Summary
نحن نصف طرق لجمع حبوب اللقاح القشرية من نحل العسل وكذلك بروتوكولات فرز الألوان ، وتحلل الأسيتوليز ، وإعداد شرائح المجهر لحبوب اللقاح لتحديد التصنيف. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم لون الكريات والتنوع التصنيفي لحبوب اللقاح القشرية التي تم جمعها من خمسة أنظمة زراعة باستخدام مصائد حبوب اللقاح.
Abstract
غالبا ما يقوم الباحثون بجمع وتحليل حبوب اللقاح القشرية من نحل العسل لتحديد المصادر النباتية التي يتغذون عليها لحبوب اللقاح أو لتقدير تعرض النحل للمبيدات الحشرية عن طريق حبوب اللقاح. الموصوفة هنا هي طريقة فعالة لحبس حبوب اللقاح لجمع حبوب اللقاح القشرية من نحل العسل العائد إلى خلايا النحل. ينتج عن طريقة الجمع هذه كميات كبيرة من حبوب اللقاح القشرية التي يمكن استخدامها لأغراض البحث. يجمع نحل العسل حبوب اللقاح من العديد من الأنواع النباتية ، ولكنه عادة ما يزور نوعا واحدا خلال كل رحلة جمع. لذلك ، تمثل كل حبيبة حبوب اللقاح القشرية في الغالب نوعا نباتيا واحدا ، ويمكن وصف كل حبيبة حبوب اللقاح باللون. وهذا يسمح بفرز عينات من حبوب اللقاح القشرية حسب اللون لفصل المصادر النباتية. يمكن للباحثين تصنيف حبوب اللقاح القشرية بشكل أكبر من خلال تحليل مورفولوجيا حبوب اللقاح المحشوة بالأسيتوليز لتحديد التصنيف. تستخدم هذه الطرق عادة في الدراسات المتعلقة بالملقحات مثل كفاءة التلقيح ، وديناميكيات البحث عن الملقحات ، وجودة النظام الغذائي ، والتنوع. يتم تقديم منهجيات مفصلة لجمع حبوب اللقاح القشرية باستخدام مصائد حبوب اللقاح ، وفرز حبوب اللقاح حسب اللون ، وإزالة حبوب اللقاح من الأسيتول. كما تم عرض النتائج المتعلقة بتواتر ألوان الكريات وأصناف حبوب اللقاح القشرية التي تم جمعها من نحل العسل في خمسة أنظمة زراعة مختلفة.
Introduction
نحل العسل الغربي (Apis mellifera L.) هو ملقح مهم للعديد من المحاصيل الزراعية التي تعتمد على تلقيح النحل1. لأكثر من عقد من الزمان ، تم الإبلاغ عن خسائر كبيرة في مستعمرة نحل العسل2،3،4،5،6،7،8،9. وقد تورطت عدة عوامل - بما في ذلك الطفيليات والأمراض وسوء التغذية والمبيدات الحشرية - في هذه المستعمرات تنخفض10. يمكن أن يعزى سوء التغذية إلى التكثيف الزراعي وفقدان موائل البحث عن الطعام11. من الضروري فهم موارد الأزهار التي يستخدمها النحل في المناظر الطبيعية المختلفة لتحسين تغذية النحل والمساعدة في جهود الحفاظ على النحل. حبوب اللقاح هي المصدر الرئيسي للبروتين والدهون والفيتامينات والمعادن للنحل وقد استخدمت في العديد من الدراسات الزراعية والبيئية لفهم تفضيلات البحث عن الطعام على مستوى المستعمرة لنحل العسل ، وتقييم تأثير حبس حبوب اللقاح على مستعمرات نحل العسل ، وتحديد التعرض للمبيدات الحشرية للنحل 12،13،14.
يجمع نحل العسل حبوب اللقاح من الزهور ، ويحزم حبوب اللقاح في كريات على كوربيكولا - سلة حبوب اللقاح الظنبوبية على ساقه الخلفية - ويعود إلى المستعمرة للتخزين. يمكن إزالة حبوب اللقاح القشرية من العلف عن طريق التقاطها عند مدخل الخلية أو على الزهور ، وتبريدها لفترة وجيزة لشل حركتها ، ثم إزالة كريات حبوب اللقاح من أرجلها الخلفية باستخدام الملقط. إن العملية الشاقة لجمع حبوب اللقاح القشرية يدويا من العلف الذي يتم التقاطه بشكل فردي بطيئة وغير فعالة إذا احتاج المرء إلى كمية كبيرة من حبوب اللقاح. هناك طريقة أبسط وأكثر كفاءة لجمع كميات كبيرة من حبوب اللقاح عن طريق محاصرة كريات حبوب اللقاح القشرية من نحل العسل عند مداخل الخلية. تم تصميم مصائد حبوب اللقاح لإزاحة حبوب اللقاح القشرية من أرجل علف حبوب اللقاح العائدة عند دخولها الخلية15. يجب على العلافين الضغط من خلال ثقوب شبكية ذات حجم يسمح بمرور جسم عامل نحل العسل بشكل ضيق.
عندما تمر نحلة العسل عبر أحد هذه الثقوب ، يتم كشط كريات حبوب اللقاح الأكبر حجما من ساقيها وتسقط في صينية جمع16. وقد أظهرت الدراسات أن حبس حبوب اللقاح يحفز العلف على جمع المزيد من حبوب اللقاح ، وبالتالي زيادة كفاءة التلقيح للمحاصيل المحيطة والنباتات 17،18،19،20. يمكن أيضا استخدام منهجيات جمع حبوب اللقاح لفهم الأعلاف التي يستخدمها نحل العسل في المناظر الطبيعية كخطوة أولى لتحديد كمية ونوعية وأصناف أنواع النباتات المزهرة. وبالتالي فإن المنهجيات الفعالة لحبس حبوب اللقاح تسهل كل من التلقيح وأبحاث تغذية نحل العسل. ويوضح الجدول 1 مقارنة بين طرق جمع حبوب اللقاح هذه. سيتغير سلوك البحث عن حبوب اللقاح بناء على حاجة المستعمرة إلى حبوب اللقاح المخزنة بالنسبة لمستويات البيض واليرقات21,22. وبما أن هذه التغييرات تشمل كثافة جمع متفاوتة، فمن المتوقع في كثير من الأحيان حدوث تباين كبير في كمية حبوب اللقاح بين المستعمرات في نفس الموقع وبين مواقع مختلفة من نفس نظام المحاصيل أو نوع المناظر الطبيعية23،24. وستساعد زيادة عدد المستعمرات والمواقع لحبس حبوب اللقاح على استيعاب هذا الاختلاف.
تختلف مصائد حبوب اللقاح في الكفاءة25,26. يختلف حجم كريات حبوب اللقاح التي يجمعها نحل العسل بين الأنواع النباتية ويمكن أن يتغير بناء على مستويات مخازن حبوب اللقاح في المستعمرة27,28. وهذا يطرح إمكانية تمثيل كريات حبوب اللقاح الأصغر تمثيلا ناقصا وتمثيل الكريات الأكبر حجما تمثيلا زائدا في العينات التي يتم جمعها عبر مصائد حبوب اللقاح. يختلف النحل البالغ في حجم الجسم ، مما قد يؤثر أيضا على تمثيل حبوب اللقاح التي يتم جمعها في الفخاخ. هناك أيضا أنواع نباتية تنتج في الغالب رحيقا لن يتم اكتشافه إذا تم تقييم حبوب اللقاح التي تم جمعها فقط في بعض المناظر الطبيعية. تتأثر كفاءة الاصطياد أيضا بانجراف العلف والارتباك ، والذي يتأثر بنوع مصيدة حبوب اللقاح وحالة معدات الخلية. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشكلة باستخدام التقنيات المحددة في هذه الورقة. قد ينظر الباحثون في تقنيات بحثية إضافية ، مثل عد زيارات الزهور من قبل العلف ، لتكملة نتائج تفضيلات البحث عن الطعام على مستوى المستعمرة. طريقة مفيدة لتقييم تنوع حبوب اللقاح هي فرز حبوب اللقاح القشرية حسب اللون. على الرغم من أن نحل العسل هو علف عام ، إلا أنه يظهر أيضا إخلاصا للزهور ، حيث يجمع حبوب اللقاح من نفس الأنواع النباتية في نفس الموقع خلال أي رحلة جمع معينة. بناء على سلوك البحث عن الطعام هذا ، من المفترض أن أي حبيبة حبوب اللقاح القشرية معينة يتم تمثيلها في الغالب بنوع نباتي واحد 27،29،30،31. وبالتالي ، يمكن للعلماء وصف تنوع حبوب اللقاح عن طريق فرز حبوب اللقاح القشرية حسب لون الكريات والإبلاغ عن العدد الإجمالي للألوان المكتشفة أو نسبة الإجمالي التي تمثلها كل مجموعة ألوان12،32،33،34. يمكن تحقيق ذلك عن طريق قياس الكتلة أو عدد الكريات لكل مجموعة لونية. يقترح قياس عدد الكريات لكل مجموعة ألوان إذا كانت هناك اختلافات منهجية معروفة أو مشتبه بها في وزن الكريات من أنواع مختلفة. يمكن أن تحدث الاختلافات المنهجية بسبب حجم الكريات أو كمية الرحيق التي يضيفها العلافون إلى حبوب اللقاح عند تكوين الكريات.
