plasticinen för att pressa ut delar av PBS och fästa hjärtat på täckglaset samtidigt som du undviker luftbubblor i bildområdet.
OBS: Se till att de intressanta områdena inte viks och täcks när du trycker på baksidan av plasticinen. Ett plant bildplan utan provöverkomprimering är nödvändigt för att bevara anatomin och för korrekt konfokal avbildning av proverna. För SAN är det viktigt att se till att den interkavala regionen är tydligt exponerad. För AVN bör Kochs triangel vara helt exponerad. - Sätt de helmonterade färgproverna upp och ner på plattformen i konfokalmikroskopet. Det exponerade SAN / AVN som är fäst vid täckglaset finns nu på botten av mikroskopplattformen (figur 4).
OBS: För att ta bilder använder vi Carl Zeiss LSM800 med Airyscan Unit och programvaran ZEN 2.3 SP1 svart. - Välj platta "BP420-480 + LP605" för excitation av Alexa Fluor 647 konjugerad anti-HCN4. Variera masterförstärkningen från 650-750.
- Ta en översiktsbild av hela SAN- och AVN-regionen med hjälp av funktionen Tile Scan . Välj sedan den HCN4-positiva regionen genom att klicka och lägga till en fyrkant på översiktsbilden runt det intressanta området som ska skannas.
- Kontrollera parametrarna, inklusive plattor och masterförstärkning för de återstående kanalerna (Alexa Fluor 488 och DAPI) i konfokalmikroskopet och ställ in enligt beskrivningen i steg 4.6.
- Justera långsamt fokus uppifrån och ned i provet för att förhandsgranska hela provet och ange första och sista för Z-stackområdet. Ställ in ett optimalt intervall för Z-stacken baserat på tjockleken på det optiska provet. Vi använder ett 20x mål och 0,8-1 μm som intervall för Z-stack.
- När alla parametrar är korrekt inställda, skanna hela området för SAN och AVN.
- Utföra 3D-rekonstruktion av bilderna med hjälp av programvara (t.ex. Imaris version 8.4.2).
- Välj bildbehandling | Baslinjesubtraktion för att ta bort bakgrundsfärgning.
- Välj ytskapande på inställningen för vald kanal och region av intresse för bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda protokollet som beskrivs ovan kan konfokalmikroskopiavbildning av både SAN och AVN utföras på ett tillförlitligt sätt. Specifik färgning av retledningssystemet med användning av fluorescerande antikroppar riktade mot HCN4 och färgning av arbetsmyokardiet med fluorescerande antikroppar riktade mot Cx43 möjliggör tydlig identifiering av SAN (figur 5, video 1) och AVN (figur 6, video 2) inom den intakta anatomin.
Figur 1: Instrument för dissektion och plexiglasringhållare. A. Plexiglasring fylld med plasticine (röd pil visar spåret som bildas i mitten för att ladda hjärtat). B. Dissektion Petriskål med agarosgel. C. Fjäder sax. D. Iris sax. E. Böjda pincett. F. Fina pincett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustration av den grova hjärtanatomin. A. Schematisk illustration av SAN-mikrodissektionen. Stift appliceras genom toppen och vänster förmaksbihang (LAA). SAN indikeras med röd streckad cirkel. B. Schematisk illustration av AVN-mikrodissektionen. Stiften sätts genom den återstående delen av LV-fri vägg (som nu är längst ner). AVN indikeras med en röd streckad cirkel. SVC, Överlägsen vena cava; IVC, sämre vena cava; CS, koronar sinus; LAA, vänster förmaksbihang; RAA, höger förmaksbihang; PA, lungartär; PV, lungven; LV, vänster kammare; IVS, interventrikulär septum; IAS, interatriell septum; AV, oval fossa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Placering av SAN och AVN i ett vuxet mushjärta. A. Placering av den sinoatriella noden (SAN) i ett vuxet mushjärta. Utsikt från baksidan av hjärtat. SAN-nätverkets placering indikeras med röd streckad linje inom den mellanliggande regionen (svarta streckade linjer). SVC, Överlägsen vena cava; IVC, sämre vena cava; CS, koronar sinus; LAA, vänster förmaksbihang; RAA, höger förmaksbihang; PV, lungven; CT, Crista terminalis; LV, vänster kammare; RV, höger kammare. B. Placering av den atrioventrikulära noden (AVN) i ett vuxet mushjärta. Vy från höger. AVN (röd streckad cirkel) ligger vid toppen av triangeln Koch (vit streckad triangel) nära botten av det membranösa septumet. Kochs triangel bildas av Todaros sena (TT, grön streckad linje), tricuspidventil (TV, blå streckad linje) och öppningen i koronar sinus (CS, gul streckad linje). SVC, överlägsen vena cava; IVC, sämre vena cava; IVS, interventrikulär septum; AV, oval fossa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Preparerat prov laddat på konfokalmikroskopi. A. Det förberedda provet (röd pil) för konfokalmikroskopi monterat i plexiglasringen med plasticine (svart pil). Vy från botten. B. Plexiglasring med monterat prov laddat upp och ner på konfokalmikroskopets plattform (inversmikroskop). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. Rekonstruktion av konfokalmikroskopiavbildning av SAN i en C57BL6/J mus färgad med anti-HCN4 (röd) och Cx43 (vit) antikroppar. A. Det streckade området avgränsar SAN, som är orienterat längs interkavalregionen mellan överlägsen och underlägsen vena cava. B. Förstoring av inlägget från panel A. C. 3D-rekonstruktion av panel B. RAA, höger förmaksbihang; RA, höger atrium; SAN, sinoatriell nod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6. Rekonstruktion av konfokalmikroskopiavbildning av AVN i en C57BL6/J mus färgad med anti-HCN4 (röd) och Cx43 (vit) antikroppar. A. Streckat område anger AVN. B. Förstoring av inlägget från panel A. C. 3D-rekonstruktion av panel B. IVS, interventrikulär septum; IAS, interatriell septum; AVN, atrioventrikulär nod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7. Negativ kontrollbild. A. negativ kontroll helmonterad färgning för SAN. Den streckade cirkeln visade SAN-regionen bekräftad av anatomins landmärken. B. negativ kontrollfärgning för SAN endast med andra antikroppar. C. DAPI-färgning för SAN. D . Färgning med helmonterad kontroll för AVN. Den streckade cirkeln visade AVN-regionen bekräftad av anatomins landmärken. E . negativ kontrollfärgning för AVN endast med andra antikroppar. F. DAPI-färgning för AVN. RAA, höger förmaksbihang; RA, höger atrium; SVC, överlägsen vena cava; IVS, interventrikulär septum; IAS, interatriell septum; Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: 3D-rekonstruktion av SAN Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: 3D-rekonstruktion av AVN Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Förening | Slutlig koncentration | g eller ml/100 ml krävs | |
| Fixeringslösning | |||
| Formaldehyd (16%) | 4% | 25 ml | |
| PBS (1x) | 75 ml | ||
| 1% Triton lösning | |||
| Triton X100 | 1% | 1 ml | |
| PBS | 99 ml | ||
| Blockering lösning | |||
| Triton X-100 | 1% | 1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 gr | |
| Normalt getserum | 20% | 20 ml | |
| PBS (1x) | 89 ml | ||
| Tvättlösning | |||
| Interpolering 20 | 0.10% | 0,1 ml | |
| BSA | 0.50% | 0,5 gr | |
| PBS (1x) | 99,9 ml | ||
| TAE (50x) | |||
| Tris-bas | 24.20% | 24.2 gr | |
| 100% ättiksyra | 5.71% | 5,71 ml | |
| 0,5 meter EDTA | 0,05 meter | 10 ml | |
| dH2O | Lägg till upp till 100 ml | ||
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjärtats anatomi har traditionellt studerats med hjälp av tunna histologiska avsnitt11. Dessa metoder bevarar emellertid inte ledningssystemets tredimensionella struktur och ger därför endast 2D-information. Det helmonterade immunofluorescensfärgningsprotokollet som beskrivs här gör det möjligt att övervinna dessa begränsningar och kan rutinmässigt användas för SAN- och AVN-avbildning.
I jämförelse med standardmetoder som konventionell immunhistokemi som kräver paraffinininbäddning, sektionering och antigenhämtning, är helmonteringsmetoden fördelaktig för att ta itu med den exakta 3D-lokaliseringen och morfologin för SAN och AVN, och för att undersöka förhållandet med den omgivande vävnaden eftersom vävnadsmorfologin är avsevärt bevarad med endast minimal vävnadsuttorkning och fysisk bristning. Dessutom upprätthålls immunoreaktiviteten (dvs bindningen av antikroppar till vävnadsantigener) i hög grad.
Vi etablerade en praktisk provprocessionsmetod för konfokalmikroskopi genom att använda en plastringmonterad hållare fylld med plasticine12,13. Plasticine är idealisk eftersom den kan anpassas individuellt till vävnadens storlek, det är tillräckligt svårt att på ett tillförlitligt sätt hålla vävnaden utan alltför stort tryck i vävnaden. Viktigast är att det inte är fluorescerande, undviker autofluorescerande bakgrund och därför inte stör den fluorescerande signalen från de använda antikropparna.
Vi använde det konfokala laserskanningsmikroskopet (LSM-Zeiss) med Airyscan-detektorn, vilket kan erbjuda en tydlig fördel för att få bilder med hög kvalitet. Att använda ett widefield-bildmikroskop kan bara erbjuda information på vävnadsnivå men saknar cellulär upplösning. Dessutom medför widefieldmikroskopet en risk med hög bakgrund14. Genom att använda en Airyscan-detektor för konfokal LSM kan förbättrad upplösning och signal-brusförhållande (SNR) erhållas, jämfört med det traditionella konfokala bildsystemet15 för nålhål och detektor.