فرز الألوان هو عملية فعالة من حيث الوقت وبسيطة ، ولكن قد لا يكون لها دقة مقبولة لبعض الدراسات البحثية للتلقيح لأن أنواع النباتات المختلفة قد يكون لها ألوان حبيبات حبوب اللقاح مماثلة35,36. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حد لوجستي لعدد مجموعات الألوان المميزة التي يمكن فصل كريات حبوب اللقاح إليها. وبالتالي ، فإن فصل كل نوع من حبوب اللقاح النباتية الفردية إلى مجموعة ألوان الكريات المميزة الخاصة به قد لا يكون ممكنا دائما في دراسات التلقيح. غالبا ما يكمل التوصيف المورفولوجي لحبوب اللقاح عبر الفحص المجهري الضوئي فصل لون الكريات عن طريق التمييز بين حبوب اللقاح من صنفين أو أكثر في كريات من نفس المجموعة اللونية. على الرغم من أنه من الشائع العثور على حبوب اللقاح من أصناف متعددة في مجموعة معينة من حبيبات حبوب اللقاح ، إلا أن كريات حبوب اللقاح الفردية التي تجمعها نحلة العسل تشكل عموما صنفا سائدا واحدا ، ربما مع أصناف أخرى بكميات طفيفة. وبالتالي ، من الشائع افتراض الإخلاص التصنيفي في كريات حبوب اللقاح القشرية لنحل العسل. غالبا ما تحتوي كريات حبوب اللقاح من الملقحات الأخرى التي لا تظهر سلوكا صادقا للزهور ، مثل النحل الطنان ، على العديد من الأنواع النباتية وقد لا تمتلك تصنيفا سائدا. في الحالات التي تكون فيها التقديرات الكمية لنسب الأصناف في كريات حبوب اللقاح متعددة الأزهار مطلوبة ، فإن الطرق المجهرية التي تشمل انحلال الأسيتولاز ، مطلوبة بالإضافة إلى ذلك للتحليل المناسب.
تقييم الخصائص المورفولوجية لحبوب اللقاح الأسيتوليزية هي الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد التصنيف16. يزيل إجراء انحلال الأسيات بروتوبلازم حبوب اللقاح للكشف عن الخصائص التشخيصية التي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الضوئي37,38. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين الإبلاغ عن أنواع مختلفة ، وتواتر الأصناف الموجودة في أنظمة زراعة محددة ، والأصناف السائدة من ألوان الكريات33,36. انحلال الأسيتوليز هو أفضل تقنية تحليلية للكشف عن مورفولوجيا حبوب اللقاح28. ومع ذلك ، لا يمكن تحديد بعض حبوب اللقاح المحلل بالأسيتوليز ، مثل العديد من أنواع Rosaceae ، على مستوى الجنس أو الأنواع من خلال تحلل الأسيتوليز والفحص المجهري الضوئي وحدهما. يعتبر الباحثون المسح المجهري الإلكتروني أو الترميز الفوقي طرقا بديلة لتحقيق تحديد الجنس أو النوع. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق البديلة توفر فقط تحديد نوعي للتصنيف وتفشل في تقدير نسب أصناف حبوب اللقاح المختلفة في كريات حبوب اللقاح متعددة الأزهار36,39. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النفقات والخبرات اللازمة أعلى بكثير لهذه الأساليب. ويوضح الجدول 1 مقارنة بين طرق تحديد الهوية هذه.
| أساليب | الوقت | حساب | دقة | الخبره |
| مجموعة حبوب اللقاح | ||||
| اصطياد حبوب اللقاح | منخفض | المعتدل | متغير | المعتدل |
| جمع حبوب اللقاح العلف | عال | المعتدل | عال | منخفض |
| تحديد حبوب اللقاح | ||||
| مرئي (فرز الألوان فقط) | المعتدل | منخفض | منخفض | منخفض |
| انحلال الأسيتوليس | المعتدل | المعتدل | المعتدل | المعتدل |
| المجهر الإلكتروني الماسح | عال | عال | عال | عال |
| الترميز الشريطي الفوقي | متغير | عال | عال | عال |
الجدول 1: مقارنة الطرق المختلفة لجمع حبوب اللقاح وتحديدها بناء على الوقت والنفقات والدقة والخبرة. تقوم الطرق المرئية (فرز الألوان فقط) بالإبلاغ عن إجمالي عدد الألوان المكتشفة أو نسبة الإجمالي الذي تمثله كل مجموعة ألوان كمقياس لتحديد مصادر حبوب اللقاح، ولكنها لا توفر تعريفا للتصنيف.
المعلومات المتاحة عن محاصرة وفرز حبوب اللقاح وأستولزينغ حبوب اللقاح متنوعة وغالبا ما تنتشر عبر مصادر متعددة ، وتختلف للباحثين في مجالات مختلفة. تقدم هذه الورقة رؤى مفصلة حول أنواع مختلفة من مصائد حبوب اللقاح التي يمكن استخدامها من قبل كل من الباحثين ومربي النحل لجمع كميات كبيرة من حبوب اللقاح القشرية بشكل فعال. كما يتم توفير بروتوكولات لإعداد عينات حبوب اللقاح - عن طريق انحلال الأسيتوليس، والتلطيخ، وتركيب الشرائح - لتحديد أصناف النباتات. المنهجيات المفصلة هنا شاملة وتعمل كمورد فريد لتحديد الأنواع النباتية السائدة التي يتغذى عليها نحل العسل في مشهد معين ، لا سيما في أنظمة المحاصيل. تم تقديم النتائج المستندة إلى هذه الطرق من دراسة سابقة وتوثيق تنوع ألوان حبيبات حبوب اللقاح وأصناف النباتات من حبوب اللقاح القشرية التي جمعها نحل العسل في خمسة أنظمة زراعة14.
Protocol
1. جمع حبوب اللقاح القشرية من مستعمرات نحل العسل باستخدام مصائد حبوب اللقاح
- حدد متى يتم احتجاز حبوب اللقاح من موقع المنحل المطلوب.
ملاحظة: تشمل الظروف المناخية المثالية التعرض الكامل لأشعة الشمس ، وسرعات الرياح المنخفضة ، والرطوبة المنخفضة ، وعدم توقع هطول الأمطار خلال الفترة المطلوبة لجمع حبوب اللقاح. - حدد مستعمرات نحل العسل المثلى لمحاصرة حبوب اللقاح داخل موقع المنحل.
- تقييم قوة المستعمرة عن طريق حساب العلف العائد إلى مدخل المستعمرة لمدة 2 دقيقة. حدد المستعمرات التي تحتوي على أكبر عدد إجمالي من العلف العائد.
- حدد خلايا النحل ذات الأواني الخشبية التي هي في حالة جيدة ، ويفضل أن يكون ذلك بدون مداخل إضافية وأغطية مشوهة. استخدم المستعمرات ذات المداخل البديلة الأقل لأنها زادت من احتمال إعادة العلف إلى مدخل الفخ.
- حدد مداخل الخلايا المواجهة للجنوب كلما أمكن ذلك. إذا تم وضع خلايا النحل على منصات نقالة ، فقم بتثبيت مصائد حبوب اللقاح على كل مستعمرة تواجه نفس الاتجاه على منصة نقالة معينة لتجنب انجراف العلف إلى مداخل الخلية المجاورة.
- إذا رغبت في ذلك ، قم بتقييم عش الحضنة للمستعمرة عن طريق فحص الإطارات بحثا عن وجود اليرقات. حدد المستعمرات التي تحتوي على كميات كبيرة نسبيا من اليرقات.
- تثبيت مصائد حبوب اللقاح على مستعمرات نحل العسل المختارة.
ملاحظة: سيختلف التثبيت بناء على نوع مصيدة حبوب اللقاح. تشمل الأنواع أ) الحامل الأمامي ، ب) الحامل السفلي ، ج) الحامل العلوي ، أو د) حامل مدخل ثقب المثقاب. راجع قسم المناقشة للحصول على التفاصيل.- بالنسبة إلى مصائد التثبيت الأمامي، قم بتوصيل المصيدة أمام المدخل بالدبابيس والبراغي والشريط، أو قم بتوصيل المصيدة بأسلاك البنجي الملفوفة حول الخلية. بالنسبة للفخاخ المثبتة في الأسفل، ضع المصيدة أسفل صندوق الخلية الأدنى، وقم بإصلاح مدخل المصيدة بالقرب من المدخل الأصلي. بالنسبة لمصائد تركيب ثقب المثقاب، قم بتوصيل المصيدة مباشرة أمام فتحة المثقاب في صندوق الخلية باستخدام الدبابيس والبراغي والشريط. بالنسبة للفخاخ العلوية ، ضع المصيدة فوق صندوق الخلية العلوي وأسفل الغطاء.
- أغلق جميع المداخل المحتملة الأخرى إلى المستعمرة باستخدام مواد غير لاصقة وقابلة للتشكيل ، مثل رغوة اللاتكس أو البولي يوريثان ، أو قطعة قماش الأجهزة رقم 8 (فتحة 2.7 مم) لثقوب المثقاب. استخدم الشريط اللاصق للشقوق الصغيرة.
- في حالة استخدام مصائد أمامية، ضع حاجزا، مثل حصيرة مطاطية، بين سلة التجميع والعشب لتجنب تلف الرطوبة من الندى.
- قم بتشغيل آلية الاصطياد الخاصة بمصيدة حبوب اللقاح بعد 24 ساعة من التثبيت وقبل بدء رحلة البحث عن الطعام في اليوم (في وقت متأخر من المساء / الصباح الباكر).
ملاحظة: هذه الخطوة مثالية، ولكنها ليست ضرورية. قم بإشراك مصائد حبوب اللقاح كل أسبوعين إذا تم احتجاز حبوب اللقاح في نفس المستعمرات طوال فترة معينة. - اجمع حبوب اللقاح القشرية من صينية التجميع ، وضعها في أكياس بلاستيكية أو أنابيب طرد مركزي ، وتخزينها في مبرد مع الثلج.
- لتقييم تنوع ووفرة أنواع حبوب اللقاح ، على سبيل المثال ، دراسات التغذية على مستوى المناظر الطبيعية ، قم بجمع حبوب اللقاح في فترتين أو ثلاث فترات 72 ساعة40.
- لتحليل بقايا المبيدات الحشرية ، اجمع حبوب اللقاح في فترات تتراوح من 24 ساعة إلى 96 ساعة بحد أدنى 3 جم لمعالجة41.
- تنظيف حبوب اللقاح عن طريق إزالة أجزاء النحل وغيرها من حطام الخلية.
ملاحظة: استخدم قفازات يمكن التخلص منها عند التعامل مع عينات حبوب اللقاح ، وقم بتغيير القفازات التي يمكن التخلص منها بين العينات. استخدم أدوات منفصلة لإزالة الحطام من حبوب اللقاح التي تم جمعها في كل فخ. اشطف وجفف قبل استخدام الأدوات للحصول على دفعة أخرى من حبوب اللقاح المحاصرة. - تخزين حبوب اللقاح عند -20 درجة مئوية أو أقل للحفاظ على سلامتها التركيبية إذا كانت حبوب اللقاح مخصصة لتحديد مصدر حبوب اللقاح أو تقييم الكمية أو تحليل بقايا المبيدات41,42.
- بعد إزالة الفخاخ من خلايا النحل ، قم بتعقيم جميع المعدات في محلول تبييض بنسبة 5٪ ، وشطف وتجفيف المعدات قبل الاستخدام التالي.
2. فرز لون حبيبات حبوب اللقاح لتحديد مصدر حبوب اللقاح في المصب وتقييم الكمية
- تأكد من وجود ما لا يقل عن 20 جم من عينة حبوب اللقاح للعمل معها. امزج عينة حبوب اللقاح جيدا في حقيبتها أو حاوية أخرى ذات حجم مناسب للحصول على مزيج متجانس من جميع الكريات الموجودة فيها. لتجنب التحيز غير المقصود في الخطوة التالية، قم بإخفاء تكوين لون العينة عن الأنظار قبل إزالة عينة فرعية من كيس العينة.
- باستخدام مغرفة أو ملعقة كبيرة ، اخرج 10 جم من حبوب اللقاح كعينة فرعية تمثيلية للكل. صب الكريات ببطء من المغرفة على الميزان حتى تقرأ الشاشة 10 جم. إذا لم تكن المغرفة الأولى كبيرة بما فيه الكفاية ، فقم باسترداد مغرفة أخرى من العينة بنفس الطريقة.
ملاحظة: تستخدم متطلبات الوزن المحددة هذه (20 جم و 10 جم) كأمثلة فقط. يجب على الباحثين ضبط كمية حبوب اللقاح المستخدمة في كل خطوة حسب الاقتضاء لاحتياجات محددة. - قم بإزالة جميع أجزاء النحل والحطام الآخر من العينة الفرعية 10 جم. ثم ، إذا لزم الأمر ، أضف المزيد من حبوب اللقاح من العينة الأصلية لتحقيق وزن إجمالي قدره 10 جم من العينة الفرعية.
- فرز كل حبيبة حبوب اللقاح من العينة الفرعية 10 غرام في مجموعة لونية. استخدم كل من لون حبوب اللقاح والملمس للتمييز بين مجموعات الألوان.
ملاحظة: من المتوقع حدوث بعض التباين داخل مجموعة، ولكن استخدام دليل ألوان Pantone أثناء الفرز يمكن أن يزيد من التناسق. - لضمان 0.25 غرام على الأقل من كل مجموعة ألوان للخطوات النهائية ، ضع أي كريات غير وفيرة بما يكفي لتشكيل مجموعة ألوان لا تقل عن 0.25 جم في مجموعة متنوعة. قم بتسمية كل مجموعة ألوان فردية باستخدام دليل ألوان Pantone. تسمية المجموعة المتنوعة متفرقات.
- قم بوزن كل مجموعة ألوان على ورق وزن منفصل، و/أو عد عدد الكريات في كل مجموعة لونية. سجل أسماء مجموعات الألوان وأوزانها أو أعدادها على ورقة بيانات.
ملاحظة: يعتمد اختيار وزن أو حساب عدد الكريات في كل مجموعة ألوان على مقياس اهتمام الباحث وأهداف المشروع. - قم بإنشاء ملصق أنبوب طرد مركزي دقيق لكل مجموعة ألوان باستخدام قلم مقاوم للمذيبات وملصقات أنبوب ورقي لاصق. قم بتضمين التاريخ الحالي ومعرف العينة وتاريخ جمع العينات ورقم مجموعة الألوان في التسمية. ضع الملصقات على أنابيب الطرد المركزي الدقيقة النظيفة والجافة سعة 2 مل.
- وزن 0.25 جم (± 0.05 جم) من كريات حبوب اللقاح من كل مجموعة لونية، وضع هذه الكمية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى بشكل مناسب.
ملاحظة: إذا كان هناك اختلاف طفيف في اللون أو الملمس في حبوب اللقاح لمجموعة ألوان معينة، تأكد من وجود عينة تمثيلية من الكريات داخل كل أنبوب. أحجام الكواشف وأوقات الحضانة والطرد المركزي التالية مناسبة ل 0.25 غرام من حبوب اللقاح. لذلك ، استخدم هذه الكمية من حبوب اللقاح في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لاستخدامها في تحلل الأسيتوليز. يجب أن يوفر هذا البروتوكول حبوب لقاح وافرة وملطخة لتحديد مصدر النبات في المصب بواسطة الفحص المجهري الضوئي. إذا كنت تستخدم كمية مختلفة من حبوب اللقاح في انحلال الأسيتوليز ، فيجب تعديل تفاصيل حجم الكاشف وأوقات المعالجة وفقا لذلك. - ضع حبوب اللقاح المتبقية من كل مجموعة ألوان في أكياس بلاستيكية فردية (كيس واحد لكل لون) تحمل اسم مجموعة الألوان. قم بتخزين هذه الأكياس مع الأجزاء الأخرى من العينة الأصلية المناسبة في تخزين -20 درجة مئوية.
- امزج حبوب اللقاح جيدا في الأنبوب مع مسواك خشبي نظيف لمدة 10 إلى 15 ثانية.
3. التحضير لانحلال الأسيتال
- قبل البدء في أي جزء من انحلال الأسيتوليز لأول مرة ، اتصل بقسم الصحة والسلامة البيئية (EHS) في المؤسسة المعينة للحصول على تعليمات حول كيفية التعامل مع الكواشف والنفايات المتعلقة بانحلال الأسيتوليز.
- الحصول على محاليل مخزون من الكواشف التالية ، ووضعها في غطاء الدخان وفقا لإرشادات البيئة والصحة والسلامة للتخزين الكيميائي: 95٪ من الإيثانول ؛ ماء مقطر; حمض الخليك الجليدي ، اللامائي. حمض الكبريتيك المركز. الجليسرين; وطلاء أظافر واضح.
- إعداد محاليل المخزون من الكواشف التالية ، ووضعها في غطاء الدخان وفقا لإرشادات البيئة والصحة والسلامة للتخزين الكيميائي: بيكربونات الصوديوم المشبعة (8٪ w/v محلول في الماء المقطر) ؛ و safranin O (محلول 1٪ w / v في 50٪ من الإيثانول).
4. انحلال الأسيتوليس
- قم بإجراء ما قبل انحلال الأسيتوليز لغسل حمض الخليك الجليدي. نفذ الخطوات التالية داخل غطاء الدخان مع معطف المختبر وحماية العين وقفازات النتريل.
- قم بتشغيل كتلة حرارة إلى 80 درجة مئوية.
ملاحظة: تأكد من سهولة الوصول إلى زجاجة ضغط من بيكربونات الصوديوم المشبعة. يمكن استخدام هذا لتحييد انسكابات الحمض في غطاء الدخان إذا حدثت. - ضع علامة على كوب زجاجي واحد للنفايات الحمضية ، وواحد لنفايات الإيثانول ، وواحد لخليط انحلال الأسيتوليس.
- باستخدام حلول المخزون المعدة مسبقا ، قم بإنشاء أليكوتات عاملة من الكواشف التالية في أكواب زجاجية ذات علامات وحجم مناسب: ~ 23.0 مل من حمض الخليك الجليدي ؛ ~ 33.0 مل من الماء المقطر ؛ ~ 23.0 مل من الإيثانول 95 ٪ ؛ ~ 25.0 مل من بيكربونات الصوديوم (للنفايات الصلبة الملوثة بالحمض).
ملاحظة: هذه هي الأحجام المطلوبة لإكمال إجراءات انحلال الأسيتوليز التالية على ما مجموعه 10 عينات من مجموعة الألوان (10 أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة). - أضف ببطء 500 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 0.25 غرام من حبوب اللقاح لمجموعة الألوان. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك حبوب اللقاح باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك المستخدم في كوب نفايات بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام ؛ كرر هذه العملية لكل أنبوب.
ملاحظة: استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل أنبوب. تأكد من أن غطاء كل أنبوب مغلق بإحكام. - الطرد المركزي للعينات لمدة 3 دقائق عند 1100 × غرام. صب supernatant من الأنابيب إلى دورق النفايات الحمضية. ثم ، المس بهدوء ولفترة وجيزة الفم المفتوح للأنبوب بمنشفة ورقية نظيفة لإزالة حمض الخليك الجليدي المتبقي حول حافة الأنبوب.
ملاحظة: احرص على عدم فقدان حبيبات حبوب اللقاح عند صب المواد الخارقة.
- قم بتشغيل كتلة حرارة إلى 80 درجة مئوية.
- قم بإجراء انحلال الأسيت.
ملاحظة: نفذ الخطوات التالية داخل غطاء الدخان مع معطف المختبر وحماية العين وقفازات الفينيل البوتيل.- تحضير خليط انحلال الأسيتوليز (9: 1 حمض الخليك الجليدي: حمض الكبريتيك) عن طريق إضافة 10.8 مل من حمض الخليك الجليدي أولا (من أليكوت العامل) إلى خليط انحلال الأسيتوليز المسمى بالدورق. ثم ، باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مزودة بأطراف ماصة مصفاة 1250 ميكرولتر ، أضف ببطء 1200 ميكرولتر (1.2 مل) من حمض الكبريتيك المركز من محلول المخزون إلى كوب خليط تحلل الأسيتوليز الذي يحتوي على حمض الخليك الجليدي. تخلص من طرف الماصة المستخدم في كوب بيكربونات الصوديوم.