Formerna och positionen för SAN och AVN presenteras som 3D-rekonstruktion och ytterligare virtuella sektionsplan härledda från 3D-rekonstruktion kan förbättra tolkningen av histologiska sektioner, medan konventionell histologi endast tillåter en 2D-bedömning av anatomin med den inneboende risken för icke-upptäckt av små men relevanta strukturer. Dessutom ger 3D-rekonstruktion möjlighet att undersöka anatomiska strukturer av intresse transmuralt och inom den intakta mikromiljön, till exempel inneboende autonom nervplex som innerverar hjärtat16. Helmontering in situ-färgning och 3D-rekonstruktion möjliggör undersökning av den cellulära miljön såväl som de specifika celltyperna och deras orientering. Vidare kan regionalt och celltypsspecifikt proteinuttryck visualiseras och kan ytterligare stödja western blot- och proteomikanalyser17.
SAN och AVN är specialiserade strukturer i hjärtat med ett annat uttrycksmönster av jonkanaler och connexiner som kan användas för tillförlitlig identifiering10,18. Hyperpolarisationsaktiverade cykliska nukleotidstyrda katjonkanaler (HCN) etablerar den diastoliska depolariseringen i pacemakerceller och uttrycks därför specifikt inom ledningssystemet med HCN4 som den dominerande isoformen i mus19. Studier har visat att HCN4 är en av de detekterbara och stabilt uttryckta HCN-isoformerna i hela SAN och AVN11,20. Connexiner ansluter direkt angränsande celler och tillåter passage av joner från cell till cell; De är därför väsentliga för ledningen av den elektriska impulsen genom hjärtat21. Connexin uttrycksmönster varierar mellan olika regioner i hjärtat med Cx43 är den vanligaste isoformen som har hittats i nästan alla delar av hjärtat utom SAN och AVN22. Genom att kombinera mikrodissektion för att möjliggöra exponering av specifika regioner av intresse med anti-HCN4- och anti-CX43-antikroppar samt in silico-metoder för tredimensionell rekonstruktion av konfokala bilder möjliggör tillförlitlig identifiering av SAN och AVN och till omfattande undersökning av SAN / AVN-morfologin samt deras interaktion med den omgivande vävnaden.
SAN och AVN kan vara lätta att skilja efter färgning med en specifik antikropp. För att lokalisera SAN och AVN genom deras anatomiska landmärken behövs dock viss övning innan rätt mikrodissektion kan utföras.
Med hjälp av ovanstående protokoll kan ett antal andra antigener också appliceras. Protokollet fungerar också bra på både perfusionsfixerad och nedsänkningsfixerad vävnad. Inkubationstiden kan dock justeras för optimal fixering eftersom vissa antikroppar visar minskad immunreaktivitet när antigenet är överfixerat. Eftersom den helmonterade färgningsmetoden behöver 7 dagar för primär och sekundär antikroppsinkubation är det viktigt att helt nedsänka proverna i tillräckliga volymer antikroppsinnehållande lösningar. Utspädningsfaktorn för varje antikropp bör testas före experimentet. För optimal färgning bör all irrelevant vävnad avlägsnas. För protokollet bevarade vi bara små delar av ventriklarna för bättre orientering och tar bort all omgivande fettvävnad och lungvener, eftersom omgivande (irrelevant) vävnad också kan binda antikroppar, särskilt när målantigenerna uttrycks globalt.
Helmonterad in situ-färgning, konfokal avbildning och 3D-rekonstruktion är en ovärderlig och kraftfull teknik för forskare från olika områden. Metoden har dock också vissa begränsningar. (i) Det kräver specialutrustning såsom ett konfokalmikroskop som inte är allmänt tillgängligt vid alla institutioner. (ii) Som nämnts ovan kräver mikrodissektion av specialiserade anatomiska strukturer såsom SAN eller AVN men även konfokal avbildning och efterbildbehandling intensiv praktiserande och erfaren personal. (iii) Metodens framgång beror i hög grad på kvaliteten på de antikroppar som används och kan därför vara mycket utmanande i vissa fall. Även (iv) 3D-rekonstruktion kan vara svårt att uppnå och kan kräva intensiv felsökning för att optimera proceduren. Till exempel måste optimala intervall ställas in under bildinsamlingen eftersom sektioner som är placerade för långt ifrån varandra kommer att lämna luckor och kanske inte tillåter en adekvat 3D-rekonstruktion av anatomin. Sektioner som är för nära kan orsaka översampling och blekning på grund av överdriven belysning och tar lång tid att slutföra en bild. Slutligen (v) är den största begränsningen för konfokalmikroskopi bilddjupet, vilket innebär att om provets tjocklek ligger utanför det maximala arbetsdjupet för konfokalmikroskopet kan den ytterligare fluoroforen inte detekteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av China Scholarship Council (CSC, till R. Xia), German Centre for Cardiovascular Research (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss, 81Z0600206 till S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 till H. Ishikawa-Ankerhold och S. Massberg och projekt A10 till C. Schulz), ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss) och Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptberedningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al.
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L.
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
- Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
Tags
Medicin utgåva 166 Sinoatriell nod Atrioventrikulär nod Kardiologi elektrofysiologi Hjärtledningssystem Mikrodissektion Immunofluorescens KonfokalmikroskopiErratum
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 02/21/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