ملاحظة: قد يصبح كوب خليط انحلال الأسيتوليز دافئا عند اللمس، وقد يتحول الخليط إلى اللون الأصفر. هناك احتمالان يجعلان الخليط يتحول إلى لون داكن: (أ) قد تكون الكواشف قد تجاوزت تواريخ انتهاء صلاحيتها ، أو (ب) قد تمت إضافة الكثير من حمض الكبريتيك. على أي حال ، إذا تحول الخليط إلى الظلام ، فقم بالتخلص منه في كوب النفايات الحمضية ، وقم بإعداد خليط انحلال الأسيتوليزي الطازج. - حرك خليط انحلال الأسيتوليز برفق باستخدام قضيب زجاجي أو عصا تحريك خشبية لضمان تجانسه. ضع القضيب / العصا المستخدمة في كوب بيكربونات الصوديوم.
- باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع أطراف ماصة مصفاة 1250 ميكرولتر ، أضف ببطء 1000 ميكرولتر من خليط انحلال الأسيتوليز من الكأس إلى كل أنبوب. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك المستخدم في كوب نفايات بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام.
ملاحظة: استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل عينة. - ضع العينات على كتلة الحرارة المسخنة مسبقا (80 درجة مئوية). احتضن الأنابيب لمدة 5 دقائق ، مع تحريك كل أنبوب جيدا باستخدام مسواك نظيف في منتصف الطريق خلال الحضانة. ضع كل مسواك مستخدم في كوب بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام.
ملاحظة: لا تترك المسواك في العينات. الحمض سوف يذوبها.
- تحضير خليط انحلال الأسيتوليز (9: 1 حمض الخليك الجليدي: حمض الكبريتيك) عن طريق إضافة 10.8 مل من حمض الخليك الجليدي أولا (من أليكوت العامل) إلى خليط انحلال الأسيتوليز المسمى بالدورق. ثم ، باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مزودة بأطراف ماصة مصفاة 1250 ميكرولتر ، أضف ببطء 1200 ميكرولتر (1.2 مل) من حمض الكبريتيك المركز من محلول المخزون إلى كوب خليط تحلل الأسيتوليز الذي يحتوي على حمض الخليك الجليدي. تخلص من طرف الماصة المستخدم في كوب بيكربونات الصوديوم.
- قم بإجراء غسل حمض الخليك الجليدي بعد انحلال الأسيتوليس.
ملاحظة: نفذ الخطوات التالية في غطاء الدخان مع معطف المختبر وحماية العين وقفازات الفينيل البوتيل.- أضف ببطء 500 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى كل أنبوب. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك المستخدم في كوب بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام.
ملاحظة: استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل عينة. تأكد من أن غطاء كل أنبوب مغلق بإحكام. - الطرد المركزي للعينات لمدة 3 دقائق عند 1100 × غرام. قم بصب supernatant من كل أنبوب في دورق النفايات الحمضية. ثم ، المس بهدوء ولفترة وجيزة الفم المفتوح للأنبوب بمنشفة ورقية نظيفة لإزالة الحمض المتبقي حول حافة الأنبوب.
- شطف قفازات الفينيل بوتيل جيدا تحت الماء الجاري لمدة 30 ثانية على الأقل ، وإزالتها ، ووضعها على الجفاف.
ملاحظة: اتبع إرشادات الشركة المصنعة بشأن إعادة استخدام قفازات الفينيل البوتيل.
- أضف ببطء 500 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي إلى كل أنبوب. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك المستخدم في كوب بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام.
- قم بإجراء ثلاث عمليات شطف بالماء لكل عينة. نفذ الخطوات التالية داخل غطاء الدخان مع معطف المختبر وحماية العين وقفازات النتريل.
- أضف 1000 ميكرولتر من الماء المقطر من كوب الماء المقطر إلى كل أنبوب. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك في كوب نفايات بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام.
ملاحظة: استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل عينة. تأكد من أن غطاء كل أنبوب مغلق بإحكام. - الطرد المركزي للعينات لمدة 3 دقائق عند 1100 × غرام. قم بصب السوبرناتانت من الأنابيب إلى كوب بيكربونات الصوديوم. ثم المس بهدوء الفم المفتوح للأنبوب بمنشفة ورقية نظيفة لإزالة الماء المتبقي حول حافة الأنبوب.
- كرر الخطوات 4.4.1-4.4.2 مرتين إضافيتين لما مجموعه ثلاث عمليات شطف بالماء.
- أضف 1000 ميكرولتر من الماء المقطر من كوب الماء المقطر إلى كل أنبوب. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك في كوب نفايات بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام.
- قم بإجراء شطف الإيثانول لكل عينة.
ملاحظة: نفذ الخطوات التالية داخل غطاء الدخان مع معطف المختبر وحماية العين وقفازات النتريل.- باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع أطراف ماصة مصفاة 1250 ميكرولتر ، أضف 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ من كوب الإيثانول إلى كل أنبوب. تخلص من طرف الماصة وتحويله إلى نفايات غير خطرة. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا.
ملاحظة: ضع المسواك في كوب نفايات بيكربونات الصوديوم بعد الاستخدام. استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل عينة. تأكد من أن غطاء كل أنبوب مغلق بإحكام. - الطرد المركزي للعينات لمدة 3 دقائق عند 1100 × غرام. قم بتزيين السوبر نات من الأنابيب إلى وعاء نفايات الإيثانول ، ولمس بهدوء الفم المفتوح للأنبوب بمنشفة ورقية نظيفة لإزالة الإيثانول المتبقي من الأنبوب.
- باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع أطراف ماصة مصفاة 1250 ميكرولتر ، أضف 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ من كوب الإيثانول إلى كل أنبوب. تخلص من طرف الماصة وتحويله إلى نفايات غير خطرة. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا.
- ارتد معطف المختبر وحماية العين وقفازات النتريل لتلطيخ العينات. اخلطي محلول مرق البقع Safranin O باستخدام انعكاس لطيف.
- باستخدام ماصة نقل بلاستيكية يمكن التخلص منها ، أضف 5-10 قطرات من بقعة Safranin O إلى كل أنبوب. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. اترك المسواك في الأنبوب.
- باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع أطراف ماصة مصفاة 1250 ميكرولتر ، أضف 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ من كوب الإيثانول إلى كل أنبوب. تخلص من طرف الماصة وتحويله إلى نفايات غير خطرة. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك مع المسواك لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا. ضع المسواك المستخدم في النفايات غير الخطرة بعد الاستخدام.
- تأكد من أن غطاء كل أنبوب مغلق بإحكام. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 1100 × جم. صب supernatant في دورق نفايات الإيثانول.
ملاحظة: لا تلمس فم الأنبوب بمنشفة ورقية هذه المرة. - أضف 10-15 قطرة من الجلسرين إلى كل أنبوب باستخدام ماصة نقل بلاستيكية يمكن التخلص منها. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك محتويات الأنبوب باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا.
ملاحظة: ضع المسواك المستخدم في النفايات غير الخطرة بعد الاستخدام. استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل عينة. تأكد من أن جميع ملصقات الأنابيب مقروءة.
- اترك الأنابيب مفتوحة في غطاء الدخان لتبخير الإيثانول لمدة 2 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة المحيطة. تحقق من العينات بحثا عن رائحة الإيثانول: إذا كان من الممكن اكتشافها ، فإن العينات ليست جاهزة ويجب تركها لتجف حتى تتبدد رائحة الإيثانول.
- تنظيف جميع المواد، والتخلص من النفايات. قم بإيقاف تشغيل كل من جهاز الطرد المركزي وكتلة الحرارة. التخلص من جميع النفايات الصلبة والسائلة وفقا لإرشادات الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة المعينة.
- إعداد شرائح المجهر لتحديد حبوب اللقاح ؛ تسمية لهم مقروءة. قم بتسمية شريحة مجهر زجاجية نظيفة بشكل مناسب لكل مجموعة / عينة ملونة سيتم تركيبها. أثناء فحص الأنبوب بصريا ، حرك العينة باستخدام مسواك نظيف لمدة 10-15 ثانية ، وتأكد من خلط محتويات الأنبوب جيدا.
ملاحظة: يمكن إعداد الشرائح على مقعد المختبر. تخلص من عود الأسنان في النفايات غير الخطرة. استخدم مسواك نظيفا وجديدا لكل عينة.- باستخدام ماصة نقل بلاستيكية نظيفة يمكن التخلص منها ، قم بإزالة 1 قطرة من بقايا حبوب اللقاح من أنبوب ، وضعها في وسط شريحة المجهر الموسومة. اترك القطرة تنتشر قليلا. ضع غطاء نظيفا فوق القطرة على الشريحة.
- بعد أن تجف الشريحة، أغلق الغطاء على الشريحة باستخدام طلاء أظافر شفاف. ضع قطرة صغيرة من التلميع على كل ركن من أركان الغطاء ، وقم بطلاء حدود من التلميع حول محيط الغطاء حيث يلتقي الشريحة. اتركي طلاء الأظافر يجف تماما، وقومي بطلاء طبقة ثانية من الطلاء حول محيط الغطاء.
Representative Results
أفادت دراسة سابقة عن تقييم تنوع حبوب اللقاح التي جمعها نحل العسل في المحاصيل الزراعية التالية: اللوز والكرز والتوت الأزرق عالي الأدغال والجزر الهجين والمروج14. باستخدام الطرق الموصوفة ، تم جمع حبوب اللقاح القشرية ، وفرزها حسب اللون ، وتحديد المصادر النباتية لكل مجموعة ألوان بيليه لتقييم تنوع حبوب اللقاح. تم تركيب مصائد حبوب اللقاح في الأسفل على مستعمرات في مواقع متعددة لكل محصول (الشكل 1 ألف). كانت كمية حبوب اللقاح التي تم جمعها من كل موقع كافية لتلبية متطلبات وزن العينة لطرق فرز الألوان وتحليل الأسيتوليس. كان لكل عينة من عينات جمع حبوب اللقاح مجموعات ألوان متعددة يمكن تمييزها (الشكل 2 والشكل 3). في بعض العينات ، احتوت مجموعات ألوان حبوب اللقاح على عدد قليل يصل إلى 4-5 كريات. ومع ذلك ، كان لدى معظم المجموعات أكثر من ذلك بكثير ، وبالتالي كانت بمثابة مجموعة ألوان خاصة بها لتحلل الأسيتوليز (الشكل 4 والشكل 5). بعد انحلال الأسيتوليز (الشكل 6)، تم استخدام المجهر الضوئي الساطع لتحديد كل مجموعة لونية بشكل فعال إلى أدنى رتبة تصنيفية ممكنة لها من خلال تأكيد الخصائص المورفولوجية مع خصائص عينات القسائم التي تم جمعها من المنطقة المحيطة بكل موقع دراسة (الشكل 7).
الشكل 1: مصائد حبوب اللقاح المثبتة على مستعمرة نحل العسل لجمع حبوب اللقاح الكوربيكية. (أ) مصائد مثبتة في الأسفل موضوعة فوق اللوحة السفلية للخلية ومباشرة فوق صندوق الخلية الأدنى. تشمل أنماط مصيدة حبوب اللقاح الأخرى (B) الحامل الأمامي و (C) مصائد تركيب مدخل ثقب المثقاب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: آلية الاصطياد وصينية جمع مصيدة حبوب اللقاح. يجب أن تضغط علف حبوب اللقاح العائدة من خلال آلية محاصرة الشبكة قبل الوصول إلى خليتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صينية جمع مصيدة حبوب اللقاح. يتم كشط حبوب اللقاح القشرية من أرجل علف حبوب اللقاح العائدة بواسطة مصيدة حبوب اللقاح وتقع في صينية التجميع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فرز عينة من حبوب اللقاح القشرية إلى مجموعات لونية. يمكن تجفيف حبوب اللقاح القشرية ووزنها بعد فرزها إلى مجموعات ملونة للإبلاغ عن نسب الكريات الملونة المختلفة التي تم جمعها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أربع مجموعات من كريات حبوب اللقاح مرتبة حسب اللون باستخدام دليل ألوان بانتون. يتم تصنيف مجموعات الألوان على أنها (A) رمادي ، Pantone 5855C ، (B) بني ، Pantone 7557C ، (C) أصفر ، Pantone 458C ، و (D) بني فاتح ، Pantone 3547C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إعداد معدات انحلال الأسيتوليز داخل غطاء الدخان. كتلة الحرارة ، والكواشف ، ونفايات المذيبات وحاويات النفايات الحمضية ، والأكواب الملصقة ، والماصة ، وأطراف الماصة ، وعصي التحريك ، وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة الموجودة داخل غطاء الدخان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: رسم مجهري لحبوب اللقاح الملطخة والمحللة. العديد من جوانب حبوب اللقاح من الخردل المحلل بالأساتوليز (Brassicaceae) عند تكبير 40x. شريط المقياس = 50.398 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وكان لحبوب اللقاح المجمعة من مواقع محاصيل اللوز تنوع حبوب اللقاح أقل نسبيا من حبوب اللقاح التي جمعت من محاصيل أخرى، بمتوسط 3.0 ± 0.5 لون حبيبات و 3.2 ± 1.2 صنف نباتي لكل موقع (الجدول 2)14. وشهدت نظم المحاصيل الأربعة المتبقية مستويات أعلى من تنوع حبوب اللقاح بمتوسط 6.0 ± 2.0 لون حبيبات و 8.0 ± 1.5 صنف نباتي لكل موقع في الكرز، و 8.8 ± و 1.4 لون حبيبات و 13.5 ± 2.0 صنف نباتي لكل موقع في التوت الأزرق عالي الأدغال، و 7.0 ± 1.0 لون حبيبات و 11.0 ± 0.0 صنف نباتي لكل موقع في الجزر الهجين، و 10.0 ± 0.0 ألوان حبيبات و 13.0 ± 1.5 صنف نباتي لكل موقع في المروج14.
| محصول | متوسط عدد ألوان / موقع بيليه حبوب اللقاح (SE) | متوسط عدد الأصناف/المواقع النباتية (SE) | مجموع الأصناف المحددة | ||
| أسرة | جنس | جنس | |||
| لوز | 3.0 (0.5) | 3.2 (1.2) | 4 | 3 | 4 |
| عنبيه | 8.8 (1.4) | 13.5 (2.0) | 5 | 10 | 13 |
| جزر | 7.0 (1.0) | 11.0 (0.0) | 3 | 5 | 6 |
| كرز | 6.0 (2.0) | 8.0 (1.5) | 4 | 7 | 5 |
| ميدوفوم | 10.0 (0.0) | 13.0 (1.5) | 5 | 4 | 14 |
الجدول 2: تنوع حبوب اللقاح القشرية التي تم جمعها من نحل العسل في خمسة أنظمة للمحاصيل. تشمل مقاييس التنوع متوسط عدد ألوان الكريات (± SE) ، ومتوسط عدد الأصناف النباتية (± SE) ، وإجمالي الأصناف المحددة. تم تعديل هذا الجدول من14. الاختصار: SE = خطأ قياسي.
Discussion
أنماط مصيدة حبوب اللقاح المختلفة لها مزاياها وعواقبها الخاصة. وتناقش أدناه فوائد وقيود أربعة أنماط مصيدة شائعة الاستخدام، (1) مثبتة أمامية، (2) مثبتة في الأسفل، (3) فتحة مثقاب (3) و(4) مصائد حبوب اللقاح ذات التركيب العلوي. تعد مصائد التثبيت الأمامي هي النمط الأكثر تنوعا (الشكل 1B). التثبيت سريع وسهل. يمكن القيام بذلك دون رفع صناديق الخلية ، ويمكن أن تتناسب هذه الفخاخ مع أي نمط Langstroth من معدات الخلية. عندما يجلس درج التجميع أمام المستعمرة ، فإنه يجمع الحد الأدنى من الحطام من المستعمرة. ومع ذلك ، فإن صينية التجميع أكثر عرضة للعناصر الخارجية - الرطوبة من الري الميداني ، أو الطقس الممطر أو الرطب ، أو يمكن أن يتلامس الندى مع حبوب اللقاح من خلال صينية التجميع ، مما قد يجعل حبوب اللقاح غير صالحة للاستخدام إذا أصبحت الكريات مشبعة جدا بحيث لا يمكن فصلها. يمكن تقليل خطر تشبع حبوب اللقاح عن طريق تجنب الاصطياد أثناء الأحداث المتوقعة للأمطار أو الرطوبة العالية. إن وضع حصيرة مطاطية تحت المصيدة ومواد تغطية إضافية (على سبيل المثال ، شعر التسقيف) فوق مصيدة حبوب اللقاح يمكن أن يحمي أيضا صينية التجميع من الطقس.
تم استخدام مصائد التثبيت السفلي لجمع حبوب اللقاح للبيانات الواردة في هذه الورقة (الشكل 1A). فهي ليست مريحة للتثبيت لأنه يجب وضعها تحت عش الحضنة في المستعمرة. يستغرق التثبيت وقتا طويلا ويؤدي إلى سقوط كمية كبيرة من الحطام في الفخ من المستعمرة ، مثل أجزاء النحل وأجزاء صغيرة من الشمع. أرضية صينية التجميع لمعظم مصائد التركيب السفلي المصنعة مصنوعة من شبكة دقيقة ، مما يسمح بالتهوية المناسبة لحماية حبوب اللقاح المجمعة من الرطوبة. تساعد مصائد حبوب اللقاح ذات الثقوب المثقوبة على تقليل ارتباك العلافين إذا كانوا يستخدمون في المقام الأول ثقوب المثقاب كمداخل للخلية بدلا من المدخل الذي يصنعه الجزء السفلي من الخلية (الشكل 1C). نظرا لأن درج التجميع الخاص بمصائد حبوب اللقاح ذات الثقب المثقب صغير جدا ، فيجب تفريغه بشكل متكرر لتجنب فيضان درج التجميع. نظرا لوضعها العلوي على خلية ، فإن مصيدة حبوب اللقاح العلوية هي أسهل نمط مصيدة للتثبيت والإزالة ، وعينة حبوب اللقاح التي تم جمعها خالية من حطام الخلية. ومع ذلك ، فإن نمط المصيدة هذا حساس للغاية لمعدات الخلية التالفة حيث أن درج التجميع سيتعرض للرطوبة إذا لم يتم إغلاق الغطاء والغطاء الداخلي وصندوق الخلية العلوي معا بشكل صحيح.
تدعو البروتوكولات الموضحة هنا إلى اختيار مستعمرات بها أعداد كبيرة من البالغين واليرقات (الخطوة 1.2). تهدف طريقة الاختيار هذه إلى إنتاج كميات كبيرة جدا من حبوب اللقاح المحاصرة من هذه المستعمرات. قد تواجه المستعمرات التي تحتوي على أعداد كبيرة من العلف ازدحاما شديدا عند المدخل عند تركيب الفخ. اختيار مدخل خلية كبيرة سيخفف من الازدحام. قد تجمع مجموعات كبيرة من الباحثين عن الطعام أيضا كميات كبيرة جدا من حبوب اللقاح التي يمكن أن تتجاوز حدود صينية التجميع. استخدم صواني التجميع الضخمة ، كما هو موضح في معظم أنماط الفخ السفلية أو العلوية ، والصواني الفارغة بشكل متكرر لاستيعاب كميات كبيرة من حبوب اللقاح المحاصرة. إذا كان الهدف البحثي المطلوب هو تقييم كميات حبوب اللقاح التي تجمعها المستعمرات في المنحل ، فاختر مستعمرات تمثيلية بدلا من تحسين مجموعات البالغين واليرقات للاختيار. جميع أنماط مصائد حبوب اللقاح تمنع مدخل الخلية وتخلق مدخلا جديدا يختلف مكانيا عن المدخل الأصلي16. عادة ما تفشل مصائد حبوب اللقاح في جمع حبوب اللقاح عندما لا يتمكن العلافون من إعادة التوجيه إلى المدخل الجديد لمصيدة حبوب اللقاح عند التركيب. تنجرف هذه العلافات بسهولة إلى خلايا النحل المجاورة ، مما قد يؤدي إلى تلويث عينات أخرى من حبوب اللقاح إذا دخلت خلية أخرى بمصيدة حبوب اللقاح. وبالتالي ، ينبغي إعطاء العلافين 24 ساعة على الأقل للتأقلم مع المدخل الجديد عن طريق الحفاظ على آلية الاصطياد غير متفاعلة بعد التثبيت. كما أن اختيار المستعمرات ذات مداخل الخلايا الإضافية القليلة أو معدومة يقلل أيضا من الارتباك عند التوجه إلى مدخل مصيدة حبوب اللقاح الجديد.
يجب إغلاق مداخل الخلية الإضافية (مثل الثقوب والأغطية المشوهة) ، ولكن خطر انجراف العلف إلى خلايا النحل المجاورة سيزداد مع وجود هذه المداخل في بداية تركيب الفخ. كما أن العلافين سوف ينجرفون بسهولة إلى مداخل خلايا النحل الأخرى إذا تم تثبيت مصيدة حبوب اللقاح فقط على خلية واحدة في مجموعة من خلايا النحل المنصة. من غير المرجح أن ينجرف العلافون إذا كانت جميع خلايا النحل التي تواجه نفس الاتجاه على البليت تحتوي على مصائد مثبتة. قد تشكل مصائد حبوب اللقاح العلوية خطرا أكبر من انجراف النحل بسبب المسافة الكبيرة بين مدخل مصيدة حبوب اللقاح والمدخل الأصلي للخلية. في هذه الدراسة ، تم تركيب مصائد حبوب اللقاح على مستعمرات متعددة لنحل العسل في كل موقع تجريبي لحساب التباين في كمية حبوب اللقاح وتكوين الأصناف بين كل مستعمرة نحل عسل. وبالتالي ، يجب تثبيت مصائد حبوب اللقاح على مستعمرات متعددة لتحقيق مجموعات حبوب لقاح قوية من المناظر الطبيعية لأن جمع حبوب اللقاح يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا بين المستعمرات بناء على نوع الأنواع النباتية وإجمالي الكمية المجمعة12,13. كان لكل عينة من حبوب اللقاح فترة جمع مدتها 7 أيام. في الدراسات المستقبلية ، سيؤدي جمع حبوب اللقاح في فترتين أو ثلاث فترات متتالية مدتها 72 ساعة إلى زيادة دقة تقدير علف حبوب اللقاح40.
نظرا لوجود درجة عالية من التذبذب الزمني في جمع حبوب اللقاح ، يمكن زيادة دقة تقدير حبوب اللقاح عن طريق تكرار عملية جمع حبوب اللقاح في فترات الإزهار المبكرة والذروة والمتأخرة لأنظمة المحاصيل المستهدفة24،27،39. يجب جمع حبوب اللقاح من مواقع متعددة ، وإن كان نفس نظام المحاصيل أو نوع المناظر الطبيعية ، بسبب التباين المتوقع في الكمية ونوع الأنواع النباتية بين مواقع المنحل14،27،33،43. يمكن أن يكون اصطياد حبوب اللقاح على المدى الطويل ضارا بمستعمرات نحل العسل. وتشمل الآثار المحتملة انخفاض تربية الحضنة، وتقصير فترة نمو اليرقات، وأكل لحوم البشر من البيض واليرقات الصغيرة في خلايا النحل19،44،45،46. يمكن أن تؤدي الفترات الأطول من اصطياد حبوب اللقاح ، مثل موسم النمو بأكمله ، إلى تفاقم الآثار الضارة على تربية الحضنة في المستعمرات. يمكن أن يؤدي حبس حبوب اللقاح أيضا إلى انخفاض في إنتاج العسل وزيادة في مستوى رطوبة العسل المخزن13. يمكن أن يؤدي تدوير مصائد حبوب اللقاح بين المستعمرات في المنحل عند المراقبة المستمرة للمناظر الطبيعية أو نظام المحاصيل إلى تخفيف الضرر الذي يلحق بالمستعمرات المستخدمة في اصطياد حبوب اللقاح. إن الانخراط في مصائد حبوب اللقاح كل أسبوعين سيقلل من الآثار الضارة ، وخاصة الخسارة في إنتاج العسل ، إذا تم احتجاز حبوب اللقاح في نفس المستعمرات طوال فترة زمنية13.
بالإضافة إلى ذلك ، يفضل وضع مصائد حبوب اللقاح على مستعمرات قوية. في بعض الأحيان ، قد تشارك مصائد حبوب اللقاح عن غير قصد. يمكن تجنب ذلك عن طريق قفل آلية مصيدة حبوب اللقاح عندما لا يكون جمع مصيدة حبوب اللقاح مرغوبا فيه. لا تزيل مصائد حبوب اللقاح جميع حبوب اللقاح القشرية من علف نحل العسل. تعتمد كفاءة الاصطياد على نوع المصيدة وحجم حبيبات حبوب اللقاح وحجم جسم النحل والوقت من اليوم والظروف الجوية. وبالتالي ، فإن جمع حبوب اللقاح القشرية غير متسق عند استخدام مصائد حبوب اللقاح لأنواع نباتية مختلفة وفترات جمع25,26. كريات حبوب اللقاح الأصغر من النباتات مثل Eucalyptus spp. و Tamarix spp. أقل عرضة للالتقاط بواسطة مصائد حبوب اللقاح27. والجدير بالذكر أنه لم يتم العثور على حبوب اللقاح التوت الأزرق عالية الأدغال (Vaccinium corymbosum L.) من مواقع جمع التوت الأزرق عالية الأدغال في هذه الدراسة ، والتي تدعم الأدلة السابقة على أن كريات حبوب اللقاح التوت الأزرق عالية الأدغال صغيرة جدا بالنسبة لجمع مصيدة حبوب اللقاح47. في المقابل ، تم العثور على حبوب اللقاح التي تم الحصول عليها من الهندباء (Taraxacum officinale F.H. Wigg) في كل نظام زراعة في هذه الدراسة. يمكن أن تكون كريات حبوب اللقاح من بعض الأنواع النباتية أكبر بكثير من غيرها ، مثل Taraxacum spp. ، ويمكن أن تكون ممثلة بشكل مفرط في تحليل مجموعات حبوب اللقاح من مصائد حبوب اللقاح27. إن التقاط فرادى علف حبوب اللقاح وإزالة حبوب اللقاح القشرية يدويا سيزيد من دقة تقييم مصدر حبوب اللقاح ، ولكنه يتطلب وقتا طويلا وموارد مقارنة باستخدام مصائد حبوب اللقاح (الجدول 1). إن فرز كريات حبوب اللقاح إلى مجموعات ملونة أمر مستقيم نسبيا إلى الأمام ، على الرغم من أنه يستغرق وقتا طويلا. ما لم يكن هناك هدف أو غاية بحثية محددة ، يجب أن تقتصر كمية كريات حبوب اللقاح على 10 جم أو أقل (لأي عينة معينة) للفرز إلى مجموعات ملونة. سيؤدي فرز العينات بأكملها التي تحتوي على كميات أكبر من هذه الكمية إلى زيادة كبيرة في الوقت اللازم لإكمال التحليل. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم خلط عينة حبوب اللقاح بشكل جيد للغاية قبل أخذ عينة فرعية لفرز الألوان منها. قد يؤدي الفشل في خلط العينة الأصلية إلى عينة فرعية لا تمثل الكل ، والتي يجب تجنبها.
إذا كانت حاوية العينة الأصلية لا تحتوي على مساحة حرة كافية للسماح بالخلط الدقيق لحبيبات حبوب اللقاح ، فيجب أن يكون وضع العينة بأكملها في كيس بلاستيكي كبير أو كيس ورقي صغير كافيا ، حتى بالنسبة للعينات الكبيرة. سوف تعمل أيضا الحاويات البلاستيكية الصلبة والمغطاة. يجب أن يتم خلط العينة بلطف ، بحيث لا يتم سحق كريات حبوب اللقاح أو تدميرها بطريقة أخرى. يمكن للتحيز غير المقصود أن يقنع المرء دون وعي بإخراج "الكريات الأرجوانية الجميلة" ، على سبيل المثال ، عند إزالة عينة فرعية من الكل. لذلك ، يجب حجب تكوين لون العينة عن الأنظار أثناء إخراج عينة فرعية. وبهذه الطريقة ، فإن الحصول على عينة فرعية تمثل الكل حقا هو أكثر احتمالا. ومع ذلك ، يمكن أن تفشل طريقة أخذ العينات الفرعية هذه في اختيار كريات حبوب اللقاح ذات الوفرة المنخفضة في العينة. لذلك ، إذا كان تحديد كل صنف نباتي فردي ممثل في العينة هدفا بحثيا ، فلن يكون جمع عينة فرعية مناسبا ؛ يجب تحليل العينة بأكملها. وبالتالي ، يجب فرز الكريات في طبق بتري زجاجي. بمجرد الانتهاء من الفرز ، يمكن وضع الصفحات المناسبة من دليل ألوان Pantone أسفل الطبق لتسهيل مطابقة الألوان بين الدليل وحبوب اللقاح التي تم فرزها. ويوضح الشكل 5 مثالا على ذلك.
عند محاصرة حبوب اللقاح من مستعمرات نحل العسل الموضوعة في المحاصيل للتلقيح ، لا ينبغي استخدام أكثر من عشر مجموعات ألوان إجمالية: تسعة ألوان فردية ومجموعة ألوان "متنوعة" واحدة تتكون من ألوان الأقلية في العينة. إن وضع حد معقول للحد الأقصى لعدد المجموعات الملونة التي يمكن تقسيم العينة إليها يمنع الباحث من التورط عن طريق فصل الكريات إلى ما لا نهاية إلى أعداد متزايدة باستمرار من المجموعات المحددة للغاية ، والتي ، عند اكتمال الفرز ، قد لا تحتوي بشكل فردي على كميات كافية لتحلل الأسيتوليس. إذا كان الاصطياد من المستعمرات التي من المحتمل أن تبحث عن الطعام من مجموعة متنوعة جدا من الأنواع النباتية ، فقد يكون من الضروري المزيد من مجموعات الألوان ، ويجب تحسين البروتوكولات لتعكس هذا المطلب. ركزت الدراسة الحالية على عينات حبوب اللقاح التي تم جمعها من مستعمرات نحل العسل التي تقوم بتلقيح المحاصيل ، وتم العثور على أنواع متعددة بشكل شائع في مجموعة ألوان ، على غرار الدراسات السابقة29،30،31.
يذيب انحلال الأسيتوليز الدهون والبروتينات والحطام العضوي من سطح حبوب اللقاح ، ويكشف عن السمات المميزة للإكسين ، بحيث يمكن تلطيخ الحبوب وتحديدها بسهولة أكبر. إنها منهجية قديمة وشائعة تستخدم في العديد من أنواع أبحاث حبوب اللقاح37. يتم توحيد الخطوات العامة. أنها تختلف قليلا من بروتوكول إلى آخر. ومع ذلك ، فإن تفاصيل سرعات وأوقات الطرد المركزي ، ودرجة حرارة الحضانة ومدتها ، وأحجام الكواشف التي تعتمد على كمية حبوب اللقاح وحتى طريقة إزالة المواد الفائقة (الصب مقابل السحب) قد تحتاج إلى تحسين تجريبي وفقا لأهداف البحث ، وإلى حد ما ، أنواع حبوب اللقاح التي من المحتمل مواجهتها48. في الواقع ، يمكن أن يزيل تحلل الأسيتوليز الأحرف التشخيصية المهمة لحبوب اللقاح من بعض الأصناف مثل Malvaceae و Orchidaceae38. لذلك ، ليست كل حبوب اللقاح قابلة للطرق القياسية لتحلل الأسيتوليس. كما ذكر أعلاه ، تم تحسين هذه الطرق في هذه الدراسة لغرض تحديد مصادر الأصناف النباتية السائدة لحبوب اللقاح التي يجمعها نحل العسل الملقح للمحاصيل. التفاصيل التي يجب مراعاتها إذا كان التحديد الكمي الدقيق لحبوب اللقاح جزءا من الدراسة ، لم يتم تناولها في هذه الورقة.
يتطلب استخدام المذيبات والأحماض تخطيطا دقيقا ومعدات حماية شخصية مناسبة (PPE) والتخلص المسؤول من النفايات (الشكل 6). من الأهمية بمكان أن يحدد الباحثون الطريقة الصحيحة لتخزين الكواشف والتخلص من النفايات قبل البدء في أي جزء من انحلال الأسيتو. في هذا المختبر ، يتم استخدام قفازات البوتيل خلال أي جزء من العملية التي تنطوي على حمض الكبريتيك وحتى حمض الخليك الجليدي لأنها تتمتع بتصنيفات تحلل ونفاذية أفضل بكثير لكلا الأحماض من قفازات النتريل ، مع عدم المساس بالبراعة49. وسيكون من الحكمة الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للسلامة الصادرة عن المؤسسة المعنية للحصول على توصيات بشأن القفازات المناسبة وغيرها من معدات الوقاية الشخصية49. تساعد إضافة حمض الخليك الجليدي قبل خطوة انحلال الأسيتوليز على إزالة أي رطوبة متبقية في العينة وإعدادها لتفاعل تحلل الأسيتوليز المهم. قد يتفاعل خليط حمض الخليك الجليدي وحمض الكبريتيك في خطوة انحلال الأسيتوليز بعنف مع الماء ، ولهذا السبب من المهم أن تكون جميع الأواني الزجاجية والإمدادات جافة تماما ، وأن تتم إزالة كل الرطوبة من العينة قبل انحلال الأسيتول. إضافة ما بعد انحلال الأسيتوليز من حمض الخليك الجليدي يخفف ويحيد خليط انحلال الأسيتوليس.
يمكن للإيثانول وحمض الخليك الجليدي ، على وجه الخصوص ، إذابة حبر ملصقات أنابيب الطرد المركزي الدقيق ، إذا كانت هذه الكواشف تقطر على السطح الخارجي للأنبوب ، حتى مع الأقلام المقاومة للمذيبات. تحقق من ملصقات الأنبوب بشكل متكرر طوال العملية للتأكد من أنها لا تزال مقروءة. إذا كان ذلك ممكنا من الناحية اللوجستية ، ففكر في استخدام الملصقات المطبوعة بواسطة LaserJet كحماية ضد هذا الاحتمال. ستؤثر الطريقة التي يتم بها صب المواد الفائقة على ما إذا كانت الكواشف تقطر أسفل الجزء الخارجي من أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. من المهم صب supernatant بيد واثقة وناعمة ، والتي تأتي مع الممارسة. يجب توخي الحذر لتجنب فقدان عينات حبوب اللقاح من أنبوب جهاز الطرد المركزي أثناء التصفيق. يؤدي الصب بسرعة كبيرة إلى فقدان بعض أو كل بقايا حبوب اللقاح ؛ قد يؤدي الصب ببطء شديد إلى تشغيل السوبرناتانت أسفل الأنبوب. على الرغم من أن درجة حرارة الحضانة تبلغ 100 درجة مئوية يوصى بها عادة ، إلا أن حبوب اللقاح يمكن أن تصبح بسهولة "مطبوخة بشكل مفرط" عند درجة الحرارة هذه بالكميات المستخدمة في هذه الدراسة (0.25 جم) ، خاصة إذا تم احتضانها لفترات أطول قليلا29. في الواقع ، حتى عند 80 درجة مئوية ، يمكن أن تنفجر حبوب اللقاح أو تتلف إذا تركت في خليط انحلال الأسيتوليز لفترة طويلة جدا. يجب تحديد درجة حرارة الحضانة ومدتها بعناية لتجنب تدمير حبوب اللقاح في العينة.
يزيد تلطيخ حبوب اللقاح من تعريف وتباين ميزات exine ، مما يسهل التصوير والتعرف عليها (الشكل 7). خمس قطرات (من ماصة نقل البلاستيك) من 1٪ Safranin O ملطخة بشكل فعال 0.25 غرام من حبوب اللقاح. ومع ذلك ، فإن حبوب اللقاح المختلفة تلطخ بشكل مختلف. إذا كانت حبوب اللقاح ملطخة بشكل خفيف جدا أو ثقيل جدا ، فقد يكون من الصعب تحديد الهوية. عندما يكون ذلك ممكنا ، يجب التحقق من حجم محلول البقع اللازم لتلطيخ أنواع حبوب اللقاح المتوقع العثور عليها في الدراسة بشكل مناسب قبل البدء في معالجة العينات التجريبية. ومع ذلك ، إذا لم تكن إحدى العينات التجريبية ملطخة بشكل صحيح ، فيمكن تصحيحها. لتفتيح عينة حبوب اللقاح الملطخة بشدة ، اشطف العينة بالماء ثم الإيثانول. إذا لم تكن حبوب اللقاح ملطخة جيدا بما يكفي لرؤية السمات المميزة ، فيمكن إضافة بضع قطرات إضافية من البقع. يجب فحص بقعة هذه العينات قبل إضافة الجلسرين. وبالمثل ، قد تكون هناك حاجة إلى بعض التجربة والخطأ لتحديد الحجم المثالي للجليسرين لبقايا حبوب اللقاح. قامت 15 قطرة من الجلسرين بحماية العينات في هذه الدراسة بشكل مناسب من الجفاف ، مع تخفيف بقايا حبوب اللقاح أيضا إلى تركيز مثالي لتحديد المصب عبر المجهر الضوئي. قد تتطلب كميات أخرى من بقايا حبوب اللقاح أكثر أو أقل من الجلسرين لمنع الجفاف وتسهيل التركيب.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتورة غريتشن جونز (USDA-ARS ، APMRU ، College Station ، TX) للمساعدة في فرز الألوان وتحليل انحلال الأسيتوليس. تم دعم هذا البحث من خلال أموال البحث المقدمة إلى R.R.S. من قبل جمعية مربي النحل في ولاية أوريغون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #8 hardware cloth | 2.7 mm aperture | ||
| 10 mL graduated cylinder | |||
| 1000 uL micropipette tips | |||
| 1250 mL filter micropipette tips | |||
| 15 x 75 mm glass slides | Thickness: 0.93 mm - 1.05 mm | ||
| 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| 250 mL graduated Borosilicate glass beakers (x3) | VWR | 10754-952 | |
| 50 mL graduated Borosilicate glass beakers (x6) | VWR | 10754-946 | |
| 95% EtOH | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/Kosher grade |
| Butyl vinyl gloves | |||
| Centrifuge | 1060 x g maximum speed; horizontal swing preferred | ||
| Chemical safety goggles | |||
| Color guide | Pantone | SKU: GP1601A | Solid coated |
| Coverslip of 1 or 1.5 | Thickness: 0.13 mm - 0.19 mm | ||
| Distilled water | |||
| Forceps | |||
| Fume hood | |||
| Glacial acetic acid | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS grade |
| Glass funnel | |||
| Glycerin | Humco | 103196001_1 | USP grade, 99.5%, anhydrous |
| Hazardous waste containers | |||
| Hive tool | |||
| Hot block | Must reach 80 degree C | ||
| Lab coat with long sleeves | |||
| Latex or polyurethane foam | |||
| Microscope | |||
| Nailpolish, clear | |||
| Nitrile gloves | |||
| P1000 pipette | VWR | ||
| Petri dish | |||
| Plastic spoon | |||
| Safranin | Ward's Science | 470302-322 | Lab grade |
| Smoker | For pollen trap installation | ||
| Sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | ACS grade, powder |
| Squirt bottles (x2) | |||
| Sulfuric acid | EMD Millipore | SX1244 | ACS grade |
| Sundance Bottom Mount Pollen Trap | Betterbee Beekeeping Supply | PTRAPB | |
| Tape | |||
| Wooden stir sticks | |||
| Wooden tooth picks |
References
- Klein, A. M., Vaissière, B. E., Cane, J. H., Steffan-Dewenter, I., Cunningham, S. A., Kremen, C., Tscharntke, T. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 274 (1608), 303-313 (2007).
- vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. M., Pettis, J. S. A survey of honey bee colony losses in the United States, fall 2008 to spring 2009. Journal of Apicultural Research. 49 (1), 7-14 (2010).
- vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. M., Caron, D., Pettis, J. S. A survey of managed honey bee colony losses in the USA, fall 2009 to winter 2010. Journal of Apicultural Research. 50 (1), 1-10 (2011).
- vanEngelsdorp, D., et al. A national survey of managed honey bee 2010-11 winter colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 51 (1), 115-124 (2012).
- Spleen, A. M., et al. A national survey of managed honey bee 2011-12 winter colony losses in the United States: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 52 (2), 44-53 (2013).
- Steinhauer, N. A., et al. A national survey of managed honey bees 2012-2013 annual colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 1-18 (2014).
- Lee, K. V., et al. A national survey of managed honey bee 2013-2014 annual colony losses in the USA. Apidologie. 46 (3), 292-305 (2015).
- Seitz, N., et al. A national survey of managed honey bee 2014-2015 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 54 (4), 1-12 (2016).
- Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
- Steinhauer, N., et al. Drivers of colony losses. Current Opinion in Insect Science. 26, 142-148 (2018).
- Smart, M. D., Pettis, J. S., Euliss, N., Spivak, M. S. Land use in the Northern Great Plains region of the U.S. influences the survival and productivity of honey bee colonies. Agriculture, Ecosystems & Environment. 230, 139-149 (2016).
- Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS One. 8 (7), 70182 (2013).
- Hoover, S. E., Ovinge, L. P. Pollen collection, honey production, and pollination services: managing honey bees in an agricultural setting. Journal of Economic Entomology. 111 (4), 1509-1516 (2018).
- Topitzhofer, E., Lucas, H., Chakrabarti, P., Breece, C., Bryant, V., Sagili, R. R. Assessment of pollen diversity available to honey bees (Hymenoptera: Apidae) in major cropping systems during pollination in the western United States. Journal of Economic Entomology. 112 (5), 2040-2048 (2019).
- Judd, H. J., Huntzinger, C., Ramirez, R., Strange, J. P. A 3D printed pollen trap for bumble bee (Bombus) hive entrances. Journal of Visualized Experiments. (161), e61500 (2020).
- Delaplane, K. S., Dag, A., Danka, R. G., Freitas, B. M., Garibaldi, L. A., Goodwin, R. M., Hormaza, J. I. Standard methods for pollination research with Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-28 (2013).
- Barker, R. J. The influence of food inside the hive on pollen collection by a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 23-26 (1971).
- Levin, M. D., Loper, G. M. Factors affecting pollen trap efficiency. American Bee Journal. 124 (10), 721-723 (1984).
- Webster, T. C., Thorp, R. W., Briggs, D., Skinner, J., Parisian, T. Effects of pollen traps on honey bee (Hymenoptera: Apidae) foraging and brood rearing during almond and prune pollination. Environmental Entomology. 14 (6), 683-686 (1985).
- Gemeda, T. K., Li, J., Luo, S., Yang, H., Jin, T., Huang, J., Wu, J., Nascimento, F. S. Pollen trapping and sugar syrup feeding of honey bee (Hymenoptera: Apidae) enhance pollen collection of less preferred flowers. PLoS One. 13 (9), 0203648 (2018).
- Hellmich, R. L., Rothenbuhler, W. C. Relationship between different amounts of brood and the collection and use of pollen by the honey bee (Apis mellifera). Apidologie. 17 (1), 13-20 (1986).
- Weidenmüller, A., Tautz, J. In-hive behavior of pollen foragers (Apis mellifera) in honey bee colonies under conditions of high and low pollen need. Ethology. 108 (3), 205-221 (2002).
- Pernal, S. F., Currie, R. W. The influence of pollen quality on foraging behavior in honeybees (Apis mellifera L.). Behavioral Ecology and Sociobiology. 51 (1), 53-68 (2001).
- Couvillon, M. J., et al. Honey bee foraging distance depends on month and forage type. Apidologie. 46, 61-70 (2015).
- Percival, M. Pollen collection by Apis mellifera. New Phytologist. 46, 142-165 (1947).
- Synge, A. D. Pollen collection by honey bees (Apis mellifera). Journal of Animal Ecology. 16, 122-138 (1947).
- O'Neal, R. J., Waller, G. D. On the pollen harvest by the honey bee (Apis mellifera L.) near Tucson, Arizona (1976-1981). Desert Plants. 6, 81-109 (1984).
- Eckert, C. D., Winston, M. L., Ydenberg, R. C. The relationship between population size, amount of brood, and individual foraging behaviour in the honey bee, Apis mellifera. Oecologia. 97 (2), 248-255 (1994).
- Free, J. B. The flower constancy of honey bees. Journal of Animal Ecology. 32 (1), 119-132 (1963).
- van der Moezel, P. G., Delfs, J. C., Pate, J. S., Loneragan, W. A., Bell, D. T. Pollen selection by honeybees in shrublands of the Northern Sandplains of Western Australia. Journal of Apicultural Research. 26 (4), 224-232 (1987).
- Hill, P. S., Wells, P. H., Wells, H. Spontaneous flower constancy and learning in honey bees as a function of color. Animal Behaviour. 54 (3), 615-627 (1997).
- Barth, O., Munhoz, M., Luz, C. Botanical origin of Apis pollen loads using colour, weight and pollen morphology data. Acta Alimentaria. 38, 133-139 (2009).
- Colwell, M. J., Williams, G. R., Evans, R. C., Shutler, D. Honey bee-collected pollen in agro-ecosystems reveals diet diversity, diet quality, and pesticide exposure. Ecology and Evolution. 7 (18), 7243-7253 (2017).
- Stoner, K. A., Cowles, R. S., Nurse, A., Eitzer, B. D. Tracking pesticide residues to a plant genus using palynology in pollen trapped from honey bees (Hymenoptera: Apidae) at ornamental plant nurseries. Environmental Entomology. 48 (2), 351-362 (2019).
- Almeida-Muradian, L., Pamplona, L. C., Coimbra, S. I., Barth, O. M. Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets. Journal of Food Composition and Analysis. 18 (1), 105-111 (2005).
- Lau, P., Bryant, V., Rangel, J. Determining the minimum number of pollen grains needed for accurate honey bee (Apis mellifera) colony pollen pellet analysis. Palynology. 42 (1), 36-42 (2018).
- Erdtman, G. Handbook of palynology: morphology, taxonomy, ecology: an introduction to the study of pollen grains and spores. , Munksgaard, Copenhagen, DK. (1969).
- Jones, G. D. Pollen analyses for pollination research, acetolysis. Journal of Pollination Ecology. 13 (21), 203-217 (2014).
- Richardson, R. T., Lin, C. H., Sponsler, D. B., Quijia, J. O., Goodell, K., Johnson, R. M. Application of ITS2 metabarcoding to determine the provenance of pollen collected by honey bees in an agroecosystem. Applied Plant Science. 3 (1), 1-6 (2015).
- Dimou, M., Thrasyvoulou, A., Tsirakoglou, V. Efficient use of pollen traps to determine the pollen flora used by honey bees. Journal of Apicultural Research. 45 (1), 42-46 (2005).
- Szczesna, T., Rybak-Chmielewska, H., Chmielewski, W. Effect of infestation of pollen loads with acarid mites on amino acid content and organoleptic characteristics of the product. Pszczelnicze Zeszyty Naukowe. 43 (1), 235-245 (1999).
- Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS One. 8 (10), 77550 (2013).
- Garbuzov, M., Couvillon, M. J., Schürch, R., Ratnieks, F. L. Honey bee dance decoding and pollen-load analysis show limited foraging on spring-flowering oilseed rape, a potential source of neonicotinoid contamination. Agriculture, Ecosystems & Environment. 203, 62-68 (2015).
- Moeller, F. E. Managing colonies for pollen production. Proceedings of 26th International Agricultural Congress. , Adelaide, SA. 232-239 (1977).
- Dustmann, J. H., Ohe, W. V. D. Einfluss von Kälteeinbrüchen auf die Frühjahresentwicklung von Bienenvölkern (Apis mellifera L). Apidologie. 19 (3), 245-254 (1988).
- Schmickl, T., Crailsheim, K. J. Cannibalism and early capping: strategy of honeybee colonies in times of experimental pollen shortages. Journal of Comparative Physiology A. 187 (7), 541-547 (2001).
- Hodges, D. The pollen loads of the honeybee: a guide to their identification by colour and form. , London Hill House. Chalfont St Peter, UK. (1974).
- Jones, G. D. Pollen extraction from insects. Palynology. 36 (1), 86-109 (2012).
- Ansell, Chemical resistance guide. Permeation and degradation data. 8th Ed. , Available from: https://ehs.unc.edu/files/2015/09/Ansell_8thEditionChemicalResistanceGuide.pdf (2020).
